活血化瘀中药有效成分抗风湿作用的昼夜节律研究（可编辑）

活血化瘀中药有效成分抗风湿作用的昼夜节律研究（可编辑） 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。本学位 论文研究所获的研究成果、其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大 学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要 相关的论文,第一署名单位为河北 的专利等知识产权均归河北医科大 研究生签名:张英杰 导师 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中 特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果, 指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签名:张英杰 导师签章: 年月日录 目 中文摘要”英文摘要研究论文 活血化瘀中药有效成分抗风湿作 用的昼夜节律研究“““”?一““”“”””??“”??”””” 前言”..”” 日舌 材料与?”??”? 结果 附图 附表? 讨论? 结论 参考文献 综述类风湿关节炎昼夜节律及部分机制的研究进展 致谢 个人简历??中文摘要 活血化瘀中药有效成分抗风湿作用的昼夜节律研究 摘 要 目的: ,是一种病因不明的自身免疫性 类风湿关节炎 疾病,呈慢性、渐进性,主要累及滑膜组织,亦可侵袭肺、分泌腺、 心血 管等关节外脏器组织,导致病人的生活质量下降。研究发现:肿瘤 坏死因 子、白细胞介素.、巨噬细胞移动抑制因子和其它多种因子形成的细胞因 子网络结构参与了疾病过程的慢性化,并可能成为疾病治疗的新靶 点。近年来,国内外学者从对临床表现、发病机制及临床治疗的时间 生物学角度进行了大量研究,证实了时间生物疗法对具有较好的临床 疗效。本课题拟通过:?建立小鼠疼痛模型,来探讨痛阈的昼夜节律性, 采用正交设计,分别于痛阈峰值、谷值灌胃给药观察中药有效成分的 镇痛作用;?用%角叉菜胶致炎小鼠,建立急性关节炎模型,筛选其致 炎达峰时间及足爪容积的昼夜节律性;?建立大鼠佐剂性关节炎 . ,模型,采用酶联免疫吸附法检测血 仅,师.、 白介素 浆中肿瘤坏死因子. 一,、巨噬细胞移动抑制因子 和褪黑素,的昼夜节律性,并测定其 含量,同时观察中药有效成分配伍对实验性关节炎炎症评分的影 响,为临 床治疗合理选择用药时间提供实验依据。 方法: 小鼠痛阈昼夜节律性的研究 .热板法 选择体重.昆明小鼠只,均为雌鼠,室温.度。放于恒 温:.度.水浴热板上,分别于、、、、、时共六个时间 点测量小鼠出现舔后足所需的时间,作为该鼠的痛阈值。 .辐射热刺激法甩尾法 选择体重昆明小鼠只,雌雄各半,室温.度。将小鼠 装入笼中,鼠尾置于鼠尾光照测痛仪上,光束直射于鼠尾/处距尾 尖中文摘要 约,用笔涂黑点作标记,以便每次光照点在同一位置,分别于、 、、、、时共六个时间点测量小鼠甩尾所需的时间,作为该鼠 的痛阈值。 采用正交设计于痛阈峰、谷值给药 选择体重.昆明小鼠只,均为雌鼠,采用正交设计方案因 素水平将中药三七总皂苷丹参酮 灯盏花素芎嗪注: 个水平分为组,另设对照组: 四个因素/、/ 布洛芬组和吗啡组,每组只。采用热板法测量给药前痛阈值,分别 于下 午时、凌晨时给药,测量给药后、、小时小鼠的痛阈值变化。 %角叉菜胶急性关节炎模型的建立 . %角叉菜胶致炎高峰时间筛选 选择体重.昆明小鼠只,雌雄各半。测量右后足爪容积后, 于右后足跖底部常规消毒,皮内注射%角叉菜胶/只建立急性关节 炎模型。分别测量.、.、.、.小时足爪容积,观察角叉菜胶致炎 高峰时间。 . %角叉菜胶致炎小鼠右后足爪容积昼夜节律性研究 选择体重 昆明小鼠只,均为雌鼠。随机分为上午时、下 午时、晚时、凌晨时共组,每组 只。分别于凌晨点半、 上午点半、下午点半、晚点半将实验小鼠右后足跖底部常规消 毒,皮内注射%角叉菜胶/只建立急性关节炎模型,分别于.小时 后角叉菜胶致炎达峰时间测量右后足爪容积,观察小鼠足爪容积 的昼夜 节律性。 模型的建立及炎性细胞因子的昼夜节律性 选择体重.的大鼠,雌雄各半。测量体重及双侧足爪 容积后,于右后足跖底部常规消毒,皮内注射完全弗氏佐剂./只 建 立大鼠模型。其中只大鼠用相同方法注入等量生理盐水。造模后第 天将出现二次反应且关节炎指数 ,大于的大鼠随机 取出只雌雄各半分别于、、、、、共六个时间点于尾静 脉采血、分离血浆,采用酶联免疫吸附法检测血浆中.【、 .、、的昼夜节律性。其余成模大鼠随机分为模型组、来氟 米特上午点组、来氟米特晚点组、雷公藤多苷上午中文摘要 点组、雷公藤多苷晚 点组、中药联合三七总皂苷丹参酮 灯盏花素芎嗪上午点组、中药联合三七总皂苷丹参酮灯盏花 素川芎嗪晚点组,每组只,注射生理盐水大鼠为空白对照组。当 日测量大鼠体重,用足趾容积测量仪测量各组大鼠足爪容积。各治疗组连 续灌胃给药天空白组和模型组灌胃给予等量生理盐水,于给药结束 后第天测量各组大鼠体重、足爪容积、关节炎指数。然后%水合氯 醛麻醉,股动脉采血、抗凝,留取血浆,采用法检测血浆中.【、 .、、含量。 所有数据均采用 .软件包进行统计学处理。计 量资料正态分布数据用均数标准差表示,各组间两两比较采用单因 素方差分析. ,正交设 或非参数检验 计 采用正交设计资料的方差分析,.认为有统 计学意义。 结果: 小鼠痛阈昼夜节律性见 .热板法 小鼠痛阈分别为:上午时..、中午时.士.、 下午时..、晚时..、晚时...、凌晨 时..;下午时小鼠痛阈值明显高于其它组,有统计学差异 .;凌晨时痛阈值明显低于其它组,有统计学差异俨.。 .辐射热刺激法 小鼠痛阈分别为:上午时..、中午时..、下 午时...、晚时..、晚时..、凌晨时 ..;下午时小鼠痛阈值明显高于其它组,有统计学差异尸.; 晚时痛阈值明显低于其它组,有统计学差异伊.。 正交实验设计观察中药有效成分的镇痛作用见 . 下午时各组小鼠痛阈值分别为:给药前..、中药给药 后小时..、中药给药后小时..、中药给药后小时 . .;布洛芬给药后小时..、布洛芬给药后小时 ..、布洛芬给药后小时..;吗啡给药后小时 ..、吗啡给药后小时..、吗啡给药后小时..:中文摘要 中药组给药前及给药后、、小时无统计学差异伊.:布洛芬组给 药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小时,有统计学差异垆.; 吗啡组给药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小时,有统计学 差 异妒.中药有效成分单独作用时无明显镇痛效果尸.;各中药 有效成分之间无交互作用.;布洛芬组、吗啡组痛阈值明显高于中 药组,有统计学差异尸.:吗啡组痛阈值明显高于布洛芬组,有统 计 学差异俨.。 凌晨时各组小鼠痛阈值分别为:给药前..、中药给药后 小时..、中药给药后小时...、中药给药后小时 . .:布洛芬给药后小时.::.、布洛芬给药后小时 ..、布洛芬给药后小时..;吗啡给药后小时 ..、吗啡给药后小时. ..、吗啡给药后小时..; 中药组给药后、小时痛阈值明显高于给药前,有统计学差异俨.; 给药后小时痛阈值高于给药前,但无统计学差异俨.给药后小 时痛阈值显著高于给药前、给药后、小时,有统计学差异俨.: 布洛芬组给药后小时痛阈值高于给药前及给药后、小时,有统计 学 差异.吗啡组给药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小 时,有统计学差异尸.;中药有效成分单独作用时无明显镇痛效果 .;各中药有效成分之间无交互作用尸.布洛芬组、吗啡组 痛阈值明显高于中药组,有统计学差异俨.;吗啡组痛阈值明显高 于 布洛芬组,有统计学差异伊.。 %角叉菜胶致炎高峰时间见 各组小鼠右后足爪容积分别为:给药前...、给药后. 小时...、给药后.小时...、给药后.小时..、 给药后.小时...,给药前小鼠右后足爪容积明显低于给药后.、 .、.、.小时组,有统计学差异.;给药后.小时小鼠右后 足爪容积明显高于给药前、给药后.、.、.小时组,有统计学差异 .。 %角叉菜胶致炎小鼠右后足爪容积昼夜节律性见 各组小鼠足爪容积值分别为:上午时...、下午时 ..、晚时..、凌晨时..;%角叉菜胶致炎后中文摘要 各组小鼠足爪容积无明显昼夜节律性尸.。 昼夜节律给药对大鼠一般情况的影响见 与模型组相比,、、中药联合组一般情况均有所改善。 造模前大鼠体重酚差异无统计学差异.。 造模后第天,各组大鼠体重分别为:空白组..、模 型组..、中药联合点组..、中药联合点组 .士.、 点组.士.、 点组..、 点组..、 点组..;模型组、组、组、 中药联合组大鼠体重明显低于空白对照组,有统计学差异.;但模 型组、组、组、中药联合组组间体重比较无明显统计学差异 .。 给药天后,各组大鼠体重分别为:空白组..、模型 组..、中药联合点组..、中药联合点组. .、 点组..、 点组..、 点组 ..、 点组..:模型组、组、组、中 药联合组的大鼠体重低于空白对照组,有统计学差异.;中药联合 、点组、点组、点组体重高于模型组,有统计学差异 .:点组、 点组体重高于模型组,但无统计学差异 点组体重低于点组,有统计学差异 .:给药时间比较: .:中药联合点与点组、点与点组均无统计学差异 .。 昼夜节律给药对大鼠关节炎指数的影响见 随着造模时间的延长,除空白对照组外,各组大鼠关节红肿程度 逐渐 加重,关节炎指数逐渐升高。 造模天各组大鼠关节指数分别为:模型组..、中药联合 点组.士.、中药联合点组..、 点组.士.、 点组..、 点组..、 点组.士.;各组间 相比无统计学差异尸.。 灌胃天后,各组大鼠关节炎指数分别为:模型组.士.、中 点组.:.、 药联合点组..、中药联合点组.:.、 点组..、 点组..、 点组..;中 中文摘要 药联合组、组、组关节炎指数均低于模型组,有统计学差异 .;组关节炎指数低于组,有统计学差异尸.; 组关节炎指数低于中药联合组,但无统计学差异尸.;给药时间比 较: 中药联合点与点组、 点与点组、 点与点组均无统 计学差异俨.。 昼夜节律给药对大鼠足爪肿胀抑制率的影响见 灌胃天后造模侧右足抑制率%分别为:模型组...、中 药联合点组.士.、中药联合点组..、 点组 .士.、 点组.士.、 点组.士.、 点组.士.,中药联合组、组、组抑制率高于模型组,有统 点组 计学差异.;模型组足爪容积持续增长,无抑制表现, 点组、中药联合、点组、 、点组,有 抑制率明显高于 点 统计学差异俨.:给药时间比较:中药联合点与点组、 与点组、 点与点组均无统计学差异尸.。 灌胃天后非造模侧左足抑制率%分别为:模型组..士.、 中药联合点组一.士.、中药联合点组.士.、 点组..、 点组..、 点组..、 点组.土.,中药联合组、组、组抑制率高于模型组,但无 统计学差异.;模型组足爪容积持续增长,无抑制表现。给药时间 比较:中药联合点与点组、 点与点组、 点与点组 均无统计学差异.。 大鼠血浆中盯.、.、、的昼夜节律性见 . .仅的昼夜节律性见. 凌晨时.士.、上午时.士.、中午时.士.、 下午时.士.、晚时.士.、晚时..,峰 值为晚.凌晨时之间,谷值为下午时,有统计学差异俨.。 . .的昼夜节律性见. 凌晨时.士.、上午时.士.、中午时.士.、 下午时..、晚时.士.、晚时..,峰 值为凌晨时,谷值为中午时,有统计学差异尸.。 . 的昼夜节律性见. 中文摘要 凌晨时.士.、上午时.士.、中午时.士.、 下午时.士.、晚时.士.、晚时.:.,峰 值为晚时,谷值为下午时,有统计学差异伊.。 . 的昼夜节律性见. 凌晨时.士.、上午时.士.、中午时.士.、 下午时.士.、晚时.士.、晚时.士.,峰 值为晚.凌晨时之间,谷值为下午时,有统计学差异尸.。 昼夜节律给药治疗后大鼠血浆.、.、、的变化见 , .血浆师一/含量比较见. 各组大鼠血浆师.含量/分别为:空白组.士.、模型 组.士.、中药联合点组.士.、中药联合点组.士 .、 点组.士.、 点组.士.、 点组.士 .、 点组.士.;模型组、中药联合组、组、组 血浆.水平明显高于空白对照组,有统计学差异尸.;中药联合 组、组、组明显低于模型组,有统计学差异俨.;中药联合 组、组、组之间.水平无统计学差异.;给药时间比 较:中药联合点与点组、 点与点组、 点与点组均 无统计学差异.。 .血浆? /含量比较见. 各组大鼠血浆. 含量分别为:空白组.士.、模型 组. .、中药联合点组.士.、中药联合点组 .士.、 点组.士.、 、 点组.士. 点 组.士.、 点组.士.:组血浆.水平明显低 于空白对照组,有统计学差异.;中药联合组、组低于空白对 照组,但无统计学差异.;组、组明显低于模型组,有统 计学差异尸.:中药联合组低于模型组,但无统计学差异尸.; 给药时间比较: 点组、中药联合、 点组.水平明显低于 点组、 、点组,有统计学差异尸.;中药联合点组低于 点组, 点组低于 点组,但无统计学差异.。 .血浆‖含量比较见. 中文摘要 各组大鼠血浆含量/分别为:空白组..、模型组 .、 ..、中药联合点组. .、中药联合点组. 点组..、 点组。.、 点组..、 点组..;模型组、中药联合组、组血浆水平明 显高于空白对照组,有统计学差异伊.;组高于空白对照组,但 无统计学差异尸.;中药联合组、组、组明显低于模型组, 有统计学差异伊.;组水平明显低于中药联合组、组, 有统计学差异.:中药联合组、组间无差异性.;给药时 点 间比较:中药联合点与点组、 点与点组、 点与 组均无统计学差异.。 .血浆/含量比较见. 各组大鼠血浆含量/分别为:空白组..、模型 组..、中药联合点组..、中药联合点组. 点组. .、 点组..、 点组..、 .、 点组..;模型组、中药联合组、组血浆 水平明显高于空白对照组,有统计学差异.,组高于空白对照 组,但无统计学差异妒.;中药联合组、组、组明显低于模 型组,有统计学差异尸.:中药联合组、组高于组,有统计 学差异尸.;给药时间比较:中药联合点组低于中药联合点组, 点与点组、 点与点组无统计学 有统计学差异尸.; 差异.。 结论: 小鼠的痛阂具有峰值在下午、谷值在凌晨的昼夜节律;佐剂性关节 炎大鼠外周血.仅、.、、水平呈现峰值位于凌晨、谷值 位于下午的昼夜节律;角叉菜胶所致急性关节炎小鼠的足爪肿胀度未显示 昼夜变化。 活血化瘀中药有效成分三七总皂苷、丹参酮、灯盏花素、川芎 嗪配伍能显著提高小鼠痛阈,凌晨:时给药优于下午:时给药。 来氟米特、雷公藤多苷及活血化瘀中药有效成分配伍组合可明显抑 制大鼠关节炎指数、足爪肿胀率,降低.伐、.、、 水平,并且来氟米特和雷公藤多苷:时给药、活血化瘀中药有效成中文摘要 分配伍组合:时给药作用更为显著。 关键词:佐剂性关节炎;昼夜节律;中药有效成分;雷公藤多苷; 肿瘤坏死因子..仅;白介素..;巨噬细胞移动抑制因子; 褪黑素英文摘要 : .,. , , ,. ., . . ,... .% . 一【一【, ,,. : .英文摘要,:,, , ., . ’ . , , ,,,, .,:, ,, ?, . ,’ ., ,,,, ,:,, ?. , :, , .:,:. % . ,:, ,?. %. , .,:,, . . %. :,:,:,:. , . ,: , , ., 英文摘要 ??????????????????????????????????????????????? 一??.’ .. , . 订. , , ,,,, .【. ? . ,, , , , ,, , , 。 . % , ,, ,. 一伐,一 ,, .? . .. ... :. :: . : 士., .. , : .土.,: ..,: ..,: .., : .; : .. .:: ..,: .士.,: 英文摘要 ..,: ..,: ..,: .士., : .; : . .. : . :,. , .士., ..; .., ..士士., ., .士.; .士., .士., ..; .; .;.; 俨.; 尸.;.; ..:. :,..,., .士.; .土., .士., .士.,.士.;..士., 士.,.士.; 英文摘要 尸.; , .; .;, .; 尸。;.; .; 尸.;妒.. % .士.,.:.士.,. .士.,. . 士.,. .., . . ..妒.;. . . ...% .士.,: :: .土.,: .士.; .士.,:.. ? , .伊.. 英文摘要 : .士.,, .士., ..,.., .:., .士., .., .土., , , ,.;,, , .. :,. .士., .士.,., .士., .士.,. .士., .士., 土., , , ,.;, ,.; , .;: .; 尸.. , . : , .土.,?.士., .士., .土., .., .:., .士., .. : , .士., .., .士., .士., .士., 英文摘要 .., .., ,,.; .;: .;,.. , . . 士., : , 一. ..士., .,.士.. 士. .., , . , , .; . , , , .: .. : , ?.士., ..士., . 土., .士., . 士., .士., .士., , , , : .; . , ’ , ,, .. .口,一 ,,. ?. .士 .圭.,: : .士.,: .士.,: ,荚文摘要 :? . .. .,: ,: .,: :, 尸.. . . . : ..,: ..,: .士.,: : .., .,: ..,: :, .。 . ? . : ..,: ..,: ..,: ..: . ,: .士.,: , :,.. . . . : .士.,: ..,: .士.,: :? .,: .士.,: .士., ::, .. 一仅,一,, , . 师一/. . .士., 士., . .士., ., .., .., 一仪 .., .., , , , 盯一 尸.;,,, .; .; : , , , , 伊.. . 一 /.. .士., .,英文摘要. .士.,.土. . ., 士., , .士. 一, .士., 尸.; , .; .; .; :, , , ,? 妒.;,伊.. . /. .土..士., , . .士.,.士., .士., ., . 士., .士., , 尸.;垆.;, .; .; : 妒.; , , ,,.. ./. .士., .士., . .士., 英文摘要 一 一?????????????????????????????????????????????????????? 一.., .士., .,. . 土., 士., , .;俨.;, . .;.;:.; , , 俨.. : , , 师一【,一 ., . , .? ,,,,::. , 吓【,一 ,, . :,:.: ; ;; ; ?; 一 ; ;研究论文 活血化瘀中药有效成分抗风湿作用的昼夜节律研究 ?上?一 莉 菁 类风湿性关节炎 ,滑膜炎症和增生、产生自 身抗体、软骨和骨破坏、系统损害为临床特征。目前以传统和生 物 控制病情抗风湿药、糖皮质激素等药物治疗为主,但持续缓解 率很低,需要长期持续用药【。因此,在继续研究发病机制的同时, 积极探索新的治疗方法和策略具有重要意义。 属中医学“痹症”范畴,一般认为“血瘀”为的基本病机之 一【,活血化瘀药为治疗的基本疗法】。研究证实,活血化瘀中药有 效成分治疗具有一定疗效【】。但有效成分配伍的增效/减毒作用有待进 一步探讨。 研究发现,包括人类在内的多种生物体具有昼夜节律??调节每天新 陈代谢、生理和行为改变的内部生物钟【】。它们被位于脑部视交叉上核的 中枢昼夜节律钟所控制。近年来,从生物钟角度对临床表现、病理生 理学、药理学和临床治疗的研究证实,昼夜节律在的发生、发展过程 中发挥重要作用,从而对传统的诊断和治疗模式带来新的挑战。特别 是最近国外有关糖皮质激素和】针对的时间治疗学探 索,显示出该疗法良好的临床疗效与安全性,为的临床治疗提供了新 的有效途径。目前,应加强国内相关基础及临床基础研究工作,为进一步 探索我国患者时间治疗方案奠定基础。 本课题拟通过建立小鼠疼痛模型,来探讨痛阈的昼夜节律性,建立大 鼠佐剂性关节炎模型,检测血浆中炎性细胞因子的昼夜节律性,并观察中 药有效成分配伍对实验性关节炎炎症评分的影响,为临床治疗合理选 择用药时间提供实验依据。 材料与方法 材料 .实验动物研究论文 昆明小鼠 只,雌只,雄只,清洁级,体重 .,购自 河北医科大学实验动物中心,实验动物质量合格证号:,实验动 物使用许可证号冀..;购入本实验室的动物固定光照时 间早时.晚时白天,晚时.次日早时夜间,喂食饲料天,然 后进行镇痛及角叉菜胶急性关节炎模型实验。 大鼠只,雌雄各半,清洁级,体重.,购自河北医 科大学实验动物中心,实验动物质量合格证号:,实验动物使用许 可证号冀..购入本实验室的动物固定光照时间早时. 晚 时白天,晚时.次日早时夜间,喂食饲料天,然后进行慢 性佐剂性关节炎造模实验。 .药品 无水羊毛脂 天津市大茂化学试剂厂 液体石蜡 天津市永大化学试剂有限公司 卡介苗 石家庄华瑞创新生物科技开发中心 三七总皂苷 南京泽朗医药科技有限公司 丹参酮 南京泽朗医药科技有限公司 灯盏花素 南京泽朗医药科技有限公司 川芎嗪 南京泽朗医药科技有限公司 布洛芬 湖北百科格莱生物科技有限公司 吗啡 上海科兴生物有限公司 角叉菜胶 南京泽朗医药科技有限公司 来氟米特片 福建汇天生物药业有限公司 雷公藤多苷 鲁南制造股份有限公司 .试剂 大鼠血清、.【、.、 上海蓝基生物科技有限公司批号 试剂盒大鼠血清、.、.、 上海蓝基生物科技有限公司批号 试剂盒 %水合氯醛 河北医科大学第二医院 %盐酸利多卡因注射液 上海复兴朝晖药业 肝素钠 济南益延研究论文 液:即磷酸盐缓冲液,将 ., ., 加至蒸馏水中,即为. ...的液。 .仪器 不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 博讯实业有限公司.. 超级恒温水浴 上海浦东科学仪器有限公司 分析天平 上海天平仪器厂 药物电子天平 上海民桥有限公司? 荣事达冰箱 中国荣事达集团 超低温冰箱 日本三洋. 台式离心机 上海安亭科学仪器厂. 酶标仪 小鼠固定筒架 济南益延有限公司. 大鼠固定简架 济南益延有限公司. 足趾容积测量仪 济南益廷有限公司. 鼠尾光照测痛仪 济南益延有限公司. .加样器 上海医用激光仪器厂 电子称重计 上海民桥精密科学仪器有限公司 微量进样器 上海安亭微量进样器厂 小鼠镇痛实验及角叉菜胶急性关节炎模型的建立方法 .热板法测量小鼠痛阈值 选择体重.昆明小鼠只,均为雌鼠,室温一度。调节恒 温水浴,先将水浴槽加满水,使水面接触热板,调节恒温装置使水 温控制 在.度,热板上放置大烧杯,需预热分钟。将小鼠放于烧杯中, 分别于、、、、、时共六个时间点测量小鼠出现舔后足所需 的时间,作为该鼠的痛阈值。凡舔后足时间小于秒或大于秒或跳跃 者均弃之不用。 .辐射热刺激法甩尾法测量小鼠痛阈值 小鼠固定筒架盛装:将筒的后盖取下,随后将前端滑动塞取下,将空 管放平提小鼠尾部让其自行从筒后端钻入,装上前端滑动塞,然后将鼠尾 从后堵盖的下口中穿出,旋上后盖,调整前端滑塞给小鼠以较舒适的空间, 然后紧固。研究论文 选择体重.昆明小鼠只,雌雄各半,室温?度。将小鼠 装入笼中,鼠尾置于鼠尾光照测痛仪上,光束直射于鼠尾/处距尾尖 约,用笔涂黑点作标记,以便每次光照点在同一位置,分别于、 、、、、时共六个时间点测量小鼠甩尾所需的时间,作为该鼠 的痛阈值。 .采用正交设计方案给药实验 选择体重 .昆明小鼠只,均为雌鼠,室温.度。采用正 灯盏花素 交设计方案因素水平将中药三七总皂苷丹参酮 个水平分为 芎嗪注:四个因素/、/ 组,另设对照组:布洛芬组/和吗啡组/肌注,每组只。 采用热板法测量给药前痛阈值,分别于下午时、凌晨时给药,测量 给药后、、小时小鼠的痛阈值变化。 . %角叉菜胶致炎高峰时间筛选 选择体重 .昆明小鼠只,雌雄各半,室温.度。抓取一 只小鼠放于固定筒架中方法同上,采用足爪容积仪测量右后足爪 容积, 于右后足跖底部常规消毒,皮内注射%角叉菜胶/只’建立急性关 节 炎模型。分别测量.、.、.、.小时足爪容积,观察角叉菜胶致炎 高峰时间。 . %角叉菜胶致炎小鼠右后足爪容积昼夜节律性研究 选择体重.昆明小鼠只,均为雌鼠,室温.度。随机分 为上午时、下午时、晚时、凌晨时共组,每组只。分别 于凌晨点半、上午点半、下午点半、晚点半将实验小鼠右后 足跖底部常规消毒,皮内注射%角叉菜胶/只建立急性关节炎模 型, 分别于.小时后测量右后足爪容积,观察小鼠足爪容积的昼夜节 律性。 大鼠模型的建立方法【 将无水羊毛脂加热溶化后取份置于研钵中,稍冷却,边研磨边加 入液体石蜡份。研磨.后,?水浴共热,充分混匀,高压 灭菌度,./,制成不完全弗氏佐齐,。冰箱过夜。 将卡介苗于?恒温水浴中灭活,后放入无菌研钵中充分研 磨,于按/比例混合,充分乳化小时入水为不散油 滴,制成完全弗氏佐剂,至。冰箱保存备用。研究论文 测量大鼠双侧足爪容积后,于右后足跖底部常规皮肤消毒,用微 量 注射器皮内注射预先备好的完全弗氏佐剂./只,另取只大 鼠,于同部位皮内注射等量生理盐水。 .分组 造模后第天将出现二次反应且关节炎指数 ,大于 的大鼠随机取出只雌雄各半分别于、、、、、共六个 时间点于尾静脉采血、分离血浆,采用酶联免疫吸附法检测血浆 中.【、.、、的昼夜节律性。其余成模大鼠随机分为模 型组、来氟米特上午点组、来氟米特晚点组、雷公藤多 苷上午点组、雷公藤多苷晚点组、中药联合三七总皂苷 丹参酮灯盏花素川芎嗪上午点组、中药联合三七总皂苷丹参酮 灯盏花素川芎嗪晚点组,每组只,注射生理盐水大鼠为空白对 照组。 .大鼠一般状态、关节肿胀的评定 仔细观察造模前后、灌胃前后各组大鼠体毛色泽、精神、活动状态、 食量增减及关节红肿、皮温等变化。分别于造模前、造模后第天、造模 成功后、灌胃完毕后用足趾容积测量仪测量大鼠双侧后足的容积札、体 重。 固定架盛装大鼠:将固定架的滑动筒塞取下,将空筒放平让大鼠自行 从筒后端钻入,随后将滑动筒塞从前端塞上稍加固定,再把大鼠的两后腿 分别从出腿道槽中拉出,旋转腰臀压板调整螺丝,使腰臀压板压住臀臂部 使其后腿无法抽出,随后调动滑动筒塞和腰臀压板位置使其大鼠处在一个 较舒适又起到固定作用的状态。 采用足趾容积仪测量大鼠足爪容积:将大鼠盛装在固定架中,用记号 笔于大鼠踝关节处作一标记,右手的无名指和小指于大鼠两腿中间托住其 臀部,食指和中指将待测足爪的膝关节伸直,将大鼠后肢浸入水 中使踝关 节标记与液面重叠,踏动脚踏开关,读数,即为足爪容积,比较足 爪肿胀 变化。 整个实验过程均由同一个人操作,最大限度地减少人为误差。 肿胀率%测量当日足爪容积一造模前足爪容积/量当日足爪容 积×%研究论文 各组抑制率%给药前平均肿胀率一给药后平均肿胀率/给药前平 均肿胀率×% 关节指数评分:于造模成功后、灌胃完毕后观察并记录大鼠全身 的关节病变程度。按级评分法评价【】分无红肿:分有红色斑点 或轻 度肿胀;分关节部位中度肿胀;分严重肿胀;分关节变形,不能负 重’。四肢关节评分之和。 .给药剂量与方式 造模后第天分组、测量体重并测量双侧足爪容积后,开始灌胃给 药。组/.,组/.,中药联合组三七总皂苷 /.丹参酮/.灯盏花素/.川芎嗪 /.灌胃,模型组及空白对照组分别给予等量生理盐水,灌胃共 天。各组给药方法及时间均相同。 .大鼠尾静脉采血 将大鼠固定于筒架内,鼠尾暴露于笼外。将鼠尾部用橡皮筋捆扎,置 于度热水中.秒,尾静脉充盈肿胀后,酒精棉球消毒鼠尾中/穿 刺部位,将号头皮针与注射器连接,用%肝素钠润管。右手持针, 左手拇指在上,食指在下,捏住鼠尾略弯曲与针头方向平行,刺破皮肤后 继续进针,取血,结束后棉球按压穿刺部位约分钟止血。 .大鼠股动脉采血 将大鼠用%水合氯醛腹腔注射./,麻醉,仰卧位固定, 根据股动脉搏动情况确定股动脉的位置和走行方向,沿股动脉方向纵向切 开皮肤,用血管钳钝性分离肌肉,暴露股动脉鞘。股动脉鞘中由内到外依 次是:股静脉、股动脉、股神经,直径由粗到细,其中粉红色且触之有搏 动的即为股动脉,用玻璃分针沿血管走行钝性分离股动脉鞘,完全游离股 动脉约,注意保护股神经,并避免损伤股动脉的细小穿支。以% 的利多卡因浸泡股动脉左右,以缓解血管痉挛,扩张动脉管径。用无 菌棉球蘸尽利多卡因,将硬膜剥离子垫于股动脉下使其固定,将注 射器以%肝素钠润管后,左手固定硬膜剥离子,右手持针斜面向上, 针 尖与股动脉成角约度,沿股动脉走行方向向近心端穿刺,取血,结 束 后棉球按压穿刺部位.分钟止血。 . 法检测大鼠血浆中.伐、.、、的昼夜节律性均研究论文 采用法测定,标本严格按试剂盒要求的操作步骤操作 ..大鼠血浆中.【、的测定 取出试剂盒,于室温.放置分钟。 取出酶标板,按照标准品的次序分别加入皿的标准品溶液于空 白微孔中。 空白微孔中加入此的样品,空白对照.的蒸馏水。 在各孔中加入此的酶标记溶液不含空白对照孔。 将酶标板用封口胶密封后,?孵育反应小时在孵育箱中保持 稳定的温度与湿度。 充分清洗酶标板次,保持各孔有充足的水压浓缩洗涤液以: 的比例与蒸馏水稀释。 酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。 各::入显色剂 止。 各入显色剂 此。 .?下避光反应.分钟。 各孔加入此终止液,终止反应。 ..大鼠血浆中. 、的测定 取出试剂盒,于室温.放置分钟。 取出酶标板,按照标准品的次序分别加入此的标准品溶液于 空白微孔中。 空白微孔中加入此的样品,空白对照加入的蒸馏水。 在各孔中加入此的酶标记溶液不含空白对照孔。 将酶标板用封口胶密封后,。孵育反应时在孵育箱中保持 稳定的温度与湿度。 充分清洗酶标板次,保持各孔有充足的水压浓缩洗涤液以: 的比例与蒸馏水稀释。 酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。 各孔加入显色剂 此。 各孔加入显色剂 此。 .?下避光反应.分钟。研究论文 各孔加入此终止液,终止反应。 ..结果计算与判断 以值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据样 品的值可在标准曲线上查出其浓度。本实验由酶标仪编程直接得 出浓 度值。 .灌胃完毕后各组大鼠血清.、.、、的变化 ..灌胃完毕后各组大鼠血清.、的测定 取出试剂盒,于室温.?放置分钟。 取出酶标板,按照标准品的次序分别加入此的标准品溶液于 空白微孔中。 空白微孔中加入此的样品,空白对照加入的蒸馏水。 在各孔中加入此的酶标记溶液不含空白对照孔。 将酶标板用封口胶密封后,?孵育反应小时在孵育箱中保持 稳定的温度与湿度。 充分清洗酶标板次,保持各孔有充足的水压浓缩洗涤液以: 的比例与蒸馏水稀释。 酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。 各孔加入显色剂 。 各孔加入显色剂 此。 .?下避光反应一分钟。 各孔加入此终止液,终止反应。 ..灌胃完毕后各组大鼠血清、.的测定 取出试剂盒,于室温.放置分钟。 取出酶标板,按照标准品的次序分别加入此的标准品溶液于空 白微孔中。 空白微孔中加入的样品,空白对照加入的蒸馏水。 在各孔中加入江的酶标记溶液不含空白对照孔。 将酶标板用封口胶密封后,。孵育反应小时在孵育箱中保持 稳定的温度与湿度.。 充分清洗酶标板次,保持各孔有充足的水压浓缩洗涤液以研究论 文 的比例与蒸馏水稀释。 酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。 各孔加入显色剂 此。 各孔加入显色剂 此。 .?下避光反应.分钟。 各孔加入儿终止液,终止反应。 统计分析所有数据均采用 .软件包进行统计学处理。计 量资料正态分布数据用均数标准差蕊表示,各组间两两比较采用 单因 素方差分析. 或非参数检验 ,. 采用正交设计资料的 认为有统计学意义。正交设计 方差分析,.认为有统计学意义。研究论文 结 果 小鼠痛阈昼夜节律性见 .热板法 小鼠痛阈分别为:上午时.士.、中午时.士.、 下午时.士.、晚时..、晚时..、凌晨 时..;下午时小鼠痛阈值明显高于其它组,有统计学差异 .;凌晨时痛阈值明显低于其它组,有统计学差异妒.。 .辐射热刺激法 小鼠痛阈分别为:上午时..、中午时..、下 午时.士.、晚时..、晚时..、凌晨时 ..;下午时小鼠痛阈值明显高于其它组,有统计学差异妒.; 晚时痛阈值明显低于其它组,有统计学差异俨.。 正交实验设计观察中药有效成分的镇痛作用见 . 下午时各组小鼠痛阈值分别为:给药前..、中药给药 后小时.士.、中药给药后小时.士.、中药给药后小时 ..;布洛芬给药后小时.士.、布洛芬给药后小时 ..、布洛芬给药后小时..;吗啡给药后小时 ..、吗啡给药后小时..、吗啡给药后小时..; 中药组给药前及给药后、、小时无统计学差异尸.;布洛芬组给 药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小时,有统计学差异俨.; 吗啡组给药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小时,有统计学 差 异.;中药有效成分单独作用时无明显镇痛效果尸.;各中药 有效成分之间无交互作用.;布洛芬组、吗啡组痛阈值明显高于中 药组,有统计学差异.;吗啡组痛阈值明显高于布洛芬组,有统计 学差异尸.。 凌晨时各组小鼠痛阈值分别为:给药前..、中药给药后 小时..、中药给药后小时.士.、中药给药后小时 ..:布洛芬给药后小时..、布洛芬给药后小时 .士.、布洛芬给药后小时.士.;吗啡给药后小时 ..、吗啡给药后小时. .、吗啡给药后小时.土.;研究论文 中药组给药后、小时痛阈值明显高于给药前,有统计学差异尸.; 给药后小时痛阈值高于给药前,但无统计学差异俨.;给药后小 时痛阈值显著高于给药前、给药后、小时,有统计学差异.; 布洛芬组给药后小时痛阈值高于给药前及给药后、小时,有统计 学 差异尸.;吗啡组给药后、小时痛阈值高于给药前及给药后小 时,有统计学差异俨.;中药有效成分单独作用时无明显镇痛效果 .;各中药有效成分之间无交互作用俨.;布洛芬组、吗啡组 痛阈值明显高于中药组,有统计学差异尸.;吗啡组痛阈值明显高 于 布洛芬组,有统计学差异尸.。 %角叉菜胶致炎高峰时间见 各组小鼠右后足爪容积分别为:给药前..、给药后. .、 小时..、给药后.小时..、给药后.小时. 给药后.小时.:.,给药前小鼠右后足爪容积明显低于给药后.、 .、.、.小时组,有统计学差异尸.;给药后.小时小鼠右后 足爪容积明显高于给药前、给药后.、.、.小时组,有统计学差异 俨.。 %角又菜胶致炎小鼠右后足爪容积昼夜节律性见 各组小鼠足爪容积值分别为:上午时..、下午时 .士.、晚时..、凌晨时..;%角叉菜胶致炎后 各组小鼠足爪容积无明显昼夜节律性.。 昼夜节律给药对大鼠一般情况的影响见 与模型组相比,、、中药联合组一般情况均有所改善。 造模前大鼠体重曲差异无统计学差异.。 造模后第天,各组大鼠体重分别为:空白组.土:.、模 型组..、中药联合点组.:.、中药联合点组 .士.、 点组.士.、 点组..、 点组..、 点组..;模型组、组、组、 中药联合组大鼠体重明显低于空白对照组,有统计学差异妒。; 但模 型组、组、组、中药联合组组间体重比较无明显统计学差异 .。 给药天后,各组大鼠体重分别为:空白组..、模型研究论文 组.士.、中药联合点组..、中药联合点组. .、 .、 点组..、 点组. 点组 ..、 点组..;模型组、组、组、中 药联合组的大鼠体重低于空白对照组,有统计学差异尸.;中药联 合 、点组、点组、点组体重高于模型组,有统计学差异 点组体重高于模型组,但无统计学差异 .;点组、 点组体重低于点组,有统计学差异 .;给药时间比较: .;中药联合点与点组、点与点组均无统计学差异 .。 昼夜节律给药对大鼠关节炎指数的影响见 随着造模时间的延长,除空白对照组外,各组大鼠关节红肿程度 逐渐 加重,关节炎指数逐渐升高。 造模天各组大鼠关节指数分别为:模型组..、中药联合 点组..、中药联合点组.士.、 点组..、 点组.士.、 点组.土.、 点组.土.;各组间 相比无统计学差异尸.。 灌胃天后,各组大鼠关节炎指数分别为:模型组.士.、中 药联合点组..、中药联合点组.:.、 点组..、 点组..、 点组..、 点组.士.;中 药联合组、组、组关节炎指数均低于模型组,有统计学差异 .;组关节炎指数低于组,有统计学差异尸.; 组关节炎指数低于中药联合组,但无统计学差异俨.;给药时间比 较: 中药联合点与点组、 点与点组、 点与点组均无统 计学差异俨.。 昼夜节律给药对大鼠足爪肿胀抑制率的影响见 灌胃天后造模侧右足抑制率%分别为:模型组...、中 药联合点组.士.、中药联合点组.士.、 点组 .士.、 点组.士.、 点组..、 点组.士.,中药联合组、组、组抑制率高于模型组,有统 点组 计学差异.;模型组足爪容积持续增长,无抑制表现, 抑制率明显高于 点组、中药联合、点组、 、点组,有研究论文 点 统计学差异尸.;给药时间比较:中药联合点与点组、 与点组、 点与点组均无统计学差异尸.。 灌胃天后非造模侧左足抑制率%分别为:模型组...、 中药联合点组...、中药联合点组..、 点组 ..、 点组..、 点组..、 点组..,中药联合组、组、组抑制率高于模型组,但无 统计学差异尸.模型组足爪容积持续增长,无抑制表现。给药时间 比较:中药联合点与点组、 点与点组、 点与点组 均无统计学差异.。 大鼠血浆中.、.、、的昼夜节律性见 . .【的昼夜节律性见. 凌晨时.:.、上午时..、中午时..、 下午时..、晚时..、晚时..,峰 值为晚.凌晨时之间,谷值为下午时,有统计学差异尸.。 . ?的昼夜节律性见. 凌晨时..、上午时..、中午时.。、 下午 时..、晚时..、晚时..,峰 值为凌晨时,谷值为中午时,有统计学差异俨.。 . 的昼夜节律性见. 凌晨时..、上午时..、中午时..、 下午时..、晚时..、晚时..,峰 值为晚时,谷值为下午时,有统计学差异?.。 . 的昼夜节律性见. .、中午时..、 凌晨时. .、上午时. 下午时..、晚时..、晚时..,峰 值为晚.凌晨时之间,谷值为下午时,有统计学差异俨.。 昼夜节律给药治疗后大鼠血浆.、.、、的变化见 , .血浆./含量比较见. 各组大鼠血浆.【含量/分别为:空白组..、模型 组..、中药联合点组..、中药联合点组.:研究论文 点组. 点组..、 .、 点组.士.、 .、 点组..;模型组、中药联合组、组、组 血浆师.仅水平明显高于空白对照组,有统计学差异俨.;中药联 合 组、组、组明显低于模型组,有统计学差异妒.;中药联合 组、组、组之间盯.水平无统计学差异尸.;给药时间比 点与点组均 点与点组、 较:中药联合点与点组、 无统计学差异尸.。 .血浆?/含量比较见. 各组大鼠血浆.含量/分别为:空白组..、模型 组. .、中药联合点组.士。、中药联合点组 ..、 点组..、 点组..、 点 组..、 点组..;组血浆.水平明显低 于空白对照组,有统计学差异俨.;中药联合组、组低于空白对 照组,但无统计学差异.;组、组明显低于模型组,有统 计学差异俨.;中药联合组低于模型组,但无统计学差异俨.; 给药时间比较: 点组、中药联合、 点组.水平明显低于 点组、 、点组,有统计学差异尸.;中药联合点组低于 点组, 点组低于 点组,但无统计学差异俨.。 .血浆/含量比较见. 各组大鼠血浆含量/分别为:空白组..、模型组 。。、中药联合点组..、中药联合点组.,、 点组..、 点组..、 点组..、 点组..;模型组、中药联合组、组血浆水平明 显高于空白对照组,有统计学差异尸.;组高于空白对照组,但 无统计学差异俨.;中药联合组、组、组明显低于模型组, 有统计学差异伊.;组水平明显低于中药联合组、组, 有统计学差异俨.;中药联合组、组间无差异性.:给药时 间比较:中药联合点与点组、 点与点组、 点与点 组均无统计学差异尸.。 .血浆/含量比较见. 各组大鼠血浆含量:/分别为:空白组..、模型 研究论文 组..、中药联合点组.士.、中药联合点组. .、 点组..、 点组..、 点组. .、 点组..:模型组、中药联合组、组血浆 水平明显高于空白对照组,有统计学差异.,组高于空白对照 组,但无统计学差异俨.;中药联合组、组、组明显低于模 型组,有统计学差异俨.;中药联合组、组高于组,有统计 学差异.;给药时间比较:中药联合点组低于中药联合点组, 点与点组无统计学 点与点组、 有统计学差异尸.; 差异伊.。研究论文 附 图 . % . . ‘“ 研究论文. 豇 . . 研究论文 . .