眼络通冲剂质量控制标准实验室研究-药学论文

眼络通冲剂质量控制标准实验室研究-药学论文 作者:姜宁华徐宏祥傅应华 【摘要】,目的,研究眼络通冲剂的定性和定量质控指标。,方法,采 用硅胶G薄层色谱法对冲剂中两种主要成分川芎和三棱进行定性鉴 别;用RPHPLC法对葛根素进行含量测定，采用Kromasil1005C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱，甲醇-水(30:70)作流动 相，检测波长为250nm。,结果,葛根素进样量在0.06,0.65μg的范 围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9999，日内、日间精 密度RSD分别为0.85%和0.48%(n=5)。得高、中、低3个浓度平 均加样回收率(n=3)分别为101.2%、101.1%、101.4%，RSD分别 为1.1%、0.94%、0.41%。,结论,硅胶G薄层色谱定性法和RP-HPLC 定量法结果准确可靠，重现性好，可作为该制剂质控标准。 【关键词】反相高效液相色谱法;薄层色谱法;葛根素;川芎;三棱; 眼络通冲剂 Abstract:,Objective, ToobservetheindexesofqualitycontrolofnatureandquantityofYanluotongInf usion.,Method, Makeauthenticationtothe2maincomponentsofLigusticumwallichiiandrhizo masparganiionthEirnaturewithSilicagelGthinlayerchromatography;makecontentmeasurementtopuerarinwithRP HPLC,takeKromasil1005C18(4.6mm×250mm，5μm) aschromatogramcolumn,methanolwater(30:70) asflowphase;themeasuredwavelengthis250nm.,Result, Thepuerarinsamplingintherange0.06,0.65μ gisingoodlinearrelationshipwiththesummitarea,therelativecoefficientr=0.9999，theintradayanddaysnicetyRSDarerespectively0.85%and0.48%(n=5);theaveragesamplereclaimratesofhigh,middleandlowconcentrations(n=3)arerespectively101.2%,101.1%and101.4%， RSDis1.1%,0.94%and0.41%separately.,Conclusion,SilicagelGthin layerchromatographyandRP HPLCarecorrectandreliablefornatureandquantitycontrol,withgoodrepeatability,andcanbetakenasqualitycontrolstandardofthepreparation. Keywords:RPHPLC;thin layerchromatography;Ligusticumwallichii;rhizomasparganii;puerarin;YanluotongInfusion 眼络通冲剂具有活血通络之作用，结合氩激光，用于治疗视网膜 静脉血栓。该药由葛根、水蛭、人工麝香、川芎、三棱等6味中药经 水煎煮、浓缩，加适量辅料制得。但审批标准中原质控标准提供的鉴 别方法专属性差且无含量测定方法。为了有效提高及控制本品的质 量，我们对标准生产工艺制作的眼络通冲剂的质控项目进行实验室研 究，现报道如下。 1仪器与试药 1.1仪器日本岛津LC10ATvp高效液相色谱仪、SPD10Av 紫外检测器;7725i手动进样阀(20μl定量管)，10μl微量注射器; HS色谱数据工作站V4.0+(杭州英谱);CQ250超声波清洗器。 1.2试剂与药材葛根、川芎、三棱等药材，βCD(上海伯奥生物科技有限公司)，葛根素对照品(供含量测定用)、川芎对照药材均由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为752200801和0918 20007;薄层层析硅胶G(浙江雁荡山试剂厂)，甲醇(色谱纯)，正己烷、乙酸乙酯、乙醚及石油醚均为分析纯，水为蒸馏水。 2方法与结果 2.1眼络通冲剂的制备将处方量饮片打成粗粒，混合均匀，加10倍水量，按审批标准制剂工艺水煎煮法提取2次，第1次1.5h，第2次1h，提取液合并，静置，取上清液，浓缩至比重1.25以上的浸膏。加入人工麝香、少量糊精及矫味剂，混合均匀，用70%乙醇适量制软材，过10目筛制粒，50?低温烘干，分装，规格为15g/袋。如上制作三批，批号分别为:080310、080320、080401。 2.2川芎定性鉴别 2.2.1供试品溶液的制备取本品细粉4g，加无水乙醇5ml，摇匀，再加入乙醚30ml，加热回流1h，放冷，滤过，取滤液挥干，加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺川芎的阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。 2.2.2对照药材溶液的制备取川芎对照药材1g，加乙醚30ml，加热回流1h，同法制成对照药材溶液。 2.2.3薄层层析板的涂铺取硅胶G3.5g，置研钵中，加水12ml，研磨均匀，铺板10×20cm2薄板一块，晾干，于110?烘箱中活化 30min，置干燥器中备用。 2.2.4薄层色谱法照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录)试验，吸取上述3种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开12cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，结果供试品色谱图中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.40，阴性样品无此斑点。 2.3三棱定性鉴别 2.3.1供试品溶液的制备取本品细粉4g，加无水乙醇5ml，摇匀，再加入乙醚30ml，50?水浴加热回流1,，放冷，滤过，取滤液置40?水浴上浓缩至约2ml，作为供试品溶液。另取缺三棱的阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。 2.3.2对照药材溶液的制备取三棱对照药材2g，加乙醚30ml，加热回流1h，同法制成对照药材溶液。 2.3.3薄层层析板的涂铺取硅胶G3.5g，置研钵中，加0.6%羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨均匀，铺板10×20cm2薄板一块，晾干，于110?烘箱中活化30min，置干燥器中备用。 2.3.4薄层色谱法照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录)试验，吸取对照药材溶液5μl，供试品溶液与阴性对照溶液各10μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(17?3)为展开剂，展开12cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，结果供试品色谱图中，在与对照药材色谱 相对应的位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.45，阴性对照样品无此斑点。 2.4葛根素含量测定 2.4.1色谱条件与系统适用性试验以Kromasil100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱;甲醇-水(30:70)为流动相;流速1ml/min;检测波长为250nm;进样量为5μl，柱温为室温。在此条件下，样品色谱图中葛根素与其他相关峰均能达到基线分离，保留时间为16.4min，葛根素峰理论板数应不低于3000，与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。阴性样品色谱图明，处方中其他几味中药对测定无干扰。 2.4.2对照品纯度检查取每1ml含葛根素1.29mg的70%甲醇溶液，进样10μl，在本实验条件下，未见杂质峰，按面积归一法计算纯度为100%。 2.4.3线性关系精密称取经60?减压干燥至恒重的葛根素对照品12.98mg，置10ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分置10ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，按本文给定的色谱条件，各进样5μl，测定峰面积，以峰面积积分值Y与对照品进样量X(μg)进行线性回归，回归方程为 Y=4.526×106X+5.464×104r=0.9999 结果表明:葛根素进样量在0.06,0.65μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。因此，在线性范围内可采用外标一点法定量。 2.4.4精密度和重复性试验取同一对照品溶液，重复进样5次，求得葛根素峰面积的RSD为0.77%。另称取同一批号(080310)样品5份，每份约0.5g，分别按“2.4.9”项下方法制备样品溶液进样测定含量，求得含量的RSD为0.51%(n=5)。 2.4.5稳定性试验取供试品溶液1份，在0、2、8、24、48h分别按“2.4.9”项下方法进样测定含量，结果表明在48h内供试品溶液是稳定的。 2.4.6日内和日间精密度取同一份对照品溶液，在日内每隔2h取样测定1次，连续5次，求得峰面积的RSD为0.85%(n=5);另取同一批号样品，每天取样按“2.4.9”项下方法测定含量，连续测定5d，求得含量的RSD为0.48%(n=5)。 2.4.7提取条件选择 2.4.7.1提取溶剂选择文献报道,12,多用甲醇水提取样品中葛根素，故考察不同浓度甲醇对提取的影响，称取样品5份，每份0.5g，置100ml量瓶中，分别加50%、60%、70%、80%甲醇约150ml，超声处理30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，根据测定结果，确定用70%甲醇作溶剂。 2.4.7.2溶剂体积选择精密称取本品3份，每份0.5g，置200ml量瓶中，分别加70%甲醇80、120、180ml，摇匀，超声溶解30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，根据测定结果，本法确定加入溶 剂体积约120ml。 2.4.7.3提取时间的选择精密称取本品5份，每份2.0g，置200ml量瓶中，各加入70%甲醇约180ml，分别超声溶解10、20、30、40、50min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，结果表明，超声处理30min含量已不再增加，故确定超声时间为30min。 2.4.8加样回收率测定精密称取已知含量样品9份，每份0.25g，置50ml量瓶中，分别精密加入葛根素对照品溶液(取12.44mg+70%甲醇?20ml)1，2，3ml(0.622，1.244，1.866mg)，再各加入70%甲醇至40ml，超声溶解30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，计算回收率，得高、中、低3个浓度平均加样回收率分别为101.2%、101.1%、101.4%，RSD分别为1.1%、0.94%、0.41%(n=3)。 2.4.9样品测定取本品约20g,研细,再精密称取细粉约0.5g，置200ml量瓶中，加70%甲醇120ml，超声溶解30min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取葛根素对照品用70%甲醇配制成浓度约为60μg/ml的对照品溶液,各进样5μl，记录色谱图，按外标法计算葛根素含量，结果见表1。 表1眼络通颗粒样品测定结果(略) 3讨论 本制剂处方中川芎、三棱两味中药均含有挥发油，按标准制剂工艺采用水煎煮提取、再浓缩制粒方法，其中的挥发油成分损失较大，影响疗效，且自拟质量标准中制定的川芎挥发油定性鉴别为将样品溶 液直接点样于滤纸上，置紫外光灯(365nm)下观察，显亮蓝色荧光。经检测发现，该方法受到样品中相关组分干扰，荧光斑点不明显，缺乏专属性。因此参照中国药典(2005版)一部建立了川芎挥发油的薄层色谱鉴别方法，展开剂采用正己烷-乙酸乙酯(9?1)可获得满意结果。参照文献,3,建立了三棱挥发油的薄层色谱鉴别方法，展开剂采用石油醚-乙酸乙酯(17:3)可获得满意结果。 经试验发现，用不同溶剂提取葛根，在反相色谱柱上可得到不同的色谱图，主要表现在水煎煮提取葛根时，在色谱图上可分离到葛根素峰两个相关组分峰，葛根素峰与相关峰之间分离度良好。本文针对用醇提取葛根工艺制备的样品，建立的色谱条件能较好地分离样品中葛根素与相关组分峰，适用样品中葛根素的分离测定。三批样品测定结果表明，葛根素含量在5.90,6.78mg/g之间，考虑到不同来源葛根其葛根素含量差异较大，暂定本品葛根素含量限度应不低于4.5mg/g。 【参考文献】 ,1,黄亚非.采用高效液相色谱法测定心脉通口服液中葛根素的含量,J,.中国中药杂志，2001，26(11):760. ,2,向大雄.离子对色谱法测定心脑安颗粒剂中葛根素含量,J,.中国医院药学杂志，2002，22(5):261. ,3,伍月红.三棱与莪术的比较鉴别,J,.广东药学，1994，4(4): 25.