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SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究

2017-12-08 26页 doc 114KB 15阅读

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SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究 SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究 1 前言 目前的生物除磷脱氮工艺流程大致分为两大类:1)空间顺序;2)时间顺序。其中时间顺序的生物除磷脱氮技术的最大特征是:污水的各种生化反应均在同一个反应池里,按时间顺序进行污水处理。其典型代表是序批式间歇活性污泥法SBR(sequencing batch reactor),在当前污水处理领域中被广泛运用。 目前国内外开展了反硝化聚磷的研究,发现了一种兼性厌氧反硝化除磷细菌(denitrify...
SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究
SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究 SBR体系中一株高效的短程反硝化聚磷菌的鉴定及脱氮聚磷效能研究 1 前言 目前的生物除磷脱氮工艺大致分为两大类:1)空间顺序;2)时间顺序。其中时间顺序的生物除磷脱氮技术的最大特征是:污水的各种生化反应均在同一个反应池里,按时间顺序进行污水处理。其典型代表是序批式间歇活性污泥法SBR(sequencing batch reactor),在当前污水处理领域中被广泛运用。 目前国内外开展了反硝化聚磷的研究,发现了一种兼性厌氧反硝化除磷细菌(denitrifying phosphorus removing bacteria,简称DPB), (我们的研究的重点在于对目前现有厌氧释磷/好氧聚磷,以及利用硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌的进一步改进,而完全没有涉及脱氮和除磷工艺,所以要参考他人的资料,但是一定要转化为自己的东西) 如:可以从磷和氮的去除途径来展开 目前国内外对于利用硝酸盐作为电子受体的反硝化聚磷过程研究较深入,理论相对成熟,而且国内已经申请了10项关于与反硝化聚磷有关的专利[见查新和参考文献1-4]。其反应途径为: 亚硝化菌硝化功菌反硝化聚磷菌反硝化聚磷菌NH,N,,,,,NO,N,,,,,NO,N,,,,,,NO,N,,,,,,N,[O]42322 反硝化聚磷蓖,[O]3, PO,P,,,,,,,吸收至反硝化聚磷菌体内,形成污泥排出4 若通过控制溶解氧、反应温度、pH值等条件可以将硝化阶段控制在亚硝化菌,然后以亚硝酸盐为电子受体的完成反硝化聚磷过程,,实现短程硝化反硝化聚磷工艺,此过程的反应途径为: 亚硝化菌反硝化聚磷菌 NH,N,,,,,NO,N,,,,,,N,[O]422 反硝化聚磷蓖,[O]3, PO,P,,,,,,,吸收至反硝化聚磷菌体内,形成污泥排出4 此装置与利用硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷装置相比较,具有低耗、节能、高效等优点。 (前言包括如下几部分:研究的原理、科学意义、国内外的研究现状、本人的创新之处、本人开展的主要研究) 2 实验材料与方法 2.1 材料 1 2.1.1 菌株的来源 试验用活性污泥取自某污水处理厂生物反应池厌氧段中段的污泥(MLSS为3500mg/LSV为25.6,)。实验分为3个阶段对可以利用亚硝酸盐的反硝化聚磷菌在室温(25,26?)进行选择和富集。 第一阶段以厌氧/好氧方式启动运行(污泥浓度为3500,4000 mg/L,泥龄控制在8天左右,好氧ORP控制在80-100mV,厌氧ORP控制在-150,-220mV),每天运行4周期,每个周期6小时(包括厌氧3小时、好氧2小时、其它约1小时),共运行20周期。目的是使系统中的活性污泥中在此条件下具有高效的好氧除磷效果污泥。 第二阶段采用厌氧/缺氧方式运行,每天运行3周期,每个周期8小时(包括厌氧3小时、缺氧4小时、洗泥及其它约1小时,缺氧ORP控制在-100,-150mV,厌氧ORP控制在-150,-220mV),共运行103周期。该阶段的目的是对反硝化聚,1,磷菌进行选择和富集。进入缺氧阶段时系统内氮源磷源的投加量按N:P=2:1投加。此处投加的氮源为亚硝酸盐,而且亚硝酸盐的以分段的方式向体系流加。 -第二阶段污泥浓度为3500,4000 mg/L,污泥龄控制在16天左右。NO-N2 第三阶段采用厌氧/缺氧沉淀运行方式,污泥浓度为3500,4000 mg/L泥龄控制在16天左右),每天运行3周期,每个周期8小时(包括厌氧3小时、缺氧4.5小时、其它约0.5小时),共运行20周期。 试验所用菌种取自第三阶段厌氧/缺氧沉淀的泥水混合液分别经过反硝化筛选培养基和聚磷菌筛选培养基筛选培养后,用牛肉浸膏蛋白胨培养基多次分离与纯化所得到的单个菌株,通过对菌落观察结合生理生化指标,鉴定筛选出来的单个菌株是肠杆菌科,并将筛选出的DPB纯菌株命名为Gi。 2.1.2 培养基 ,2, 牛肉浸膏蛋白胨培养基:牛肉浸膏1.5g;琼脂9g;蛋白胨5g;氯化钠2.5g;蒸馏水500ml;pH=7.0,7.2。 ,3,富磷培养基: KHPO0.25g;(NH)SO2.0g;MgSO?7HO0.5g;CaCl?HO0.2g; 24444222无水乙酸钠5.0g;蒸馏水1000ml;微量元素1ml;PH=7,7.2。 2.1.3 设备 表1 设备详细资料表 Table1 Detail Information About the Equipment 2 EquipmentsModel number 电热鼓风干燥箱型 CS101-1E 中外合资重庆四达实验仪器有限公司 上皿电子天平 FA1004 上海天平仪器厂 生化培养箱 LRH,250A 广东省医疗器械厂 单人单面净化工作台 SW,CJ,IFD 苏州净化设备有限公司 微孔滤膜 孔径:0.45μm 浙江省海宁市盐宫钱江医疗器材厂 压力蒸汽消毒器 YX280B 上海三申医疗器械有限公司 全温振荡器 HZQ,QX 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 氮气瓶(工业氮) 广钢集团广州气体厂有限公司 铂电极 213型 上海精密科学仪器有限公司 离心沉淀器 80-1型 江苏国华仪器厂 参比电极 213型 上海精密科学仪器有限公司 紫外可见分光光度计 752C型 上海第三分析仪器厂 冰箱 BCD-215HC 华凌 吸放磷装置图(见图1) 图1 吸放磷装置图 1.氮气瓶 2.加药管 3.取样口 4.反应瓶 5.水封 2.2 方法 2.2.1 菌株的活化 ,2,斜面的制作:把牛肉浸膏蛋白胨培养基分装于试管中,培养基高度约为试管的1/5,1/6,加上棉塞并包扎好放于压力蒸汽消毒器,121?灭菌30min。灭菌后,在无菌台上,趁热把试管斜置在木棒上,使试管内的培养基斜面长度为 3 试管长度的1/2,1/3,待培养基冷却后即成斜面。 划线操作:在无菌台上,从已经分离好的Gi菌落中,用接种环挑取少量菌种在斜面上划线,切勿划破培养基。 菌种的培养:把划线后的菌种放于培养箱,25?,30?培养20h。培养出来的便是活化了的菌株,供各试验或保存用。 2.2.2 生理生化特性鉴别 (1) 革兰氏染色 染剂:结晶紫的混合液,碘液,95%的乙醇,番红染液。 操作:用接种环挑取少量待测的菌苔,涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中,风干或用酒精灯烘干(切勿温度太高)固定 ? 用结晶紫的混合液染1min后,用水冲洗 ? 碘液作用1min,水洗,吸干 ? 用95%乙醇溶液脱色,流滴至洗脱液至无色(约30s)? 用番红溶液染1min,水洗,风干 ? 镜检(油镜)。 结果观察:深紫色为革兰氏阳性细菌;红色为革兰氏染色阴性细菌。 注意:染色用的菌种要培养18,24h的菌苔,目的是防止芽孢的生长影响染 +-色的结果。且染色要用已知革兰氏染色结果的菌种(G,苏云金杆菌和G,大肠杆菌)与待测定的菌种做对比。 (2) 运动性(半固体琼脂穿刺法) 根据有鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游走却不能任意游走的现象,观察细菌生长情况,判定试验菌是否有运动性。可使用试验菌能良好生长的培养基,在其中加0.3%,0.6%的琼脂,(所用的琼脂量可因牌号不同而异)一般半固体培养基应是放倒试管不流动,而在手上轻轻敲打时琼脂即破裂为宜。对一般常见细菌可结合葡萄糖氧化发酵试验观察运动性。 用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内,适温培养。细菌的运动性可用透射光目测。如生长物只在穿刺线上,边缘十分清晰,则表示试验菌无运动性;如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散,则表示试验菌株有运动性。对生长快的细菌应培养1天后观察。如第一天不能判定可在2,3天再观察。如2,3天时仍不能判定是否有运动性,可延迟5,6天再观察一次。因为游动能力弱的细菌,在半固体培养基中第1,2天中尚不能从穿刺线游开,故需多培养几天观察。如试 4 验菌在半固体培养基中产气,气泡会将穿刺线上的生长物的扩散情况,不可误将不运动的细菌判为有运动性。如试验菌是好氧细菌,穿刺线上生长物很少,可检查从培养基表面向下渗入的生长物的情况。 (3) 葡萄糖氧化发酵 休和利夫森二氏培养基:蛋白胨2g,氯化钠5g,磷酸氢二钾0.2g,葡萄糖10.0g,琼脂6.0g,溴百里酚蓝1%水溶液3ml(先用少量95%乙醇溶解后,再加水配成1%的水溶液),蒸馏水1000ml。pH=7.0,7.2,分装试管,培养基高度约为4.5cm,115?蒸气灭菌20min。 接种:以18,24h待测的幼龄菌种作种子,穿刺接种,每株2支。其中一支用灭菌的凡士林石蜡油(熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡,高压灭菌)封盖,以隔绝空气为闭管。另一支不封油为开管。同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1,2,3,7天观察结果。 结果检查:只有开管产酸变黄者为氧化型;开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。 (4) 氧化酶 试纸:氧化酶试纸 操作:用白金丝接种环取18,24h的菌苔,涂抹在氧化酶试纸上。 结果观察:在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性,10,60s现红色者为延迟反应,60s以上现红色者不计,按阴性处理。 (5) 吲哚 培养基:1%胰蛋白胨水溶液;调PH=7.2,7.6,分装1/3,1/4试管,115?蒸气灭菌30min。 接种:把新鲜的待测菌种接种于上述培养基中,于适温培养。 试剂:对二甲基氨基苯甲醛8g,乙醇(95%)760ml,浓盐酸160ml。 测定:培养1,2,4,7天的培养液,沿管壁缓缓加入3,5mm高的试剂于培养液表面,在液层界面发生红色,即为阳性反应。若颜色不明显,可加4,5滴乙醚至培养液,摇匀,使乙醚分散于液体中,将培养液静置片刻,待乙醚浮至液面后再加入吲哚试剂。如培养液中有吲哚时,吲哚可被提取在乙醚层中,浓缩的吲哚和试剂反应,则颜色明显。 5 (6) 反硝化 培养基:普通肉汁胨培养液100ml;KNO1g,调PH=7.2,7.4,分装试管,3 每管培养基高度约5cm,121?灭菌30min。 接种:用肉汁胨斜面菌苔为菌种,用接种环接种后用凡士林油封管,同时要以封油的不含硝酸钾的培养基做对照。 结果观察:培养1,7天,观察含有硝酸钾的培养基中有无生长和是否产生气泡,如产生气泡表示有反硝化作用产生氮气,是阳性反应;如不含硝酸钾的对照培养基也产生气泡则只能按可疑或阴性处理,不产气泡则为阴性。 (7) 产氨试验 培养基:蛋白胨5g;蒸馏水1000ml,PH=7.2,分装试管,121?灭菌15,20min。 试剂:将20g碘化钾溶于50ml水中,并在此溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止(约32g)此后再加460ml水和134g氢氧化钾,将上清液贮于暗色瓶中备用。 接种:以幼龄种子接种,置适温培养1,3,5天。 结果观察:取培养液少许,加入试剂数滴,出现黄褐色沉淀为阳性。 (8) 硝酸盐还原 培养基:牛肉膏0.75g,蛋白胨1.25g,KNO0.25g,蒸馏水250ml,pH=7.0,3 7.6。每管分装4,5ml,121?蒸气灭菌15,20min。 试剂:格里斯氏试剂, A液:对氨基苯磺酸0.5g,稀醋酸(10%左右)150ml; B液:α,萘胺0.1g,蒸馏水20ml,稀醋酸(10%左右)150ml。二苯胺试剂:二苯胺0.5 g溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释。 接种:将测定的菌种接种于硝酸盐液体培养基中,置适温培养1,3,5天。另留一管不接种作对照。 操作:取一支干净的空试管,倒入少许培养1,3,5天的培养液,各加一滴A液和B液,在对照管中同样加入A液,B液各一滴。 结果观察:当培养液滴入A,B液后,溶液如变成粉红色,玫瑰红色,橙色,棕色等表示亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性。如无红色出现,则可加入一、二滴二苯胺试剂,此时如有蓝色反应,则表示培养基中仍有硝酸盐,又无亚硝酸盐 6 反应,表示无硝酸盐还原作用;如不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质,故仍应按硝酸盐还原阳性处理。 (9) 亚硝酸盐还原 培养基:牛肉膏10g,蛋白胨5g,蒸馏水1000ml,亚硝酸钠1g,pH=7.3,7.4。分装试管,121?蒸气灭菌15min。 试剂:格里斯氏试剂, A液:对氨基苯磺酸0.5g,稀醋酸(10%左右)150ml; B液:α,萘胺0.1g,蒸馏水20ml,稀醋酸(10%左右)150ml。二苯胺试剂:二苯胺0.5 g溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释。 接种:将测定的菌种接种于亚硝酸盐液体培养基中,置30?培养1,3,7天后测定。 结果观察:加试剂A液和B液各一滴,如红色消失而产氨则为阳性,加试剂为红色说明不分解亚硝酸盐为阴性。 (10) 异染粒 异染粒是以无机偏磷酸盐聚合物为主要成分的一种无机磷的贮备物。富磷培养过程中出现明显的胞内聚磷酸盐异染粒(深蓝色颗粒),而缺磷培养时则全部观察期内始终没有出现该异染粒,这表明磷的存在是形成聚磷酸盐异染粒的先决条件,没有可摄取的磷就不可能形成体内聚磷酸盐。 染剂:甲液,甲苯胺蓝0.15g,孔雀绿0.20g,冰醋酸1ml,乙醇(95%)2ml,蒸馏水100ml;乙液,碘2g,碘化钾3g,蒸馏水300ml。 操作:本试验采用无菌水作为细菌的培养基,将5,6支培养了24h的斜面菌苔洗到装有100ml无菌水的盐水瓶中,摇匀,取少量涂片作为空白(聚磷前); 10用无菌水调节OD使培养液中细菌数为10个/ml;以不剧烈沸腾的气速通氮气, 3,5min后投加磷酸氢二钾和硝酸钾,令P:N,1:2,测定其PO,P,通气总时间4 为2h。通气结束后取废液涂片作为聚磷后的水样,染色,镜检。 染色和镜检:本试验采用甲苯胺蓝作染剂。按常法涂片,用甲液染5min,倾去甲液,用乙液冲去甲液,并染1min,水洗,吸干。试验表明中长杆状和长杆状的菌体的异染粒呈深蓝色,其他部分呈暗绿色或浅绿色,且多数出现极染。短杆状的菌体的异染粒与其他部分形成明显的颜色对比,异染粒部分一般为深蓝色,且集中在菌体的中心。 7 2.2.3 脱氮聚磷效能研究 2.2.3.1 好氧吸磷实验 ,3,(1) 按照富磷培养基配方配制好培养基后调节pH=7.0,7.2,将配好的培养液分装于250ml的三角瓶,每瓶分装150ml培养液,121?蒸气灭菌30min。 (2) 在无菌操作室内将预先接好的斜面(30?培养24h)洗管接入灭好菌的250ml三角瓶,将其置于30?,140rpm,摇床预培养。取少量接种后的培养液4000转离心20 min后取上清液,分别测量预培养前的总磷,磷酸盐,COD,ORP这四个指标。 (3) 培养液在预培养24h后,在无菌操作室内测量其OD值,并用无菌水调节OD值一致后取10ml接入灭好菌的250ml三角瓶。将其置于30?,140rpm,摇床培养。取少量接种后的培养液4000转离心20 min后取上清液,分别测量预培养前的总磷,磷酸盐,COD,ORP这四个指标。 (4) 培养48h、72h和96h后,培养液4000转离心20 min后取上清液,分别测量预培养前的总磷,磷酸盐,COD,ORP这四个指标。 2.2.3.2 同步吸放磷实验 ,2,同步吸放磷实验对经过富磷培养基培养的细菌在缺氧的条件下连续跟踪 -3-测定其NO、PO、COD和ORP的值。 34 (1) 将培养好菌苔刮到3个装有500ml富磷培养基的锥形瓶中,将其置于 1030?,140rpm,摇床培养2,3日,用无菌水调节OD使培养液中细菌数为10个/ml,3瓶500ml的培养基集中到1500ml的抽滤瓶中。 (2) 把试验用液置于自制厌氧密封装置中,往实验用液中先通入氮气30min,起驱除水中氧气的作用,然后迅速投入硝酸盐(采用化学式)作为电子受体进行反硝化聚磷反应。由图1所示,0min(原样)、10 min、20 min、30 min各取样后快速测定其ORP,将所取得的水样用离心沉淀器将菌与水样分开,取上 3-清液置于布式漏斗过0.45μm的微孔滤膜,测定反应前,即滤液中的COD、PO4 -和NO的浓度。 3 -(3) 30min后向装置投加KNO以提供NO作为电子受体,再利用所测得的33 数据调节水样浓度,其中KNO的投加量根据投加药后溶液内氮磷比(N: P =4:3 1)。(注意:投药时直接用医用滴管投加,以减少空气进入反应装置影响实验)。 8 继续通氮气进行缺氧反硝化聚磷吸磷实验,在2min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min、150min分别取样后快速测定其ORP,然后用离心沉淀器将菌与水样分开,取上清液置于布式漏斗过0.45μm的微孔滤膜,测定 3--滤液中的COD、PO和NO的浓度。 43 2.2.4 指标分析方法 [4]2.2.4.1 ORP采用铂电极法 ORP(氧化还原电位)是采用铂电极直接测定法(二电极法)。即将铂电极和参比电极直接插入介质中来测定。具体步骤是:测定前先检查参比电极里面是否有结晶体(应有结晶体,以保证它里面是饱和KCL溶液),且里面的饱和溶液要浸泡探头。接好仪器,把样品倒进烧杯中,开始搅拌(注意:在测量搅拌过程中,要注意别让搅拌磁子碰到铂电极,以防铂电极容易被搅断 ),(由于ORP的测定比较困难,且数据不稳定,故每个样品的测定条件应尽可能一致),故均在1min后读数。 -[4] 2.2.4.2 NO-N采用硝酸根离子选择电极法 3 硝酸根离子选择电极使用一种溶剂聚合离子选择敏感膜,亦称电极膜,它对硝酸根离子有很强的选择性。具体步骤是: 标准曲线:取6支50mL具塞刻度管分别加入1.00,3.00,5.00,7.00,10.0,15.0mL硝酸钾标准使用溶液(C,10mg,L)。分别加入离子调节剂(磷酸二氢钠)N 5ml,定容至50ml,用离子仪测其电位(测定时搅拌1min后读数)。 水样测定:取适量水样(10—20ml),加入离子调节剂5ml,定容至50ml,用离子仪测其电位。 3-[4] 2.2.4.3 PO-P采用钼锑抗分光光度法 4 标准曲线:取数支25ml具塞比色管,分别加入磷酸盐标准使用液0、0.25、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50ml,加水至25ml。 (1)显色:向比色管中加入1ml10,(m/V)抗坏血酸,30秒后加2ml钼酸盐溶液充分均匀,放置15min。 (2)测量:用10mm或30mm比色皿,于700nm波长处,以零浓度溶液为参比,测量分光度。 样品测定:取适量水样(4ml稀释10倍的离心后的上清液),按标准曲线的 9 步骤进行显色和测量。减去空白试验的吸光度,并从标准曲线上查出含磷量。 [4] 2.2.4.4 总磷采用钼锑抗分光光度法 消解:取适量水样(4ml稀释10倍的离心后的上清液),于150ml锥形瓶中,加水至25ml,加数粒玻璃珠,加1ml(3,7)硫酸溶液,5ml5,过硫酸钾溶液,置121?蒸汽消毒器消解30min。放冷,加1滴酚酞指示剂,滴加氢氧化钠溶液至刚呈微红色,再滴加1mol/L硫酸溶液使红色褪去,充分摇匀。如溶液不澄清,则用滤纸过滤于25ml比色管中,用水洗锥形瓶及滤纸,一并移入比色管中,加水至标线,供分析使用。 标准曲线:取数支25ml具塞比色管,分别加入磷酸盐标准使用液0、0.25、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50ml,加水至25ml。 (1)显色:向比色管中加入1ml10,(m/V)抗坏血酸,30秒后加2ml钼酸盐溶液充分均匀,放置15min。 (2)测量:用10mm或30mm比色皿,于700nm波长处,以零浓度溶液为参比,测量分光度。 样品测定:取适量水样(4ml稀释10倍的离心后的上清液),按标准曲线的步骤进行显色和测量。减去空白试验的吸光度,并从标准曲线上查出含磷量。 [4] COD采用快速测定法2.2.4.5 用20ml胖肚移液管吸水样20.00ml加入具有磨口的500ml锥形瓶中,加15.00ml重铬酸钾液,再加40ml浓硫酸(含1,AgSO)及玻璃珠数粒摇匀;另24 取20.00ml左右蒸馏水代替水样,其他操作与测水样时相同,作空白试验,按上回流冷凝器,加热,沸腾后适当降低温度,使回流速度为1,2滴/2min。精确回流10min,稍冷,自冷凝管顶部各加蒸馏水150ml左右,冷却到室温,加试亚铁灵指示剂2,3滴。用标准硫酸亚铁铵溶液回滴剩余的重铬酸钾、溶液由橙红色,绿色,红棕色刚出现(不褪去)为终点。 3 结果与讨论 3.1 菌株生理生化特性鉴别的结果 (1) 革兰氏染色 +-用已知革兰氏染色结果的菌种(G,苏云金杆菌和G,大肠杆菌)与待测定的菌种Gi做对比。染色结果见下图2。 10 图2 Gi菌(革兰氏染色阴性菌,与苏云金杆菌作对比) 通过革兰氏染色镜检观察反硝化聚磷菌Gi的细胞形态描述如下表2所示: 表2 细胞形态 -6菌 株 革兰氏染色结果 细 胞 形 态 细胞长度(10m) - Gi G 实心短杆 0.65×0.65 运动性(半固体琼脂穿刺法) (2) 用直针穿刺接种试验菌Gi于半固体培养基内,适温培养,观察细菌生长情况,培养1,2天后不能观察该试验菌有运动性,结果第3天可观察到其具有运动性。观察结果见下图3。 图3 Gi菌培养3天后的观察结果 (3) 葡萄糖氧化发酵 将菌种Gi接到休和利夫森二氏培养基培养的观察结果图如下。由图6可知,培养7天后,只有开管产酸变黄,所以菌种Gi为氧化型。 11 图4 Gi菌培养1天 图5 空白对照 (左:闭管;右:开管) (左:闭管;右:开管) 图6 Gi菌培养1天 图7 空白对照 (左:闭管;右:开管) (左:闭管;右:开管) (4) 氧化酶 用白金丝接种环取18,24h的Gi菌苔,涂抹在氧化酶试纸上。在10s内涂抹的菌苔没有现红色,所以菌种Gi为氧化酶阴性。 图8 氧化酶试纸上的Gi菌苔 图9 氧化酶试纸上某氧化酶阳性菌菌苔(对照) (5) 吲哚 培养1,2,4,7天的Gi菌培养液,沿管壁缓缓加入3,5mm高的试剂于培养液表面,均在液层界面发生红色,即为阳性反应。其中图10、图11为培养7天的Gi菌培养液,滴加试剂前和滴加试剂后的效果图。 12 图10 滴试剂前 图11 滴试剂后 (6) 反硝化 培养1,7天,每天进行观察,含有硝酸钾的培养基中没有产生气泡,不含硝酸钾的对照培养基也没有产生气泡则为Gi菌反硝化阴性。图12、图13分别为培养7天后含有硝酸钾的培养基和不含硝酸钾的对照培养基的观察结果图。 图12 含有硝酸钾的培养基 图13 不含硝酸钾的对照培养基 (7) 产氨试验 把Gi菌接种到培养基中,置适温培养1,3,5天。取培养液少许,加入试剂数滴,均出现黄褐色沉淀,因此为阳性反应。 图14 含Gi菌培养液 图15 空白对照 (左:滴加试剂前;右:滴加试剂后) (左:滴加试剂前;右:滴加试剂后) 13 (8) 硝酸盐还原 当含Gi菌培养液滴入A,B液后,没有红色出现,在加入一、二滴二苯胺试剂,不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质,因此为硝酸盐还原阳性。图16、图17为培养液培养5天,试验效果图。 图16 含Gi菌培养液 (左:滴加A,B液前;中:滴加A,B液后;右:滴加二苯胺试剂后) 图17 空白对照 (左:滴加A,B液前;右:滴加A,B液后) (9) 亚硝酸盐还原 当含Gi菌培养液加入试剂A液和B液各一滴后,红色消失而产氨则为阳性。图18、图19为培养液培养7天,试验效果图。 图18 含Gi菌培养液 (左:滴加A,B液前;中:滴加A,B液后出现红色;右:红色消失) 14 图19 空白对照 (左:滴加A,B液前;右:滴加A,B液后) (10) 异染粒 镜检后可知Gi菌体聚磷前没有出现异染粒,聚磷后的异染粒部分为深蓝色,且集中在菌体的中心。可见Gi菌体有异染粒,表现出明显的聚磷效果。 图20 Gi菌聚磷前的异染粒镜检图 图21Gi菌聚磷后的异染粒镜检图 从以上Gi菌的10个生理生化特性的试验结果总结得出表3,并以《常见细菌系统鉴定手册》为根据得出试验单菌株Gi属于肠杆菌科。(分析为什么从生理生化指标将其归为短程反硝化聚磷菌) 表3 Gi菌生化特性鉴别结果表 测试项目 Gi 革兰氏染色 - 氧化酶 - 硝酸盐还原 + 葡萄糖氧化发酵 氧化型 反硝化 - 吲哚 + 异染颗粒 + 15 亚硝酸盐还原 + 产氨试验 + 运动性 + -6细胞长度 0.65×0.65(10m) 细胞形态 实心短杆 菌落特征 中等大小 归属 肠杆菌科 3.2 菌株的脱氮聚磷效能分析 3.2.1 通过好氧吸磷实验分析DPB的聚磷效能 265.00250 260.00 255.00200 250.00 245.00150240.00ORP(mv)235.00磷酸盐100230.00浓度(mg/l) 225.00 50220.00 215.00 210.00002426487296 259.38 256.95 250.28 256.35 238.00 228.00 磷酸盐(,,mg/l) 227 200 184 193 207 209 ORP(mv) 时间(h)磷酸盐(,,mg/l)ORP(mv) 图22(1) Gi菌在好氧吸磷实验过程中磷酸盐浓度和ORP的变化 16 1600.00 1400.00 1200.00 1000.00 800.00 600.00浓度(mg/l) 400.00 200.00 0.0002426487296 259.38 256.95 250.28 256.35 238.00 228.00 磷酸盐(,,mg/l) 1373.33 960.00 773.33 650.00 640.00 613.33 ,,,(,,, mg/l) 时间(h)磷酸盐(,,mg/l),,,(,,,mg/l) 图22(2) Gi菌在好氧吸磷实验过程中磷酸盐浓度和COD的变化 从图22(1)可知,Gi菌的在96小时跟踪实验的过程中,其ORP维持在184mV,227mV之间,菌体的吸磷现象均处于好氧环境下进行,这是基于实验条件的影响,在摇床培养的过程中,氧气透过棉塞进入菌体的培养液中使菌体始终处于好氧环境。 从培养液的磷酸盐浓度可知,从菌株接入培养基时到24小时后再转换培养基后的26小时,菌体表现为吸磷,但磷的去除率不大,只有4,;而26小时到48小时的培养过程中,培养液内的ORP跟原始培养液的值相比有所下降,菌体则表现为放磷,但放磷量不大;菌体的吸磷效能主要表现在培养48小时后到96小时,随着ORP值上升,菌体的吸磷量大大增加,以48小时到72小时的现象更为明显。从总体看,该聚磷菌表现出较好的聚磷效能,其总体去除率为12,。 而从原理上讲,聚磷菌的生理特点是“厌氧放磷,好氧吸磷”,至于该聚磷菌在26小时到48小时的好氧环境下表现出放磷的现象,其原因还有待研究。 菌体在好氧吸磷的过程中分解体内的聚-β-羟基丁酸盐和外源基质,产生质子推动力将体外的磷酸盐输送到体内合成ATP和核酸,将过剩的磷酸盐聚合成细胞贮存物:多聚磷酸盐。因此在去除磷酸的过程中需要消耗碳源,表现为COD下降。从图22(2)可知,在整个培养过程中COD的值随着菌体的“吸磷,放磷,吸磷”的过程不断下降,表明COD的消耗是菌体放磷和吸磷的条件。(解释为什么COD的去除率远远高于磷酸的去除率,这是因为细菌在生长的过程中也需 17 要消耗大量的COD) 通过以上实验,初步证实了Gi菌是一类聚磷菌。 3.2.2 通过同步吸放磷实验分析DPB的脱氮聚磷效能 6030 5025 4020 3015磷酸盐(mg/L)2010硝酸盐氮(mg/L) 105 00 01020303032354050607590120150180 时间(min)磷酸盐浓度硝酸盐氮浓度 图23(1) Gi菌在同步吸放磷实验中磷酸盐浓度和硝酸盐氮 浓度的变化 60180 15050 12040 90 30 60ORP(mV)20磷酸盐(mg/L)30 100 0-30 010203032354050607590120150180 磷酸盐ORP时间(min)图23(2) Gi菌在同步吸放磷实验中磷酸盐浓度与ORP之间 的变化 18 60 305050 255040 2050 30 1550 20磷酸盐(mg/L)COD(O2,mg/l)1050 10550 050 010203032354050607590120150180 时间(min)磷酸盐COD 图23(3) 磷酸盐浓度与COD之间的关系 -表4 以NO-N为电子受体的同步反硝化聚磷各指标数据表 3 ,,,值(,,, 磷酸盐浓度硝酸盐氮浓度ORP值 mg/l) (mg/L) (mg/L) (mV) 0min(原样) 49 24 137 3107 10min 37 3.5 166 3479 20min 33.5 1.26 150 1965 30min 33 1.1 92 2071.7 30min(投药后33 15 92 2071.7 理论值) 32min 32.9 10 -3 159 35min 30.8 8.7 8 239 40min 33 9.3 5 106 50min 40.9 11 2 212 60min 38 10 0 650.7 75min 37.8 12 9 518 90min 34.5 17 4 79.7 120min 32 8.6 -21 202 150min 24.7 10 -18 212 180min 20 5 5 180 19 由图23(2)可知,向试验用液通氮气32min后,ORP由137mV达到了-3mV,而且ORP<0, 根据周群英等人的报道,ORP值-100mV,100mV为缺氧状态。因此该试验完全在缺氧状态下进行。 由图23(1)可知,在通氮气的前30min,菌体表现为好氧吸磷,磷酸盐的浓度从49mg/L下降到33mg/L,去除率为33,,且COD大幅度下降,此过程中菌体对碳源的消耗量较大。通氮气30min后进入缺氧状态,投加NaNO作为电子受体进行3 -反硝化聚磷,菌体利用NO-N为电子受体继续吸磷,投药后的前5min,磷的浓3 度从33 mg/L下降到30.8 mg/L,吸磷量不大。同时,硝酸盐浓度在投药后5min内迅速的降低,由15mg/L降到8.7mg/L,去除率达到了42,。导致这段时间内 [5]磷的去除率不高,可能是因为COD太高的原因,有研究表明,碳源浓度高达300mg/L以上时,未反应完全的有机物残留于缺氧段对缺氧吸磷产生抑制作用,这类似于在缺氧段外加碳源,浓度所产生的抑制作用随之增大。主要原因是外碳源可优先支持反硝化而不进行吸磷,随着缺氧段外加碳源浓度的增高,反硝化速率变大,而吸磷速率反而减少。35min到75min这段时间磷的去除率都不高,而且磷酸盐的浓度还有上升的现象,而硝酸盐氮浓度的值也在10mg/L左右徘徊,除磷和脱氮的效果都不明显。而COD在这期间的值不稳定,到60min的时候其值又升高,远远大于300mg/L,这可能就是导致菌体除磷脱氮效能都不好的原因。菌体高效的除磷脱氮效能体现在75min之后,反硝化吸磷速率与作为电子受体的硝酸盐氮浓度有关,硝酸盐浓度越高,缺氧吸磷速率越快。磷去除率为60,, -氮去除率为67,。Gi菌是在缺氧条件下能利用NO-N为电子受体进行吸磷,同3 -时把NO-N还原成气态氮以达到同步脱氮除磷的高效DPB。(此段分析要先了解3 COD与N和P的去除关系,在厌氧释磷阶段中,聚磷菌需要利用大量的挥发性脂肪酸产生PHB(β-羟基-丁酸酯)同时释放出磷酸于环境中,此是为磷酸浓度升高而COD也迅速下降,但在缺氧阶段,聚磷菌分解PHB(β-羟基-丁酸酯)和少量的外源的基质,并且过量吸收溶液中的磷酸将其合成细胞体内的物质,因此此过程表现为COD下降很少,而磷酸下降较多。 因此先谈COD与P的下降关系,将其归为一聚磷过程,再谈N与P的下降,将其归为一反硝化聚磷同步的过程) 20 (文章仅仅谈了肠杆菌科在驯化第三阶段Gi表现出来的吸放磷效果,但是没有其在驯化的第一阶段表现出来反硝化聚磷效能,不能反映这在具体的环境下是如何诱导并加强这些细菌的反硝化聚磷效果,所以应该增加一点谈驯化前的反硝化聚磷效果) 3.3 细菌的归类 所谓的反硝化菌和聚磷菌,只是从工程的角度在污水生物脱氮除磷研究中对 [6]——微生物的一种界定:将在缺氧(不存在分子态溶解氧)条件下,将NON和NON23还原成气态氮(N)或NO、NO的一类异养性细菌称为反硝化菌;将厌氧/好氧交22 替运行导致厌氧释琳、好氧超量吸磷的一类异养性细菌称为聚磷菌。硝酸盐还原性和超量吸磷只是两种并不冲突的细菌生化特性,也可同时拥有这两种生化特性。因此,反硝化菌和聚磷菌之间并无严格区分,可相互交叉,其交叉点是反硝化聚磷菌DPB。由细菌完成的生物脱氮和生物除磷是两个既相对独立又相互交叉的生理过程,其交叉点是同时拥有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的细 [7]菌(DPB)进行的反硝化除磷脱氮生化反应。 [2]新加坡的J.Y.Hu等提出了3种聚磷菌:(1)一种只能利用氧作为电子受体的聚磷菌,记为 P;(2)另一种是既可以利用氧又利用硝酸盐作为电子受体的聚磷菌,记为 P ;(3)O ON [15]还存在一种利用氧、硝酸、亚硝酸盐作为电子受体的聚磷菌,记为 P,Satoshi等采用ONn -(AOA)SBR反应器进行同步脱氮除磷实验,结果表明:即使NO-N浓度达到20mg/L时仍然2 -发生反硝化聚磷作用,因此NO-N可作为反硝化聚磷菌的电子受体,亚硝酸盐在聚磷阶段并2 -不是一种抑制因素,反而是可以取代O氧与NO-N的电子受体。本试验采用亚硝酸盐为23 电子受体驯化短程反硝化聚磷菌,并从中筛选出单菌株Gi就是同时拥有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的DPB,而且其利用亚硝酸盐为电子受体,属于高效的短程反硝化聚磷菌。而且是属于国内首次分离出短程反硝化聚磷纯菌株。 4 结论 (1)SBR体系中,利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化除磷工艺筛选出来的单菌株Gi属于肠杆菌科,且有异染粒,表现出有明显的聚磷效果。 (2)在反硝化聚磷过程中,硝酸盐氮和COD的浓度是影响DPB脱氮除磷效能的条件。 21 参 考 文 献 [1] 李智勇,彭用臻,张艳萍,等。硝酸盐浓度及投加方式对反硝化除磷的影响,J,环境污染与防治,2003,25(6):323,325 [2] SBR反应器中聚磷菌筛选及其聚磷效能的研究,第九次全国环境微生物学术研讨会论文摘要集 [3] 王强,马放,姜欣欣等.SBR反应器中聚磷菌筛选及其聚磷效能研究.哈尔滨工业大学市政环境工程学院。 [4] 水和废水检测分析方法(第四版),国家环保局《水和废水检测分析方法》编委会,182-186。2002,中国环境科学出版社,北京 [5] 王亚宜,彭永臻,王淑莹等.碳源和硝态氮浓度对反硝化聚磷的影响及ORP的变化规律[J].环境科学,2004,25(4):54—58 [6] 沈品华,屠振密。电镀锌及锌合金,机械工业出版社,2002。 [7] 罗宁,罗固源,许晓毅.从细菌的生化特性看生物脱氮与生物除磷的关系[J].重庆环境科学,2003,25(5):33—35 22
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