无精子症患者睾丸精子膜功能检测与卵胞浆内单精子注射治疗效果的相关性研究

无精子症患者睾丸精子膜功能检测与卵胞浆内单精子注射治疗效果的相关性研究 无精子症患者睾丸精子膜功能检测与卵胞 浆内单精子注射治疗效果的相关性研究 生殖医学杂志2o生旦箜鲞釜塑 无精子症患者睾丸精子膜功能检测与卵胞浆内单精子 注射治疗效果的相关性研究 岳林 (河南省洛阳市中心医生殖助孕中心,河南洛阳471009) 【关键词】精子膜功能;水试验;低渗膨胀试验;卵胞浆内单精子注射 【中圈分类号】R698.2【文献标识码】B【文章m--~.]1004—3845(2005)06—0367 —02 睾丸中的精子从其形态结构和染色质的角度已 基本成熟.非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺精子 对卵胞浆内单精子注射(ICSI)受精有无影响,目前 尚知之甚少.1991年Lemeo等用蒸馏水替代低 渗溶液(简称水试验),进行精子低渗膨胀试验结果 满意,认为水试验是一种简单可靠的评价精子膜完 整性的方法.作者采用水试验和低渗膨胀试验 睾丸穿刺精子膜完整性,探讨不同膜功能的睾丸穿 刺精子其受精率,卵裂率,优质胚胎率,临床妊娠率. 一 ,材料与方法 1.对象:33对因非梗阻性无精子症不育的夫 妇.男方睾丸体积>12ml,黄体生成素(LH),卵泡 刺激素(FSH),睾酮(T)值正常;染色体核型46, XY;排除其他全身性和遗传性疾病;年龄23,41 岁,平均29岁.女方年龄22,31岁,平均27岁. 2.女方促排卵方案:长方案:于促排卵前一周 期黄体中期注射促性腺激素释放激素激动剂(Gn— RHa,达菲林,博福一益普生,法国)1.87mg,促排卵 周期第3天起使用FsH/人绝经期促性腺激素 (HMG),根据B超检测调整FSH/HMG剂量,当 有1,2个卵泡直径?18mm时停药.当晚注射人 绒毛膜促性腺激素(hCG),36h后经阴道B超行卵 泡抽吸取卵.短方案:于月经周期第2天每日皮下 注射达必佳(Ferring,德国)0.1mg,月经第3天开 始每天肌注FSH/HMG,余同长方案. 3.精子采集与制备:在局麻下,用12号头皮静 脉针连接1Oml注射器,注射器内抽吸5Ol培养 液,取睾丸游离面无血管区穿刺睾丸保持负压拔针, 将穿刺物注入无菌培养皿内,将生精小管切割挤压 收集精子,在显微镜下观察精子数量,形态,活动力 决定是否再次穿刺取精.在收集的精子和睾丸组织 碎片中加入含10SSS(serumsubstitutesupple— ment)的拟人输卵管液(HTF)一Hepes培养液离心 洗涤,弃上清液后同法再次洗涤,最后在沉淀物中加 入0.3ml含1OSSS的HTF—Hepes培养液,置 37?保温试管架孵育待用. 4.实验方法;低渗溶液按WHO_3推荐的方法 配制.将制备好的精子培养液混匀,取2Ol精子 培养液加0.2ml低渗液,用巴氏吸管轻轻摇匀.在 37?下保持30rain,相差显微镜下观察,精子尾部 发生变化的定为精子肿胀,考虑到睾丸穿刺精子较 少,计数至少观察2O个精子.重复计数两遍,并计 算平均百分比.水试验取2Ol精子培养液加 0.2ml蒸馏水,余同低渗膨胀试验进行.剩余的 0.26ml精子培养液放回保温试管架行ICSI. 5.ICSI操作:将适量的精子培养液先加入含 1O9/6SSS的HTF—Hepes液滴中,尽量寻找活动精 子,无活动精子可用时,再在蒸馏水液滴中加入适量 的精子培养液尽快选取精子尾部发生变化的精子放 入聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)微滴,将MII期的卵母 细胞放入含1OSSS的HTF—Hepes液滴中,用 ICSI注射针在培养皿底部猛烈划破精子的尾部,将 制动的精子吸入注射针,将吸入精子的显微注射针 和固定针放入含卵母细胞的微滴中,MII期的卵母 细胞由固定针吸引固定,使第一极体位于12或6点 钟处,将ICSI注射针经过透明带刺入卵母细胞胞质 内,回抽部分胞质后将回抽的部分胞质和精子注入 卵母细胞,退出注射针头,完成ICSI过程. 6.培养:将受精卵置于新鲜的培养液中.37?, 5Co.湿化培养箱中培养15,18h,观察卵母细 胞是否有双原核和极体,48h观察有无卵裂. 7.胚胎移植及妊娠检测:受精4O,48h后将 【收稿日期】2005-06—16;【修回日期】2005—09—16 【作者简介】岳林(1962~),男,河南长垣人,副主任医师,生 殖医学专业. 2,34-优质胚胎经阴道植入子宫.同时给予黄体支 持.剩余胚胎冷冻保存.2周后检测血和尿hCG, 诊断是否已妊娠,4,5周后进行B超检查,观察孕 囊和心脏搏动,确定是否临床妊娠和妊娠的数目. 8.统计学方法:应用t和检验. 二,结果 1.睾丸穿刺精子水试验及低渗膨胀试验膨胀 率:33个ICSI周期中睾丸穿刺精子水试验及低渗 膨胀试验膨胀率分别为(34.54-14.6)和(35.04- 15.3)%,两者无显着性差异(P>O.05).精子膜功 能试验阳性率?3O者22例(占67);<30者 11例(占33). 2.不同膨胀率精子ICSI结果:精子膜功能实 验阳性率?3O者22个周期与<3O者l1个周期 比较.两组女方的年龄,不育年限,获卵数,移植胚 胎数比较,均无显着性差异(P>0.05).受精率,卵 裂率,优质胚胎率,临床妊娠率?3O组分别为 75.2(185/246),52.0(128/185),42.7 (105/185),40.9(9/22);<30%组分别为48.7 (58/119),29.4(35/58),21.0(25/58),18.2 (2/l1);两组有显着性差异(P<0.0】). 三,讨论 精子授精能力与精子膜结构和功能的完整性密 切相关.精子膜不仅是精子新陈代谢的基础,对精 子获能,顶体反应以及精卵融合等有重要作用.因 此,测定精子膜功能可以准确地反映精子功能并预 测精子的授精能力.精子膜功能低渗膨胀试验的原 理在于精子在低渗环境中,为维持精子膜内外液体 平衡,水分子大量透过胞膜进入胞内,导致细胞膨 胀,精子外形改变,精子尾部膜较其它部位更柔韧疏 松,进入的液体更多,外形变化更大,呈现出各种易 于观察的膨胀现象,这是精子膜功能正常的标志之 一 l_4] .精子尾部是精子的运动器官,尾部功能的好 坏直接反映精子的存活率和活动力的好坏,精子存 活率和活动力越高则其尾部膨胀率越高_5. 临床资料显示睾丸发育和外周血染色体正常的 男性无精子症患者,80以上可从睾丸生精小管组 织中分离出外形发育正常的精子,将这些精子用于 ICSI及胚胎移植已经成为治疗男性无精子症不育 的重要而有效的方法]. 本试验结果显示,水试验和低渗膨胀试验的精 子膨胀率无显着差异(P>O.05).水的渗透压为0, 生殖医学杂志2005年12月第14卷第6期 比渗透压为150mOsm的含果糖,枸橼酸钠的低渗 溶液的渗透压更低,在短时间内对精子膜不会造成 损伤.提示水试验和低渗膨胀试验同为检测精子膜 完整性的方法,而水试验更简单,有它的独特性,是 一 种简单,快速评价精子膜功能完整性的方法,符合 ICSI前及时确定注射精子膜功能的要求.虽然睾 丸穿刺精子膜功能差,水试验及低渗膨胀试验膨胀 率分别为(34.54-14.6)和(35.04-15.3),提示 部分睾丸精子有一定成熟度.通过ICSI技术直接 将精子注人卵子达到受精,胚胎也能发育.说明了 睾丸的精子形态,结构和遗传物质已基本发育成熟. 水试验选取尾部肿胀的精子方法简单,临床应用中 发现通过水试验和低渗膨胀试验检测睾丸精子膜功 能?3O属正常者,其精子授精后胚胎的成功率高; 反之,?3O者易出现不受精,胚胎发育差,或停止 分裂,临床妊娠率较低.这是否与精子膜功能差或 未经过附睾成熟有关,还有待进一步研究. 【参考文献】 [1]熊承良,吴明章,刘继红,等主编.人类精子学[M].武汉:湖 北科学技术出版社,2002.414. E23LomeoAM,GiambersioAM."Watertest":asimplemethod toassessspermmembraneintegrity[J].IntJAndrol,1991,14 (4):278-282. r3]WHO.Laboratorymanualfortheexaminationofhuman semenandsperm—cervicalmucusinteraction[s].4thed.Cam— bridge:CambridgeUniversityPress,1999.51-52. E4]田中岭,徐志喜,马远方,等.精子膜功能试剂盒的临床应用对 比研究[J3.第四军医大学,1999,20(10):913-915. 5]周文献,沈新生,贾韶彤.水试验评价人精子膜功能完整性的 观察[J].宁夏医学院,2004,26(4):235—238. [6]PalermoGD,JorisH,DevroeyP,eta1.Pregnanciesafter intracytoplasmicsperminjectionofsinglespermatozoaintoan oocyte[J].Lancet,1992,340(881O):17-18. E7]AbuzeidMI,SasyMA.SalemH,eta1.Testicularsperm extractionandintracytoplasmicsperminjection:asimplified methodfortreatmentofobstractiveazoospermia[?.Fertil Steri1,1997,68(2):328-333. E83OstadM,LiottaD,YeZ,eta1.Testicularspermextractionfor nonobstructiveazoospermia:resultsofamultibiopsyapproach withoptimizedtissuedispersion[J].Urology,1998,529(4): 692—696. [9]SchlegelPN,PalermoGD,GoldsteinM,eta1.Testicularsperm extractionwithintracytoplasmicsperminjectionfornonobstructive azoospermia[J].Urology,1997,49(3):435—440.