组成人体的细胞

组成人体的细胞 第一篇 组成人体的细胞 第四章 细胞培养 人体是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞 在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in vitro） 培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后于模拟体内生理环境等特定 的体外条件下，进行孵育培养使之生存并增殖和进行生理活动，这一过程就称为 细胞培养（cell culture）或细胞培养技术（cell culture technique）。 第一节 细胞培养概述 一、细胞培养的基本概念 细胞培养是从体内组织取出细胞并在体外模拟体内环境下，使之生存、生长、 繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 二、体外培养细胞的条件模拟 细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模 拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来，这种人工模拟的生存环境 主要包括营养、温度、渗透压、pH等几方面的因素。 （一）营养需求 体外培养细胞时，营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培 养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。 1．细胞对营养的需求 离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同，主 要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。 （1）氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料，也是细胞重要的能量来源，氨基 酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所有的细胞均 需要下列12种氨基酸：精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。 （2）用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最为多 用。糖类物质是细胞最主要的能量来源，同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类 物质重要的碳源。 （3）无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要，同时还对细胞跨膜电 位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离 子主要有钠、钾、镁、磷、钙等。 （4）维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶，严重影响着细胞的活力与增 殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B、吡哆醇等都是培养12基需要添加的成分，尤其以B族的维生素常见。 （5）血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰 蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的 血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum， NCS）、小牛血清（calf serum，CS）、马血清、猪血清以及人血清。 （6）脂肪酸和脂类物质也常有血清提供，尤其被一些特定的细胞系所必需。 例如，用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。 （7）微量元素常被添加给那些无血清培养基，以弥补因未添加血清所造成 的微量元素缺失或不足，主要有锌、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代 谢产生的自由基具有重要作用。 2．培养基 用于细胞培养的培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体 培养基和液体培养基两类；按其来源分为天然培养基和合成培养基。 （1）天然培养基：在细胞培养技术发展的早期，所用的细胞培养基多是来 自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液，常被称为天然培养基。目前最普 遍使用的天然培养基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但 这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用，常见的血清添加比例为 5%～20%。 （2）合成培养基：是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上， 根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂 类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。?基本培养基。早期研制的 合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖，需要添加一定 量的血清才能成为真正的“完全培养基”，故常将其称为基本培养基，常见的MEM、DMEM、RPMI1640、199等均属此类；?无血清培养基。无血清培养基 是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。?无 蛋白培养基。目前，这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动 物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的；?限定化学成分培养基。限定化学成 分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基，和无蛋白培养基不同点在于其没有 添加植物水解物，而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此，这种 培养基的所有成分都是明确的，是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基。 （二）温度 体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活，不同细胞适宜的培养温 度常由动物种类所决定。比如，哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多 在36?～37?；鸟类细胞适宜的培养温度在38.5?；昆虫细胞的培养温度在 25?；冷血脊椎动物的培养温度在18?～25?。 培养温度的不适当会严重影响细胞的存活及生长状态。通常，细胞对低温可 有较长时间的忍耐限度，甚至可在低于适宜温度一定范围内生长，但如果培养温 度高于适宜温度时（如在39?条件下培养人类细胞），细胞常会在几h内便死亡。因此，定期检查细胞培养箱的温度非常重要。 （三）渗透压 离体的细胞必须生长在等渗的液体环境中才能维持细胞的正常形态结构，并 有助于细胞对出入细胞的物质进行调控。渗透压的大小主要由培养基中各种盐成 分的浓度决定。尽管大多数细胞对渗透压都有一定的耐受性，但适宜的渗透压常 会因细胞的种类及物种来源不同而异。例如，培养人类细胞的理想渗透压为290 mOsm/kg；培养大多数哺乳类动物细胞的理想渗透压多在260mOsm/kg～320 mOsm/kg范围内；培养小鼠细胞的理想渗透压多在320 mOsm/kg左右。 （四）气相及pH 体外培养的细胞对气体环境也有一定的要求。多数细胞在培养时需要O的2存在，但O的分压多维持在略低于大气中的O分压的水平，这是因为过高的22 O分压会造成细胞的损伤。CO也是细胞培养所需要的，其与培养基pH值的维22 持密切相关，CO浓度的升高会引起培养基pH值降低。体外培养细胞时的气体2 环境常由95％的空气和5％的CO构成，针对培养对象的不同，CO的浓度常在222％～10％之间变化。 适宜大多数细胞生长的培养基pH多维持在7.0-7.4之间，而细胞在培养过程中 会造成培养基pH值的迅速下降，很不利于细胞的所释放出的代谢产物尤其是CO2 继续生长。为了尽可能长时间的将培养基的pH值稳定在适当范围，常借助CO2－碳酸氢盐缓冲体系或有机缓冲体系（如HEPES）来解决这一问。下面的反应 式可以用来说明CO-碳酸氢盐缓冲体系的作用原理。 2 + -NaHCO + HO ?? Na+ OH + HO+CO? 3222 上式说明，只要维持CO的浓度处于一个相对恒定的状态，上述反应就会2 -保持平衡，此时培养基中的OH的浓度也就会相对稳定，换言之，培养基的pH也相对恒定。同时，这也是为什么在培养细胞时要维持一定浓度CO的重要原2因之一。 （五）无毒无污染 体外培养的细胞必须生长在无毒无污染的环境中，这时因为体外生长的细胞 一般情况下对有毒有害物质无任何解毒能力，抵抗力也极差。细胞毒性物质的存 在常会导致培养细胞的死亡。 除有毒化学物质的污染危害外，细菌等微生物的污染，以及不同细胞间的交 叉污染也是细胞培养时必须要避免的事情。可通过严格的过滤除菌或灭菌处理， 并使用抗生素来降低污染的发生机率。在细胞培养中最常使用的抗生素是青霉素 （常用浓度是25µg/ml ～100µg/ml）与链霉素（25μg/ml ～100μg/ml）。 不同类型细胞间的交叉污染主要由操作不当引起，在对不同细胞进行操作时 应避免使用同一瓶培养基或使用同一个吸管。 第二节 培养细胞的生物学特性 一、体外培养细胞的分型 体外培养细胞时，主要有两种培养体系：一种是贴附依赖型，一种是悬浮型。 （一）贴附依赖型 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖型细胞，依据培养细胞在体外的形 态大致可将其分为以下四种类型。 1．上皮细胞型 细胞多呈扁平不规则多角形，中央有圆形细胞核，细胞彼 此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少 单独行动。此型细胞多起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管 上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如，来源于人类胚肾的HEK293细胞，来源于人类肝脏组织的HEPG2细胞，来源于人类子宫颈的Hela细胞就属此类。 2．成纤维细胞型 胞体多呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形细胞核， 呈放射状生长。除真正的成纤维细胞外，起源于中胚层间充质的组织的心肌、平 滑肌、成骨细胞、血管内皮等均呈本型形态。另外，也常将一些与成纤维细胞形 态类似的培养细胞归为此类。常见的成纤维性细胞如源自小鼠胚胎的NIH 3T3、小鼠结缔组织的L929、中国仓鼠卵巢的CHO、叙利亚地鼠肾脏的BHK-21等。 3．游走细胞型 多呈散在生长，一般不连成片，具有活跃的游走或变形运 动能力，且方向不确定。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞进行严格区别。 4．多型细胞型 一些细胞，如神经细胞由于难以确定其稳定的形态，常归 于此类。 （二）悬浮型 有一些类型的细胞在体外培养时不需要贴附，而是悬浮生长。这些细胞的胞 体常呈圆形，多见于一些造血系肿瘤细胞，其特点是生长速度较快、传代方便。 常见的U937 、HL60、K562造血系肿瘤细胞均属此类。 二、体外培养细胞与体内细胞的差异 细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏 动态平衡的相对稳定环境中，体外培养的正常细胞已成为一种在特定条件下生长 的细胞群体。它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也出现了一些不 同于机体细胞的性状，主要表现在：?失去原有组织结构和细胞形态。如，体外 培养的肌肉细胞表现出纤维化的特点；?分化减弱或不显，出现类似“返祖”现象（去分化），细胞的形态功能趋向单一化，或在生存一定时间后衰退死亡；?发 生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系，或变成具有恶 性性状的细胞群。 三、培养细胞的生长特点 （一）贴附 大多数哺乳动物细胞在体外生长时需附着在一定底物如塑料、胶原、玻璃或 其他细胞做成的饲养层细胞上才能生长、分裂。贴附之前的细胞一般为球体样， 在一些特殊的能促进细胞贴附的物质如?型胶原、血清扩展因子的帮助下，细胞 先吸附到底物上，随后与底物附着并伸展成一定的形状。 不同细胞的贴附能力不同，如巨噬细胞、成纤维细胞等的贴附能力较强，能 在数min至数10min内贴附到固相表面；而神经元、羊水细胞等的贴附能力则 较弱，一般需要数h乃至更长的时间才能贴附到固相表面。 （二）接触抑制与密度依赖性 对于相当一部分体外培养的贴附细胞来说，随着细胞不断的生长与分裂，当 相邻两个细胞彼此靠近时，其中之一或两个细胞便会停止移动而不至于重叠起 来，转而朝向未生长有细胞的空间生长，这种现象被称为接触抑制（contact inhibition）。而进一步的生长会使细胞密度变得越来越大直至形成一个细胞单层， 在此过程中，细胞与培养基接触的面积也会因此而减少，此时，细胞的分裂便会 停止，但细胞还会存活一段时间，这种现象被称为密度抑制（density inhibition）或密度依赖性。通常，细胞的这种密度依赖性与培养基中血清的浓度关系密切。 与体外培养的正常细胞不同，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的接触抑制特性降 低或丧失，导致细胞重叠生长。同时，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的密度依赖性 调节也常常降低，对血清的依赖性也降低，可以生长到一个较高的终末细胞密度。 四、体外培养细胞的生长过程 体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到 一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传 代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。 加之很多细胞特别是正常细胞，其在体外的生存也不是无限的过程，这就使得细 胞在体外培养时的生长过程与体内有着一系列不同的生存特点。 （一）培养细胞的生命期 培养细胞生命期（life span of culture cells）是细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本一致。体外培养细胞 的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况密切相关。比如，来源自人 胚的二倍体成纤维细胞可在体外连续传代30～50代，约150～300个细胞增殖周期，相当于一年左右的生存时间。相比之下，那些来自成体或衰老个体的细胞的 生存时间则较短，如体外培养的肝细胞或肾细胞一般仅能传几代或十几代。 通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为三个阶段。 1．原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到 第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂， 但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很 大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养 基培养时细胞集落形成率很低。 2．传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代 培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进 入衰退期。 3．衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖， 直至最后衰退死亡。 以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤 细胞而言，永生性（immortality）或恶型性（malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line） 或连续细胞系（continuous cell line）。 （二）培养细胞的一代生存期 所谓培养细胞的“一代生存期”，是从细胞接种后到再次传代培养之前的这 一段时间，它与细胞世代（generation）或倍增（doubling）时间不同。例如，某一细胞系为第60代细胞，即指该细胞系已传代了60次。就培养细胞的一代生存期而言，细胞通常可以倍增3～6次。 培养细胞的一代生存期，一般可被分为三个阶段。 1．潜伏期 以贴壁生长的培养细胞为例，刚刚经历传代接种的细胞，常在 培养基中呈现悬浮状态，此时细胞的细胞质回缩，胞体呈圆球形。紧接着，悬浮 细胞便会贴附于底物表面上，此过程称贴壁。各种细胞贴附速度并不相同，这与 培养细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。待细胞贴附于支持 物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细胞进入生长和增殖期还有 一定时间，称为潜伏期（latent phase）。细胞潜伏期的长短与细胞接种密度、细 胞种类以及培养基性质等密切相关。通常，原代培养细胞的潜伏期较长，约需 24～96h或更长时间，而连续细胞系和肿瘤细胞的潜伏期则较短，仅6～24h。另外，细胞接种密度大时潜伏期常会变短。 2．对数生长期 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结 束和对数生长期（logarithmic growth phase）的开始。对数生长期是细胞增殖分 裂最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量的多少常作为判定细胞生长旺盛与 否的一个重要标志，一般用分裂指数（mitotic index，MI）来表示：分裂相在整个细胞群中所占的百分比。体外培养细胞的分裂指数受细胞种类、培养液成分、 营养条件、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数多介于 0.1%～0.5%之间，原代细胞分裂指数较低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高 达3%～5%。对数增生期是细胞一代生存期中活力最好的时期，因此是进行各种 实验最好的和最主要的阶段。 3．停滞期 当细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期 （stagnate phase）。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（plateau phase）。处于此期的细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，但随着培养液中营养渐趋耗尽，代 谢产物的积累、pH值的降低，此时需要进行及时的传代培养，否则细胞会因营 养匮乏、中毒等原因，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。 第三节 原代培养与传代培养 一、原代培养 将动物机体中待培养组织从机体中取出，然后用各种消化性酶（如胰蛋白酶） 消化，或用机械处理，将组织分离成单细胞，最后添加适当的培养基培养， 使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养的细胞由于其和 机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近，常被用作药理实验重要的研究材料。 （一）所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、普通光学显微镜、 吸管、废液缸、培养瓶、平皿、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、水浴锅 （37?）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有20％的FBS）、Hanks液、75%酒精溶液、碘酒等。 培养对象：新生小鼠的肝细胞。 （二）操作步骤 1．胰蛋白酶消化法 （1）将新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3s，再用碘酒消毒腹部，用 纱布将小鼠包裹后带入超净台内，解剖取肝脏，放入一玻璃平皿中。 （2）用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物，然后用 3大小的组织块，再用Hanks液洗三次。 手术剪将肝脏剪成1mm （3）将组织块转移至一小青霉素瓶中，视组织块的多少加入5～6倍体积的0.25% 37?预温的胰蛋白酶消化液中消化。 （4）待大部分细胞被消化成为单细胞后，加入3～5ml培养液及时终止胰酶的消化作用。 （5）将上述细胞悬液转移至一离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清液。 （6）加入Hanks液5ml，重悬细胞，然后重复上一步骤。 （7）加入1～2ml培养基重悬细胞，血球计数板计数细胞密度。 5（8）在细胞计数的基础之上，利用培养基将细胞密度调整到5×10个/ml左右，然后将细胞悬液转移（分装）至相应大小的细胞培养瓶中，置细胞培养箱 中37?培养。 2．组织块法 （1）第1、2步与胰酶消化法相同。 （2）将用Hanks洗涤后的组织块直接转移到培养瓶，贴附在培养瓶的底面 （凹面，生长面）。 （3）将培养瓶翻转，使培养瓶的生长面朝上，然后加入适量培养基至瓶中， 应避免培养液与组织块接触。 （4）将培养瓶小心转移至细胞培养箱中，37?静置2～3h，然后轻轻翻转培养瓶，使培养瓶的生长面组织浸入培养液中（勿使组织漂起），继续培养。 3．注意事项 （1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件，细胞计数可在有菌环 境中进行。 （2）75%酒精泡消毒的时间不宜过长，以免酒精从口和肛门浸入小鼠体内。 （3）待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除，便可收获细胞或进行 传代培养。 （4） 胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力 等因素密切相关，另外在消化过程中应密切观察，及时吹打，避免消化过度。 二、细胞传代培养 当细胞在培养瓶长成致密的单层后，通常已经没有足够的生长空间和营养条 件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长，同时使细胞的数量扩大， 就必须进行传代再培养。同时，传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，也 是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。通常，悬浮型细胞可通过直接补充培 养基后再分瓶的方法进行传代，方法相对简单，而贴壁细胞则需经消化后才能分 瓶培养。 （一）所需设备与试剂 超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、吸管、废液缸、 培养瓶、移液管、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细 胞培养基（添加有10％FBS）、Hanks液等。 （二）操作步骤 1．贴壁细胞的传代培养 （1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 （2）加入1～2ml 0.25％胰酶溶液，使所有细胞都能被浸入到溶液中，室温 或37?消化。 （3）利用倒置显微镜或肉眼观察细胞的消化状况。随着时间的推移，原本 贴壁的细胞会逐渐变圆，并开始脱落。 （4）待到消化充分后，及时加入10ml Hanks液终止消化。 （5）用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，转移至一离心管中，1000rpm，离 心5min，弃上清液。 （6）用10～15ml新鲜培养基重悬细胞，并将其分装到两至三个培养瓶中， 37?下继续培养。 （7）过夜观察细胞的贴壁及生长状况。 2．悬浮生长细胞的传代培养 悬浮生长细胞的传代培养要比贴壁细胞简单 得多，通常有两种方法。 （1）直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基，然后将进行分装。 （2）先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基，然后再用适量的新鲜培养基重 悬细胞沉淀，最后将其分装至培养瓶中即可。 3．注意事项 （1）传代的比例取决于细胞的生长状态、生长速度以及实验的目的要求等 因素，通常按照1：2或1：3的比例进行传代。 （2）避免消化过度。 三、附录 （一）胰蛋白酶消化液的配制 2+2+、Mg精确称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml不含Ca的Hanks液溶解，滤器过滤除菌，4?保存。 胰酶溶液中也可加入EDTA，其终浓度为0.02％。 （二）Hanks液的配制 KHPO 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，NaHPO?HO 2432420.06g，酚红0.02g，加HO至 1000ml，过滤除菌或高压灭菌，分装后4?保存。 2 （三）血清的灭活与融化 1．血清的灭活方法 （1）将水浴锅的温度设置在56?，待水温恒定后将血清瓶放入到水浴锅中， 勿使瓶子倒置和淹没在水中。 （2）待水温重回56?后，计时灭活30min，每隔10min轻轻晃动血清瓶。 （3）无菌分装，-20?冻存 （4）注意：?灭活时间不要超过30min；?灭活后的血清外观会发生改变； 2．灭活后血清的融化 （1）将水浴锅的温度设置在30?。 （2）从冰箱取出冻存的灭活血清，室温条件下先放置10min。 （3）将分装有灭活血清的瓶子放入到30?水浴锅中，勿使瓶子倒置和淹没 在水中。每10min轻轻晃动瓶子有助于使其均匀融化并减少沉淀的形成。 （4）待其完全融化后，按一定用量将其加入到相应的培养基中。 （5）注意：?有人选择37?融化血清，但一般而言，温度越高，营养成分 降解得越厉害；?灭活后的血清不宜反复冻融。 第四节 细胞系或细胞株的建立、鉴定、管理 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为 该细胞系的亚系（subline）。从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆 进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培 养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 一、细胞建系的一般程序 细胞建系的一般程序包括原代培养、第一次传代、常规传代、冻存与复苏等 过程。所涉及的原代培养、第一次传代、常规传代、冻存与复苏等过程的具体方 法与常规的原代培养等技术并无二样。 相对于那些只需要提供供体性别、年龄、取材部位、组织种类以及几项简单 指标的仅用作原代培养的细胞而言，对于用于建系的细胞通常有以下一些要求： （一）细胞的组织来源 应详细说明细胞供体所属物种、供体的年龄、性别、取材的器官或组织，如 系肿瘤组织，还应说明临床病理诊断结果，组织来源以及病例号等。 （二）培养条件和方法 各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明适合该细胞系生长的培 养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH值等。 （三）细胞生物学检测 这部分工作常放在对细胞系的鉴定这一环节进行。 二、对已建立细胞系的鉴定、管理 （一）对已建立细胞系的鉴定 要求能提供细胞的一般和特殊的生物学性状指标。一般特性指标包括：细胞 的一般形态、特异性结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率、染色 体分析、同工酶检查、DNA指纹图谱等。 1．对正常细胞系的鉴定 对正常细胞系的鉴定主要围绕以下四个方面进行： ?鉴定细胞的种系来源：常用方法主要有染色体分析、同工酶分析、DNA指纹图谱等技术；?鉴定细胞的组织来源：可通过形态学手段、检测组织特异性抗原 等进行鉴定；?细胞是否发生转化和恶变：主要通过核型分析、细胞生长行为观 察（是否丧失接触抑制）、裸鼠成瘤实验等进行鉴定；?细胞有无发生交叉污染， 主要通过同工酶及DNA指纹图谱技术进行鉴定。 2．对肿瘤细胞系的鉴定 对肿瘤细胞系的鉴定主要围绕其恶型性展开，染 色体的异常、接触抑制和密度依赖生长特性的改变、集落形成能力、裸鼠成瘤、 动物体内的侵袭生长，以及某些基因、分子水平的特征均是肿瘤细胞鉴定的方向。 （二）已建立细胞系的管理 对已建立的和经过鉴定的细胞系，一般除保留在建立者的实验室外，为了科 研交流的方便和保证细胞系的稳定性，国际上通行的惯例是将其保存在细胞库 中。在国际上，美、英和日本等国已建有细胞库。其中，美国的ATCC（american type culture collecion）作为美国国立癌症研究所（NCI）和美国卫生研究所中（NIH）的细胞资源库，是世界卫生组织（WHO）的国际培养细胞文献中心。 同时，ATCC不仅是美国也是世界上最大的细胞库，现存细胞系超过数千种。 ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者 或实验室免费提供研究用细胞。ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库， ATCC入库细胞时所要求的基本检测项目主要有：?培养简历：组织来源日期、 物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等；? 冻存液的组成；?细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性；?培养液： 培养基的名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量；?细胞形态；?核型： 二倍体或多倍体，有无标记染色体；?无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、 原虫和病毒等；?物种检测：检测同工酶，主要为G6PD（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）和LDH（乳酸脱氢酶），以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测；?免疫 检测：一两种血清学检测；?细胞建立者相关信息：包括建立者、检测者姓名等。 此外，对于已建立的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称。细胞的命名无 严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。以下列举几种代表性的 细胞名称以供参考：如HeLa：为供体患者的姓名缩写；CHO：中国地鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary），为英文单词的首位字母组成；宫-743：意为1974 年3月建立的宫颈癌上皮细胞；NIH3T3：美国国立卫生研究所（NIH）建立， 5细胞／毫升。 每3天传代，每次接种3×10 除美国的ATCC（网址：）之外，欧洲细胞培养物收藏中 心 (ECACC)也是重要的细胞库，建立于1984年，其网址为：。 第五节 培养细胞的生物学特性分析 一、培养细胞的常规观察 培养细胞在体外的生长过程是一个动态的连续过程，细胞的数目、形态以及 培养基的颜色、澄明度等在一定程度上都是细胞生长状况的表现。借助于肉眼或 显微镜的帮助，通过对上述常规指标的观察，可以有效地帮助我们及时把握细胞 的生长信息，适时、适当采取相关措施培养好细胞。 （一）培养基的观察 培养基的颜色和澄明度是肉眼观察的两个重要指标。新鲜的培养基一般呈现 桃红色，pH约为7.2～7.4，培养过细胞后的培养基由于含有大量细胞代谢产物 而使得pH降低，颜色也逐渐变黄。培养基颜色的这种变化是由其所含有的酚红 指示剂来显示的，酚红会随溶液的pH变化而改变颜色，成为指示培养基pH的 最直观指标。培养基颜色变黄是细胞需要更换培养液的信号。一般情况下，大多 数细胞需要每2～3天换液一次。需要注意的是，如果细胞在换液或传代后培养 液很快就会变黄，这可能是细菌污染或培养瓶不干净造成的。 正常情况下，无论颜色如何变化，培养基都能保持澄明。一旦发现培养基变 混浊，就应注意是否有污染发生。上述情况多适用于贴壁生长的细胞，对于悬浮 生长的细胞来说，随着细胞密度的升高，培养基也会在一定程度上变浑，判断其 是否污染应结合溶液颜色变黄的速度、细胞增殖的速度、显微镜下是否可观察到 污染以及其他一些方法进行判断。 （二）显微镜检查 利用光的衍射与干涉原理制造的相差显微镜是观察透明活细胞的最佳工具， 可以清晰地帮助我们看到生活状态下细胞的形态结构特点，并动态观察和记录细 胞的附着、贴壁、伸展、移动、分裂等过程。 在不具备相差显微镜的实验室，普通的倒置显微镜也不失为一种好的观察工 具。生长状况良好的细胞在倒置显微镜下观察时较为明亮、折光性也强，细胞的 轮廓不清但形态规则。生长状况不佳的细胞在倒置显微镜下观察时折光性变弱、 轮廓变得清晰，细胞形态也变得不规则，细胞间的间隙变大，细胞中常出现颗粒 样物质，情况更严重时，还可见到脱落死亡的细胞增多。 二、细胞活力测定 （一）台盼兰染色测定细胞活力 死细胞和受损细胞的细胞膜通常因缺损而不完整，这样某些染料分子便可穿 过细胞膜进入到细胞内部并使细胞被染上相应的颜色。与死细胞和受损细胞不 同，活细胞的细胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞而拒染（dye exclusion）。 台盼兰便是这样的染料，经台盼兰染色的死细胞或受损细胞常为浅兰色。除台盼 兰外，伊红、苯胺黑也是常用的鉴定细胞活力的染料，所不同的是，经伊红和苯 胺黑染色的死细胞或受损细胞分别为红色和黑色。 1．仪器、用品与试剂 血细胞计数板、显微镜、微量加样器、0.4%台盼兰 溶液（用PBS溶液配制）。 2．操作步骤 （1）将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后再经Hanks液洗涤后制备单细胞悬液， 6并适当调整细胞密度在10个/ml左右。 （2）取细胞悬液0.5ml加入一小试管中，加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2～3min。。 （3）用微量加样器吸取少量细胞悬液加入到血细胞计数板上的小室中。 （4）显微镜下计数500个细胞，分别数出死细胞和活细胞数目，计算细胞 活力。 （5）结果判定：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见其为浅兰色的细胞， 活细胞不能被染色，镜下呈无色透明状。 细胞活力（％）＝（总计数细胞数－着色的死细胞数）?总计数细胞数×100％ 3．注意事项 （1）和台盼兰溶液混合后的细胞悬液不可放置时间过长，因为活细胞对染 料也有一定摄取能力，若时间太长，活细胞也会被染色。 （2）细胞悬液和台盼兰溶液的用量可根据实验条件及要求进行必要调整。 （3）血细胞计数板用完后要及时用双蒸水、70％酒精认真清洗计数板和盖 玻片并用擦镜纸擦干后保存。 （二）MTT法测细胞相对数目和相对活力 四唑盐比色实验是一种常用的检测细胞存活与生长状况的方法，实验所用之 显色剂是一种能接受氢原子的染料，化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称MTT。活细胞，特别是增殖期的细 胞可通过线粒体代谢过程中产生的的琥珀酸脱氢酶的作用，使外源性淡黄色的四 甲基偶氮唑盐（MTT）被还原为蓝紫色的结晶物（formazan）并沉积在细胞中， 其形成量与活细胞数呈正相关。利用DMSO或酸化异丙醇进一步溶解细胞中的 紫色结晶物formazan，在酶标仪或分光光度计下测定570nm波长处的光吸收值， 可间接反映出活细胞数量的变化情况。 1．仪器、用品与试剂 超净工作台、酶标仪、微量加样器、RPMI 1640培养基（添加10％FBS）、96孔细胞培养板、细胞培养箱、恒温摇床、5mg/ml MTT溶液、酸化异丙醇（给异丙醇中加入HCl使最终达0.04 mol/L）或纯的DMSO。 2．操作步骤 （1）接种细胞：取对数期生长的贴壁细胞经消化、洗涤后以一定密度接种 在平底96孔板上, 每组设3个平行孔，每孔200μl。 （2）培养细胞：将96孔板移入细胞培养箱，在37?、5％CO、饱和湿度2条件下培养。 （3）呈色：至收获前4h每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml），继续孵育4h后终止培养，从每孔小心吸弃上清液100μl，再加入DMSO 150μl，置酶联免疫检测仪上振荡10min，以使结晶物充分溶解。 （4）比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值， 记录结果。 3．注意事项 （1）设空白对照。空白对照为不加细胞只加培养基，其他步骤与实验组相 同，比色时以此孔调零。 （2）依据实验目的、细胞种类、细胞的生长习性选择适当的细胞接种密度 5个细胞，和培养时间长短。一般情况下，96孔细胞培养板每孔最多可以生长1×10切不可接种密度太高，致使培养终止前细胞过满，影响实验的区分度。 （3）高浓度的血清会导致实验本底增加，应尽量选择不超过10％ FBS的培养条件。 4．附录 5mg/ml MTT溶液的配制：准确称取MTT 0.5克，溶于100 ml的0.01 mol/L pH值7.4的PBS溶液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，4?下保存，两周内有效或-20?冻存。 三、细胞的分裂指数 分裂指数是衡量体外培养细胞生长增殖状况的重要指标，常用细胞群体中分 裂细胞所占的百分比来表示。分裂指数是测定细胞周期的一个重要指标，与生长 曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 同时，分裂指数也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 （一）仪器、用品与试剂 超净工作台、细胞培养箱、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片、吸管、细胞 培养基（如添加有10％ FBS的RPMI1640）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、PBS溶液。 （二）操作步骤 1．将消化、洗涤后培养细胞以一定密度接种至内含盖玻片的培养皿中。 2．置细胞培养箱中培养48h，使细胞贴附在盖玻片上生长。 3．取出盖玻片，按下列顺序操作：PBS漂洗3min?固定液（甲醇：冰醋酸=3：1体积比）固定30min?Giemsa染液染色10min?自来水冲洗。 4．待盖玻片晾干后将其反扣在载玻片上，镜检。 5．计算结果：分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100% （三）注意事项 1．操作时动作要轻，以免使盖玻片上的细胞脱落。 2．细胞接种密度、培养时间有细胞的种类及生长习性决定。 （四）附录 Giemsa染液配制： （1）Giemsa原液的配制：称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml），56?中保温90-120min后再加入33ml甲 醇，置棕色瓶中保存。 （2）使用时按要求用PBS稀释，常用的稀释比例为1：10。 四、集落形成实验 集落（克隆）形成实验是检验细胞存活率和增殖能力的有效指标。集落或克 隆是指单个细胞在体外经6代以上增殖后所形成的细胞群体，直径大小常在 0.3-1.0mm左右。正常细胞在体外培养时由于常需附着在坚硬的玻璃或塑料表面 才能生长，而转化的或恶变的肿瘤细胞却常常丧失附着依赖生长的特性，可在软 琼脂或甲基纤维素中以集落的方式生长。通过对集落的计数，不仅可以了解细胞 的生存增殖能力，而且还可用于评价肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性、肿瘤放射 生物学研究。 常用的集落形成实验主要有平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验，此处 主要介绍软琼脂集落形成实验。 （一）仪器、用品与试剂 超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、24孔细胞培养板、吸管、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶 消化液、琼脂粉等。 （二）操作步骤 1．制备细胞悬液：取对数期生长贴壁细胞经消化、洗涤后用培养基根据实 验要求稀释调整细胞密度，待用。 2．制备底层琼脂：用三蒸水配制5%的琼脂，高压灭菌后待温度降至50?，加入预温的9倍体积培养基稀释，混匀后迅速给24孔培养板每孔中加入0.8ml，室温凝固琼脂。 3．制备上层琼脂：取0.6ml保温于50?的5%的琼脂与9.6ml细胞悬液迅速混匀后立即加入到铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，室温凝固琼脂。 4．将培养板置细胞培养箱中培养7～14天。 5．倒置显微镜下计数集落数目，按下面公式计算结果。 集落数＝n个孔的细胞集落数总和?孔数（n） 集落形成率＝（集落数?接种细胞总数）×100％ （三）注意事项 1．制备琼脂凝胶时尽量避免气泡和局部结块的产生。 2．琼脂与完全培养基混合温度不要超过50?，与细胞悬液混合时的温度不 要超过40?，以免降解培养基的营养成分和损伤细胞。 五、细胞生长曲线的绘制 生长曲线是测定细胞生长基本规律的重要指标，常通过每日或隔日连续计数 细胞来绘制。广泛用于比较和评价各种药物、营养条件对细胞生长的影响。 （一）仪器、用品与试剂 超净工作台、细胞培养箱、显微镜、血细胞计数板、培养板或培养瓶、微量 加样器、细胞培养基（如添加有10％ FBS的RPMI 1640）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、0.4%台酚兰溶液等。 （二）操作步骤 1．取旺盛生长（对数期）的细胞，经胰蛋白酶消化、洗涤、计数后，以一 定密度准确接种在不同组别的培养瓶或培养板中。 2．每隔24h或48h，取样3瓶（孔）细胞消化后用血细胞计数板计数细胞 密度，结果取其均值。连续计数7-10天。 3．以培养时间为横坐标，细胞密度为纵坐标绘制生长曲线。 （三）注意事项 1．接种细胞的密度取决于细胞的生长特性和培养时间的长短。通常，所接 种的细胞密度不宜太大，否则细胞很快就会进入增殖稳定期，短期内就的进行传 代，所得曲线不能准确反映细胞的生长情况。 2．一般需在培养3～5天后给为计数的细胞统一进行换液。 3．生长曲线作为一种常规方法的缺陷是数值不够精确，对细胞生长规律的 准确评价需结合其他方法进行，利用MTT法测定生长曲线就是一种较好的选择。 六、细胞周期的测定 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间，即从一次细胞分裂结束到下一次分 裂结束所经历的时间，它反应了细胞增殖速度。测定群体细胞周期的方法很多， 主要有同位素标记法、细胞计数法、流式细胞仪测定等。这里主要介绍利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可代替胸腺嘧啶核苷掺入到所 复制的DNA新链中，经过一轮复制，在每条染色单体的一条DNA链均含有BrdU，但经染色后染色体却仍为深染。经过两个细胞周期后，细胞中两条单链 均含BrdU的DNA将占总数的l/2，反映在中期染色体上表现为其中的一条单体 浅染。但若经历了三个周期，则约一半的染色体的两条单体均浅染，另一半为一 深一浅。这样，通过统计分裂相中各期的比例，就可算出细胞周期的值。 （一）仪器、用品与试剂 超净工作台、细胞培养箱、显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、移液管、离心 机、离心管、30W紫外灯、水浴锅、饭盒、擦镜纸、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有10％ FBS）、Hanks液、BrdU（1.0mg/ml）溶液，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液等。 （二）操作步骤 1．取对数期生长的细胞经消化、洗涤后以一定密度种植在培养瓶或培养板 中。 2．细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。 3．培养44～54h加入秋水仙素，终浓度为0.1μg/ml。 4．继续培养4～6h后，常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细 胞也要收集到离心管中。 5．按照常规染色体制备方法制片。 6．染色体玻片（有细胞一面向下）放在一饭盒中的玻璃支架上，加入2×SSC 液以不超过标本表面为宜，然后在标本上覆盖一张擦镜纸，使纸的两边浸入 2×SSC 液中，以保持标本的湿润。 7．将饭盒放在56?水浴锅中，湿育，上面用30w的紫外灯管6-10cm垂直照射30min。 8．弃去2×SSC液和擦镜纸，立即用4?左右的流水冲洗。 9．Giemsa液染色5-10min，流水冲洗，干燥后镜检。 10．镜检100个分裂相，统计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 11．根据下式计算细胞周期 细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（h） （三）注意事项 1．秋水仙素的加入时机会因细胞的类型、生长速度有所差异。 2．加入BrdU后应避光培养。 （四）附录 1．BrdU的配制： 称取BrdU 10mg，无菌条件下溶于灭菌生理盐水中，定 容10ml，4?下避光保存，宜现用现配。 2．2×SSC溶液的配制：NaCl 1.75g，柠檬酸三钠?2H2O 0.885g，加水至100ml，4?保存。 第六节 细胞的冻存与复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。 冻存的温度一般用液氮的温度为－196?，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂 （一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液 氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入45?水中，使之在1min内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存时保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都 对细胞活力有影响。 一、细胞的冻存 （一）仪器、用品与试剂 细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80?超低温冰箱、离心机、冻存管、 离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。 （二）操作步骤 1．取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。 给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37?消化细胞。 2．待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。 3．700～800rpm (约200g)离心5min，收集细胞沉淀。 64．加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×10个/ml。 5．将上述细胞悬液分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、 冻存日期等内容。 6．置4?普通冰箱中预冷30min。 7．将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80?超低温冰箱过夜。 8．次日将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、 名称等信息。 （三）注意事项 1．冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24h内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2．冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更 高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3．最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定 冻存效果。 4．DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出 的液氮冻伤。 二、细胞的复苏 （一）仪器、用品与试剂 37?水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、 废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。 （二）操作步骤 1．准备工作：开启恒温水浴锅，将温度调节在45?。 2．从液氮罐中取出冻存管，立即放入水浴锅中摇晃，快速融化冻存液。 3．用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。 4．打开冻存管，将冻存液转移到预先加入有培养基的离心管中，700-800rpm离心5min。 5．小心弃掉上清，加入5ml左右培养液重悬细胞。 6．将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。 （三）注意事项 1．冻存液融化要迅速。 2．洗涤的次数可适当增加，以尽可能去除冻存液成分的残留。 3．离心速度不宜太高，避免对细胞的损伤。 第七节 细胞培养的基本操作规程与细则 一、常用设备 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置 未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。 二、配液室的设备 扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液时搅拌溶液准备室的设备）。 培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯、紫外灯或电子灭菌灯、空气净化器 系统、低温冰箱（-80?）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（写实验记录）。必须 放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4?冰箱（放置serum和培养用液）。 三、无菌操作 （一）无菌室的灭菌 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台 等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射 3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30min 4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微 镜的载物台。 （二）实验人员的无菌准备 1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 3.用75％酒精棉球擦净双手。 （三）无菌操作的演示 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75％酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火焰灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火焰。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到 废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 四、器械的清洗和消毒 （一）玻璃器械清洗消毒： 一）新玻璃器皿的清洗消毒： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12h以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干：12h后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净 后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（即酸液：重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12h，然后从酸缸中捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒20-30min，烘干。 二）旧玻璃器皿的清洗消毒： 1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中， 泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12h后从酸缸内捞出器皿立即 用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以 便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒20-30min，烘干备用。 （二）金属器械洗消 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后 用75％酒精擦拭，再用自来水，蒸馏水冲洗，烘干或空气中晾干。放入铝制盒 内包装好高压消毒30min，烘干备用。 （三）橡胶和塑料 橡胶和塑料制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水 和蒸馏水冲干净，烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1. 针式滤器帽不能泡酸液，用NaOH泡6-12h或者煮沸20min，在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一 些，放入铝盒中在高压消毒30min，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应 该立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用2％NaOH溶液煮沸30min（用过的胶塞只要用沸水处理 30min），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30min，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12h，自来水 洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30min，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘 干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4. 胶头可用75％酒精浸泡5min，然后紫外照射后使用即可。 5. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用75％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下 消毒。 为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后作好标记。 （四）注意事项 1. 严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水， 以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。 检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 2. 安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起 不到过滤的作用。 3. 注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液 溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。 五、细胞培养用液的配制与消毒 （一）器材与试剂 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 （二）水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双 蒸水、三蒸水或纯净水 （三）PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4?H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容 量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽， 并插上针头放入高压锅内8磅消毒20min。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充 蒸发掉的水份。 （四）胰蛋白酶溶液的配制与灭菌 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或 者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用 时间有关，在pH为8.0、温度为37?时，胰酶溶液的作用能力最强。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶 入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4?内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20?保存以备使用。 （五）青、链霉素溶液的配制与消毒 1.所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20min灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。 （六）RPMI1640培养液的制备与消毒： 1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶 解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链 霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐 酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。 2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤 器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作 台内过滤。 4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4?冰箱内待用。 （七）HEPES溶液： HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时 间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4?保存。 注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况 灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 （兰州大学 岳凤珍， 复旦大学 刘晓宇）