课题申报书-卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin)表达及与CA125的功能关系

课题申报书-卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin)表达及与CA125的功能关系 分子生物学省重点实验室 妇科学博士点 **省自然科学基金资助项目 申请书 卵巢上皮性癌的间皮素(Mesothelin)表达及与CA125的功能关系 项目名称 生命 C030304 所属学科 学科代码 *** 申 请 人 医科大学 申请单位 通讯地址 邮政编码 教育厅 归口单位 合作单位 申请时间? 2005年 06月 10 日 填 写 说 明 一、填写前要认真查阅省自然科学基金管理的有关规定。内容表达要明确、严谨，字迹要清晰，空格不够时可另加页。使用外来语要同时用中文表达。首次出现的外文缩写标明外文全称。 二、“学科”分7大类，即?数理、化学、生命、地球、材料与工程、信息、管理。填写时要按照主要研究内容确定所属学科，并填写学科代码。如难以界定的可同时填写两个学科及代码，但仍以前一个为主，禁止同一研究内容同时多学科申报。 三、项目名称限制在30个汉字以内，关键词最多不超过30个汉字长度。“预期水平”栏中选择国际领先、国际先进、国内领先、国内先进之一。类别?按申报项目性质在属纯基础和应用基础中选择。 四、申请者必须是所在单位实际主持本研究工作的首席研究人，只能一名，工作稳定，有研究、组织能力，时间上有保证。参加人为实际从事本研究工作的人员，顾问等指导性工作人员不列入其中。青年专项基金项目负责人，实足年龄在35岁及以下，项目组成员主要是年轻人。 五、项目申请人和项目组成员在研省基金项目已满两项的，不再受理其新申请项目。 六、项目经费限于本项目研究工作直接需要的开支，实事求是，勤俭节约。应充分利用已有条件和可以利用的协作条件，多渠道积极争取经费。 七、使用基金会办公室提供的录入系统填写申请书，由申请者所在单位审查、筛选后统一报基金会办公室，一式六份，其中原件一份。 一、简 表 项目名称 卵巢上皮性癌的间皮素(Mesothelin)表达及与CA125的功能关系 研究类别 应用基础 预期水平 国际先进 起至年月 2006年至2008年 研究内容:卵巢上皮性癌(卵巢癌)早期诊断困难，具长期在腹腔种植转移的生物学特征，是死亡率 最高的妇癌。我们用基因芯片分析了卵巢癌基因表达谱，发现间皮素(mesothelin, MSLN)是上调表达研 最为显著的可分泌分子。最新研究提示CA125是鼠MSLN的受体。因此，本课题拟用分子生物学和免究 疫组织学技术，分析MSLN在健康妇女血清和临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的表达，内探讨与CA125表达及定位的关系、与临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系，总结MSLN是否可作为卵容 巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物;MSLN是否可与CA125互补应用于卵巢癌的诊断和、 病情监测。用体外细胞黏附实验和裸鼠卵巢癌腹腔转移瘤模型，探讨MSLN与CA125在细胞的生长增创殖、黏附、腹腔种植和转移过程中的作用，揭示MSLN与CA125的功能关联性，为卵巢癌的腹腔生长新转移行为提供理论依据，并为抗卵巢癌腹腔转移治疗打下基础。2.创新点: (1)本课题组首次发现和点验证了MSLN在卵巢癌中极显著上调表达，并准备就其临床应用价值方面率先开始系统的研究。截止和本申请撰写时，国内外未见相关研究的报道。 (2)将MSLN的表达与CA125的表达相联系，试图发现意其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床实践提供价值很高的标志物，也将为研究MSLN和 CA125的功能开辟新的途径。 (3)本课题组根据最新的研究结果进行合理的科学推测，设计进行MSLN义 摘和CA125对卵巢癌细胞生长和黏附的影响的实验研究，并结合卵巢癌的独特转移规律，研究MSLN和要 CA125对卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞(表达MSLN)的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察 MSLN和CA125在体内对卵巢癌腹腔转移的作用。结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗 癌药提供理论依据，这一思路在国内外均未见报道，具明显的创新性。 关键词 卵巢上皮性癌;间皮素;CA125 项其 总人数 高级 中级 其他 博士后 博士 博士生 硕士 硕士生 目 3 1 2 0 1 2 2 组 中 性年年姓 名 职称 学位 专业 单位 项目分工 别 龄 月 申 *** 女 39 教授 博士 妇科 医科大学 项目设计 08 请 者*** 女 30 讲师 硕士 分子生物学 医科大学 动物实验 09 及** 女 27 讲师 硕士 细胞生物学 医科大学 实验 09 项 目 主 要 成 员 情 况 二、经费收入、支出(金额单位?万元) 金 年 额 度 2006 2007 2008 合计 来 源 申请省基金 3 2 1 6 单位自筹 1.省卫生其他 1 1 厅 渠道 拨款 2. 合 计 4 2 1 7 ? 省基金经费使用计划 预算支出科目 金额 计算依据 1.科研业务费(实验动植物购置和种植、养殖费， 计算、测试分析费，国内调研和学术会议费，业务用于数据分析、统计、日常消耗、2.8 资料、报告、论文印刷费，临时用工劳务费、必需参加学术会议和论文版面费等 的国际合作研究费) 购置细胞系、抗体、RNA干扰技术2.实验材料费(原材料、试剂、药品等消耗性物所用试剂、动物实验、分子生物学2.2 品的购置费，标本、样品采集加工费，运杂包装费) 实验和细胞培养 3.仪器设备费(专用仪器设备的购置费，运杂包 装费，自制专用仪器设备的材料、配件和外协加工0.7 ,,,仪器 费) 4.实验室改装费(根据研究工作需要所进行的实 验室简单改装) 5.协作费(外单位协作者承担研究工作所需经费) 6.管理费(经费自立的单位项目管理费不超过资管理费 0.3 助金额的5%，最高不超过0.5万元) ? 单位自筹及其他渠道拨款使用计划 省卫生厅经费主要用于实验材料的1万元 ? 需购买的主要仪器、设备 仪器、设备名称 规格型号 数量 产地 资金来源 ,,, 1,6 1 中国 省基金 三、立论依据(包括科学意义和应用前景～国内外研究概况～主要参考文献目录。纯基础研究～着重结合国际科学发展趋势～论述项目的科学意义,应用基础研究着重结合学科前沿～围绕国民经济和社会发展中的科技问题～论述其研究特色及应用前景) 90%的卵巢恶性肿瘤是卵巢上皮性癌(以下简称卵巢癌)，是妇科肿瘤领域内死亡率最高的疾病，5 [1年生存率长期徘徊在30%左右。随社会经济的发展和妇女生育率的降低，卵巢癌的发病率逐年上升，由于该病的治疗需要彻底的手术和后续长期的多个疗程的化疗和其它辅助治疗，给患者家庭和社会经济带来沉重的负担。卵巢癌有两个显著特点:一是早期诊断困难，75%的患者就诊时已到临床晚期，晚期患者的5年生存率仅20%，而早期则高达85%-90%;二是其具有独特的生长和转移规律，与其他实体瘤经由血液系统或淋巴系统转移至远处不同，卵巢癌长期在腹腔转移，癌细胞在腹膜间皮细胞黏附、种植并形成转移灶，最终由于腹腔广泛病灶累计网膜、胃肠道和肝脾等脏器而导致患者死亡。 卵巢癌的术前辅助诊断和病情监测的首选方法之一是血清CA125的测定。CA125是由单克隆抗体OC125识别的一种高分子量的糖蛋白，是近20年妇科领域应用广泛的生物标记物。85%的晚期卵巢癌血清CA125升高，并且与分期呈相关性。CA125还与人体卵巢癌的荷瘤量成正比，当彻底手术切除癌灶后，CA125明显下降或转阴，化疗奏效时，也使CA125下降。卵巢癌的治疗是长期的过程，术后应给予多个疗程的化学治疗(化疗)，治疗过程中根据肿瘤对化疗的敏感度及时调整治疗也很重要;此外，卵巢癌的复发率很高，CA125的阳性预测率高达90%，因此CA125也被用于病情监测。CA125是血清检测，故简便、经济、微创。 CA125的局限性也很多:?诊断的特异性不高，在很多生理状态和良性疾病时也可升高。晚期卵巢癌时，可结合临床表现易于鉴别，而早期时则难以区分。?早期病例阳性率低。临床实践中，由于卵巢位于盆腔深部，一般临床查体难于直接接触，早期发病无特异症状，患者通常是有明显的症状后方就诊，此时多已届临床晚期，所以寻找有价值的早期诊断方法是临床迫切需要的，而CA125难以满足这以要求。例如，英国的Ian Jacobs博士，分析了22 000位妇女的血清CA125，发现340例CA125升高，结合阴道超声，对41例超声异常的妇女实施了剖腹探查术，发现11例卵巢癌，但令人沮丧的是其中8 [2]例为临床晚期。早期卵巢癌CA125升高不到50%，这也是制约CA125做为早诊指标的因素。由此可见卵巢癌早期诊断困难之一斑。?15%的晚期卵巢癌CA125阴性。?部分复发卵巢癌CA125不升高，CA125的阴性预测率仅45%-55%。 综上，临床仍迫切需要敏感、特异的诊断和监测卵巢癌病情的经济、简便的指标，毕竟卵巢癌是威胁妇女生命的第一杀手。为这一目的，在2003年我们采用了高通量的DNA微阵列(基因芯片)技术，所用的cDNA微阵列含8000条人基因，分析了卵巢癌和正常卵巢的基因表达谱，结合生物信息学统计处理，进行了深入的数据分析和数据挖掘。与正常卵巢相比，发现了56条上调和23条下调的基因， [3]79条表达差异的基因中，间皮素(mesothelin, MSLN)的变化最为显著，在卵巢癌中显著上调表达。随后，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学对80例卵巢癌和11正常卵巢进行了MSLN的检测，初 [4]步验证符合芯片杂交的结果。 [5]MSLN是由单克隆抗体CAK1在间皮细胞、间皮瘤和卵巢癌中识别的抗原。MSLN的cDNA编码69 kDa多肽，糖基化后被蛋白酶水解为40 kDa和31 kDa的片段，40 kDa通过糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol)与胞膜相连，31 kDa脱落成可溶片段。我们检索了所有与MSLN有关的文献(43篇)，意外地发现，2004年3月最新的研究提示人CA125是鼠MSLN相应的受体，二者可能 [6]有某种功能关联。。尽管CA125用于临床已有20余年了，但其结构和功能始终是个谜一般的问题， [7]直到2001年CA125的结构才基本清楚，全长的CA125是由11 000个氨基酸构成蛋白质的核心结构， CA125蛋白质是由短的胞浆尾、跨膜功能区和巨大的细胞外糖基化的功能区构成。N-末端的胞外功能区的有N-和O-糖基化部位，由60余个串联的重复的模基(motif)组成，模基含156个氨基酸，主要是富含丝氨酸和苏氨酸的序列，正是这个功能单位和MSLN、OC125抗体和M11(识别CA125的B单 [7]位)抗体结合。C-末端，有跨膜部分和短的胞浆尾。CA125的释放是在胞浆尾的功能区经过丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸依赖的磷酸化后，经由细胞内质网和高尔基器释放到细胞外。在人体不同组织和体 [8]液有不同形式和大小的CA125。 通常细胞发生恶性转化时出现了新的表型及与之相随的分子改变，这些变化不仅使恶性细胞获得了与正常细胞不同的生长特性，也为我们寻找新的肿瘤诊断标记物和新的药物作用靶提供了线索。目前科学界公认卵巢癌(上皮癌)起源于卵巢表面上皮，而卵巢表面上皮就是分化修饰后的间皮细胞。因此，间皮素--MSLN可能是我们理解卵巢癌生物学行为的“分子桥梁”。我们推测，(1)可分泌的蛋白质MSLN，可能作为新的血清学指标用于卵巢癌诊断，尤其辅助早期诊断，也可用于病情监测。(2)MSLN和CA125的表达可能有关联，MSLN的过度表达可能影响CA125的释放而导致血清CA125水平的降低，二者可能有互补性应用的临床价值。? MSLN可能影响卵巢癌细胞的生长和转移方式，与CA125有某种功能的关联，二者的相互作用可能与卵巢癌细胞的生长和增殖、脱落、与腹膜间皮细胞特异性黏附、种植有关，最终导致腹腔广泛转移。而卵巢癌的独特的生长和转移规律就是瘤细胞长期在腹腔种植和转移。 我们做出以上推测受到以下启示:? 我们前期工作中应用高通量的基因芯片技术发现MSLN在卵 [4]巢癌细胞中极高表达，RT-PCR和免疫组化初步验证的结果也支持芯片杂交的结果。2003年下半年， [9]美国学者用同样技术也有类似发现。? 同CA125一样，MSLN是可分泌的蛋白，血清中可检测。但MSLN [5]的可溶片段是31 kDa，远远小于CA125的220 kDa的片段，因此，MSLN释放后易于被血循环吸收， [10]理论上敏感度要高于CA125。? 最新的研究MSLN血清检测的报告有令人震惊的发现:对暴露于石棉的41人分析血清MSLN，33例MSLN血清浓度正常的人，随访8年仍健康，但7例血清MSLN升高的人，3例3年后患间皮瘤，1例5年后患肺癌。这一结果提示，血清MSLN有可能用于癌的早期诊 [5]断。? Pastan等发现转染MSLN的细胞较对照细胞有更强的黏附力，推测MSLN可能与细胞的黏附 [6]有关。? Rump等用生物化学的方法证实，转染了人CA125 cDNA的COS7细胞(来源于猴肾)胞膜表达CA125蛋白质(尽管cDNA中不包括信号肽和跨膜部分的编码基因)，转染后的COS7细胞可与培养基中的鼠MSLN蛋白质特异性结合。研究还显示CA125通过含156个氨基酸的模基与MSLN结合在一起，而CA125分子含60余个串联的模基，这种结合可能是多价的方式。上述结果提示人CA125可能是鼠MSLN的相应受体，但人体细胞系或人体组织细胞中CA125和MSLN是否存在这样的关系尚未得知。?初步的研究提示MSLN的过度表达可能会阻止CA125从癌组织释放，因此，导致癌组织 [6]中CA125高表达的卵巢癌患者的血清中的CA125不高或正常。? MSLN与CA125的结合可调节细 [6]胞间的黏附。(8)2003年8月英国帝国理工学院的学者发现CA125通过免疫调节的机制与肿瘤的侵 [11]袭进展有关。 我们课题组近年一直致力于卵巢癌的临床应用基础研究。但此次选题与以往不同，我们是对研究的对象(卵巢癌)采用了高通量的基因芯片进行了侯选目标的筛查，在分析卵巢癌基因表达谱的基础上，复习文献，奠定了课题立项的客观性。MSLN是新发现的肿瘤分化抗原，有关的研究还很少。有关MSLN与人体肿瘤的研究仅33篇文献报道。在卵巢癌方面，最早识别和克隆MSLN是在卵巢癌细胞系 ，[412,13] [14-17]OVCAR-3细胞，一些研究集中在发展抗MSLN的免疫治疗方面。有的学者进行有关血清检 [18]测MSLN的方法学研究。从2003年始，美国的一项研究报道用基因芯片发现卵巢癌MSLN表达上[9][19]调，另一项研究报告了他们正在进行MSLN用于卵巢癌筛查，但研究尚未完成。至于以人体组织或细胞系为对象研究MSLN和CA125相互关系以及二者共同作用对肿瘤细胞生长和转移的影响，在国内外均未见报道。在国内，我们课题组首先开始MSLN的研究。文献检索未见其国内他单位的报道，参见第五部分所附的省科技情报所查新报告。 综上所述，我们将在前期发现卵巢癌出现MSLN上调表达的基础上，深入研究MSLN作为诊断(早期诊断)、病情监测生物标记物的可能性;研究MSLN和CA125共表达的状况和消长关系，观察2个指标的互补应用的可能性。同时，探讨MSLN和CA125在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔转移过程的作用及功能关系，理解导致卵巢癌独特生长转移规律的机制，为抗卵巢癌腹腔转移的治疗提供新的思路和药物作用的靶。 参 考 文 献 1. Gerrnle RT, Hill-Harmon MB, Murray T, et al. Cancer Statistics. 2001. CA Cancer J Clin 2001; 51:15-36 2. Menon U, Jacobs IJ. The current status of screening for ovarian cancer. Ovarian Cancer. The first editon, New York: Oxford University Press, 2002, 171-188 3. 应用DNA微阵列分析卵巢浆液性乳头状囊腺癌的基因表达谱. 中华妇产科杂志 (待发) 4. Chang K, Pastan I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:136-140 5. Rump A, Morikawa Y, Tanaka M, et al. Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16 to mesothelin mediates cell adhesion. J Biol. Chem. 2003; Dec 15 6. O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, et al. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumour Biol. 2001; 22: 348-66 7. Nustad K, Lebedin Y, Lloyd KO, et al. Epitopes on CA 125 from cervical mucus and ascites fluid and characterization of six new antibodies. Third report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumour Biol. 2002; 23: 303-14 8. Schaner ME, Ross DT, Ciaravino G, et al. Gene expression patterns in ovarian carcinomas. Mol. Biol. Cell 2003; 14:4376-86 9. Robinson BWS, Creaney J, Lake R, et al. Mesothelin-family proteins and diagnosis of mesotheliomas. The Lancet 2003; 362: 1612-17 10. Kui Wong N, Easton RL, Panico M, et al. Characterization of the oligosaccharides associated with the human ovarian tumor marker CA125. J Biol Chem. 2003; 278: 28619-34. 11. Chang K, Pastan I. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding a protein detected by the K1 antibody from an ovarian carcinoma (OVCAR-3) cell line. Int J Cancer. 1994; 57: 90-7. 12. Brinkmann U, Webber K, Di Carlo A, et al. Cloning and expression of the recombinant FAb fragment of monoclonal antibody K1 that reacts with mesothelin present on mesotheliomas and ovarian cancers. Int J Cancer. 1997; 71: 638-44 13. Fan D, Yano S, Shinohara H, et al. Targeted therapy against human lung cancer in nude mice by high-affinity recombinant antimesothelin single-chain Fv immunotoxin. Mol Cancer Ther. 2002; 1: 595-600. 14. Bera TK, Williams-Gould J, Beers R, et al. Bivalent disulfide-stabilized fragment variable immunotoxin directed against mesotheliomas and ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 2001; 1: 79-84. 15. Hassan R, Lerner MR, Benfrook D, et al. Antitumor activity of SS(dsFv)PE38 and SS1(dsFv)PE38, recombinant antimesothelin immunotoxins against human gynecologic cancers grown in organotypic culture in vitro. Clin Cancer Res. 2002; 8: 3520-6. 16. Hassan R, Viner JL, Wang QC, et al. Anti-tumor activity of K1-LysPE38QQR, an immunotoxin targeting mesothelin, a cell-surface antigen overexpressed in ovarian cancer and malignant mesothelioma. J Immunother. 2000; 23: 473-9. 17. Scholler N, Fu N, Yang Y, et al. Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family are detectable in sera from patients with ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96: 11531-6. 18. Urban N, MicIntosh MW, Andersen M, et al. Ovarian cancer screening. Hematl. Oncol. Clin. North Am. 2003, 17: 989-1005 四、研究内容和预期成果(说明项目的具体研究内容和重点解决的关键问题～预期成果 和提供的形式。理论成果～应写明在理论上解决哪些科学问题及其科学价值,应用性成果 或基础性资料～应写明其应用的可能性及预期效益) 研究内容: 我们的前期研究中用DNA微阵列发现MSLN在卵巢癌组织中极度上调表达，在此基础上，本研究的内容:一是分析和MSLN作为卵巢癌诊断和病情监测标记物的价值;二是初步探讨MSLN与CA125的表达及其功能关系、MSLN和CA125的相互作用在卵巢癌细胞的生长、黏附和癌的腹腔转移中的作用。具体如下: 1( 采用RT-PCR和免疫组织化学方法，检测冰冻正常卵巢表面上皮、卵巢良性上皮肿瘤和临床各期的 卵巢癌组织标本中的间皮素(mesothelin, MSLN)的基因表达和蛋白质的定位，总结MSLN在正常 卵巢和卵巢上皮性肿瘤的表达规律。同时检测CA125在卵巢癌组织中的表达情况，总结MSLN和CA125 表达的关系。对MSLN和CA125均表达的标本，用免疫荧光方法并借助共聚焦显微镜分析MSLN与 CA125的表达定位的关系，观察二者在人体卵巢癌细胞中是否存在共表达和重叠分布状态。 2( 用ELISA法检测与上述标本同源的健康妇女、卵巢良性上皮肿瘤患者和卵巢癌患者(含早期和晚期) 血清的MSLN的可溶蛋白质水平，并同时检测血清CA125水平，探讨(1)MSLN的血清水平与卵巢癌 临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系，着重评价临床早期的MSLN水平;(2)同一患者的MSLN与CA125 的水平荷和二者的关系;(3)MSLN和CA125在组织细胞中的表达水平水平与血清水平的关系。初步 评价MSLN的诊断(尤其是早期诊断的敏感性)和监测卵巢癌病情变化的意义，并探讨MSLN和CA125 互补应用的价值。对有腹水的患者，分析腹水中MSLN的浓度。 3( 用免疫荧光法分析一些卵巢癌细胞系的MSLN和CA125的表达定位。用双重荧光标记借助共聚焦显 微镜观察MSLN和CA125的定位和共表达情况。 4( MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长、增殖和凋亡的影响。 5( 卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验:降调MSLN和CA125蛋白质的表达，将已经降调了MSLN和 CA125的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行体外卵巢癌细胞与腹膜 间皮细胞的黏附实验，观察MSLN和CA125对人体卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附的影响。 6( 异种细胞黏附实验:由于迄今仅有鼠的MSLN的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察 在表达MSLN和CA125的细胞间的黏附过程中MSLN所起的作用。 7( 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型:将表达MSLN和CA125和被降调了MSLN和CA125表达的卵巢 癌细胞注入雌裸鼠的腹腔，建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，观察MSLN和CA125在人卵巢癌 转移过程的作用。 研究目标: 用分子生物学、细胞生物学和免疫组织学技术，分析间皮素(mesothelin, MSLN)在临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的分布表达，探讨MSLN与卵巢癌临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系、与传统指标CA125表达及定位的关系，最终总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物，MSLN是否可以和CA125互补应用于卵巢癌的诊断和病情监测。初步探讨MSLN的在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔种植转移的作用，揭示MSLN与CA125的功能关联性，为卵巢癌独特的腹腔生长转移行为提供理论依据，为抗腹腔转移治疗打下基础。 拟解决的关键问题: 1 目前尚无系统研究MSLN用于卵巢癌的诊断和病情监测的报告，因此，本研究要解决的首要问题是 MSLN是否有作为卵巢癌的诊断标记物的价值。这一问题的解决也为今后研究MSLN对子宫内膜异位症等与腹膜间皮细胞有关的疾病的诊断价值打下基础。 2 最新研究提示(2004年3月)人CA125是鼠MSLN受体，因此，研究人体细胞MSLN和CA125的表达定位关系及其与卵巢癌疾病状态的关系非常重要。在明确这一问题的基础上，将为临床互补使用这两个指标提供理论依据。 3 卵巢癌的主要转移途径是直接在腹腔的腹膜种植形成转移灶，腹膜间皮是人体表达MSLN的主要细胞。卵巢癌细胞恶性转化后同时出现CA125和MSLN，而CA125可能是MSLN的受体。这一重要线索提示二者可能与卵巢癌的腹腔转移有关。通过体外细胞的黏附实验和裸鼠动物模型的研究，阐明MSLN在CA125在这一过程的作用，为理解卵巢癌转移方式提供理论依据，并可为开发抗肿瘤转移新药提供新的思路和药物作用靶。 预期研究结果: 1( 本课题经过3年左右的研究，将对MSLN在卵巢癌诊断(含早期诊断)和病情监测的价值基本得出 结论，如结论是肯定的，对卵巢癌的临床实践有重要的意义。这一成果可达到国际先进水平。 2( 阐明MSLN和CA125的表达关系，MSLN将可以与CA125联合用于临床实践，使得医师更准确地 判断病情。 3( 完成观察MSLN和CA125共同作用对细胞黏附和癌的转移的影响的研究，将可以深入理解二者的 功能，理解癌腹腔转移的分子机制，为开发新的抗癌药提供理论依据。 4( 本课题的完成，将撰写和投稿国外SCI期刊文章3—4篇，国家级期刊4—6篇，申报国家级成果一 项，省级成果2—3项。 五、拟采取的研究方法和技术路线(包括理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性分析、创新处,研究工作的总体安排和年度进度) 拟采取的研究方案: 1( MSLN在组织中的表达分析:用RT-PCR和免疫组织化学的方法分析来自正常卵巢表面上皮、卵巢 良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌的手术切除标本的MSLN和CA125的表达，观察 ?MSLN的表达 阳性率和定位;? MSLN和CA125的共表达状况;?对出现MSLN和CA125共表达的标本，用MSLN 和CA125的抗体双重标记，借助免疫荧光技术用激光共聚焦显微镜，分析二者在细胞的定位是否重 叠，即形态学上寻找MSLN和CA125结合的证据。 2( MSLN的血清学和腹水检测:用ELISA法检测来自健康妇女和与1项中同源的卵巢良性上皮性肿 瘤和临床各期的卵巢癌患者血清中的MSLN，?由健康妇女来源的数据确定MSLN的正常值范围，以 此作为基线观察肿瘤患者血清中MSLN的水平;?分析MSLN的水平与临床分期和组织学分类的关系; ?观察手术切除肿瘤前后和化疗后MSLN的变化、肿瘤复发时MSLN的值的改变;?对上述人群同时 监测血清CA125的水平，与组织细胞的MSLN和CA125的表达状况相联系，观察MSLN的过度表达是 否会影响癌组织CA125的释放和血清CA125的水平;?检测腹水中MSLN和CA125的水平， 并与血 清的浓度比较，结合组织细胞的表达状况，分析MSLN的释放和循环规律。 在总结上述1和2项的基础上，最终总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断 和病情监测标记物，MSLN是否可以和CA125互补应用于临床理解和判断卵巢癌疾病状况。 3( 卵巢癌细胞系的MSLN分析:以阳性表达MSLN的卵巢上皮性囊腺癌细胞OVCAR-3为对照，检 测卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)、黏液性囊腺癌(3AO)、透明细胞癌(TOV-21G)3株细胞系中的 MSLN和CA125的表达和定位。同时分析培养液中MSLN和CA125的水平。用双重荧光标记借助 共聚焦显微镜观察MSLN和CA125的定位和共表达情况。 4( MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长和增殖的影戏:用MSLN和CA125的反义寡聚核苷酸或RNA 干扰技术(RNA interference, RNAi)降调卵巢癌细胞系中MSLN和CA125的表达，用流式细胞术 和Western blot证实降调后，将已经降调了MSLN和CA125的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理 的卵巢癌细胞系为对照，用细胞克隆形成率、MTT法、流式细胞术等观察MSLN和CA125对卵巢 癌细胞生长、增殖能力和细胞凋亡的影响。 5( 体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验:用MSLN和CA125的反义寡聚核苷酸或RNA干扰技 术降调卵巢癌细胞系中MSLN和CA125表达，将已经降调了MSLN和CA125的卵巢癌细胞系作 为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行黏附实验。手术中取人卵巢癌患者的腹水，分离 51得到腹水中腹膜间皮细胞，体外原代培养腹膜间皮细胞，将间皮细胞加入培养板的孔内;用Cr O标记4株卵巢癌细胞系，将标记后的细胞系置于包被了间皮细胞的培养孔内，37C培养30分钟， 细胞黏附在此间发生，用γ记数器探测放射活性，计算细胞的黏附率。该实验探讨MSLN及其可能 的受体CA125在卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附过程中的作用。 6( 异型细胞黏附实验:由于至今尚无人MSLN的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察同 时表达MSLN和CA125的人卵巢癌细胞与表达MSLN的鼠内皮样细胞LO的黏附率，并用针对鼠 MSLN的封闭抗体B35封闭LO细胞后，观察异型细胞的黏附率的变化。该实验进一步分析MSLN 和CA125在细胞黏附过程中的作用。 67( 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型:将OVCAR-3细胞以10×10/个浓度注入雌裸鼠的腹腔，建 立卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，5周后记数腹腔转移灶的数目。此为对照组。用MSLN的反义寡聚 核苷酸或RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)分别降调MSLN和CA125蛋白质的表达，用流 式细胞术定量分析蛋白质表达量后，将已被降调了MSLN和CA125的OVCAR-3细胞分别注入雌 6裸鼠的腹腔(10×10/个)，5周后将两个实验组与对照组比较，记数实验组腹腔转移灶数目。该实 验在体内实验的基础上探讨MSLN和CA125对卵巢癌腹腔转移形成的作用。 可行性分析: 1( 我们课题组多年从事卵巢癌的基础研究，主要集中在卵巢癌的早诊和癌的侵袭转移等方面。2003 年，申请人采用高通量的基因芯片技术，用含人8000条基因的DNA微阵列分析了卵巢癌的基因表 达谱，发现了56条上调和23条下调的基因，79条表达差异的基因中，其中，间皮素(mesothelin, MSLN)的变化最为显著，位于79条基因之首，在卵巢癌中显著上调表达。随后，对用于DNA微 阵列的标本，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学方法进行了MSLN的表达检测，初步验证了符 合芯片杂交的结果。我们的前期工作使得我们避免了选题上的盲目性，也为课题达到预期的研究目 标打下了客观的基础。 2( 由于目前尚无MSLN的特异封闭抗体，故本研究拟用RNAi和反义寡聚核苷酸技术降调MSLN。短 的双链RNA可特异性的降调或消除与其序列同源的基因的表达，可下调相应功能蛋白质的表达， 这一现象被成为RNA interference或RNAi。具体应用中用仔细设计的21个碱基的双链RNA，借助 转染方式被导入哺乳细胞内，可失活与其任一链序列同源的基因的功能，与其他降调基因技术(如 反义核酸等)相比降调高效。申请人2002年在英国ICRF(帝国癌症基金，现Cancer Research UK) 工作时多次使用该技术，使得本课题应用这一新技术得到保证。 3( 申请人于2001年在英国ICRF参研“肿瘤细胞中整合素介导的蛋白质水解作用与肿瘤的侵袭和转移” (至今英国ICRF的研究者未完成该项目)中部分内容，曾长期使用激光共聚焦显微镜观察活的瘤 细胞膜的蛋白水解的动态过程，因此，具有熟练应用激光共聚焦显微镜的能力。 4( 医院是省肿瘤防治中心，申请人所在的妇科是省妇科肿瘤医疗、教学和科研重要基地，是医科大学 首个培养妇科肿瘤专业博士研究生教学点。每年住院手术治疗的妇科肿瘤患者达3000多例，其中， 卵巢肿瘤患者约1000多例。对所有治疗的病例，病案资料齐全，对恶性肿瘤患者，有专人登记和 随访。因此，我们有充足的研究所需的标本和病例资料，使进行此项研究得到保证。 5( 肿瘤研究所、省肿瘤研究重点实验室均附设在医科大学医院，有较好的开展分子生物学、肿瘤细胞 生物学等研究的条件，拥有超低温冰箱、实时定量PCR仪、凝胶成像系统、γ记数仪、激光共聚 焦显微镜(医科大学药理教研室)、DNA测序仪、动物中心等开展此项目的必备设备和条件。主要 申请人有肿瘤学、病理学、癌的侵袭转移生物学、细胞生物学和分子生物学等丰富的研究经验，故 申请单位有充足信心和能力完成并达到预期研究目的。 4、本项目的特色与创新之处: 1( MSLN的基因在人体卵巢癌组织中上调表达的研究报道，仅有2003年8月的美国一篇报道，与我 们用基因芯片筛查的研究同步，但美国学者没有对该指标进行后期的验证工作，而这一步分析是芯 片杂交结果的必需部分。我们不仅发现了MSLN基因在卵巢癌组织中的上调显著，还在基因和蛋白 质水平验证了芯片的结果。截止到本申请撰写时，国内未见MSLN的研究报道。本课题的选题具新 颖性。 2( 本组在MSLN的临床应用价值方面率先开始系统的研究。MSLN用于卵巢癌诊断指标的研究也仅有 一项美国的研究报道，且尚未完成。国内未见相关报道。 3( CA125已经长期应用于临床实践，根据2003年12月的最新的研究报道启示，在本研究中我们将 MSLN的表达与CA125的表达相联系，试图发现其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床 实践提供价值很高的参数，也将为研究MSLN和CA125的功能开辟新的途径。 4( 本研究根据最新的实验研究结果和合理地科学推测，设计进行MSLN和CA125对卵巢癌细胞黏附 的影响的实验研究，尤其是结合卵巢癌的独特转移规律，研究MSLN和CA125对卵巢癌细胞和腹 膜间皮细胞(表达MSLN)的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察MSLN和CA125在体 内对卵巢癌转移的作用。结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗癌药提供理论依据，这 一思路在国内外均未见报道，具明显的创新性。 附:省科技情报所查新报告: 检索词:#1 间皮素，#2 卵巢癌，#3 CA125， #4 基因芯片 检索策略:1 #2 和 #4， 2 #2 和 #3 3 #2 和#3 和#1 结论:符合检索式1的文献3篇，符合检索式2的文献共74篇，符合检索式3的文献共0篇。未查到间皮素对卵巢上皮癌的诊断价值及与CA125的相互关系的文献报道。 年度计划: 2005年 完成MSLN在人体正常卵巢、卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌的手术切除标本的MSLN和CA125的表达的实验、血清检测MSLN和CA125的实验、结合临床和病理资料，初步总结MSLN对卵巢癌的诊断价值及与CA125表达水平的关系。进行卵巢癌细胞系的MSLN分析和异型细胞黏附实验。可总结论文2-3篇。 2006年继续随访卵巢癌患者和健康妇女，长期观察MSLN的病情监测价值和早期诊断的价值。继续进行和体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验。可总结论文1-2篇 2007年继续随访工作。进行动物模型的研究观察MSLN和CA125对卵巢癌腹腔转移的作用。资料分析、总结结果，撰写论文2-3篇，申报成果。 六、实现本项目预期目标已具备的条件(包括过去的研究工作基础～现有的主要仪器设备、研究技术人员及协作条件～从其它渠道已得到的经费情况～在研或完成的省基金资助项目情况) 工作基础 1( 尽管近年的科研活动取得了很大成绩，加深了我们对卵巢癌的理解，提高了研究者的理论和实验水 平，但我们所取得的成果距临床实用还有很大差距，仍未找到有前途用于临床实际诊断的指标，而 且，也没有发现导致卵巢癌独特腹腔种植转移的关键分子和途径。为此，申请人在不断学习和追踪 最新科技动态基础上，决定在卵巢癌细胞基因组范围内，在恶性转化细胞全面筛查寻找有价值的分 子，避免选题上的偏差。2003年申请人与瑞典Uppsala 大学病理学系表达阵列工作站的Anders Isaksson博士合作，采用高通量的基因芯片技术，识别卵巢浆液性乳头状囊腺癌(卵巢癌)的基因 表达谱。用含8000条人基因的cDNA微阵列分析人体卵巢癌标本，以正常卵巢组织标本做参照; 数据处理首先采用化处理，严格过滤不合格克隆点，对剩余的高质量克隆点(约1500条基因) 进行差异基因筛查。结果发现?卵巢癌组织中96条基因的表达有显著改变，其中，17条基因功能 尚未明，在功能明确或功能有所了解的基因中，56条基因上调，23条基因下调。?Mosothelin和 keratin 19是与卵巢癌组织发生有关的极度上调表达基因，也是有潜在价值的诊断标记物。?RB1、 CCND1、FosB、ST13 和WISP2可能是与卵巢癌的发生有关的癌基因。?SPINT2、SLPI、MMP 7 和DCN是表达显著改变的与肿瘤侵袭转移相关的蛋白酶和细胞外基质成分。 2( 在上述高通量芯片筛查的基础上，我们广泛查阅了有关文献，锁定MSLN为研究目标。随后，我们 用半定量RT-PCR和免疫组织化学方法进行了MSLN的表达检测，结果发现:?半定量PRT-PCR显 示，42例卵巢癌MSLN mRNA均显著表达，而11例正常卵巢皮质组织中MSLN mRNA呈阴性。?用MSLN 的5B2抗体(针对细胞膜的MSLN片段)检测石蜡包埋组织发现，42例卵巢癌中均为阳性，11例正 常卵巢皮质则阴性。初步验证符合芯片杂交的结果。 这些结果使得我们避免了选题上的盲目性，也为课题达到预期的研究目标打下了客观的基础。 工作条件 医科大学医院是省肿瘤防治的中心，省肿瘤研究所和省肿瘤分子诊断重点实验室均设在该院内。主申请人所在的妇科也是省妇科肿瘤医疗、教学和科研的重要基地，科室有自己独立的研究室，拥有进行细胞培养、免疫组织化学实验、病理学实验、PCR实验等必备的设备和条件，同时，依托在本院内附设的省肿瘤研究所和省肿瘤分子诊断重点实验室的优良环境，为课题的实施提供了客观上硬件的保证。 承担的课题有: ?省自然科学基金项目“卵巢上皮性癌基质金属蛋白酶的释放与活化”，项目编号301391。在研究中我们发现了在国内外率先研究MMPs活化形式与肿瘤侵袭转移的关系，并发现活化的MMP-2与卵巢癌的侵袭转移高度相关，结果发表在国际权威杂志Gynecol Oncol上，影响因子2.2。在国内首先使用肿瘤细胞与间质细胞共培养系统模拟体内肿瘤微环境，探讨了癌细胞与成纤维细胞相互作用对MMPs活化的影响。其中IGF-?可上调MMP的表达。在国内外首先开展了整合素αvβ6在卵巢肿瘤的表达研究，这种伴随卵巢癌恶性表型出现的新型整合素，调节MMP的功能，与卵巢癌侵袭转移密切相关。本课题已在国内外权威期刊发表论著5篇。完成了成果鉴定，正在申报成果奖励。 ?省科技厅项目“卵巢肿瘤细胞凋亡与调控”，项目编号002763060，“卵巢肿瘤细胞凋亡与肿瘤生物学行为，项目编号00547001D-16，这两项研究基本完成，总结论文陆续投往国内期刊。 ?省科技攻关项目“应用DNA微阵列分析卵巢癌基因表达谱”，已完成芯片杂交和数据处理，现 正进行对芯片杂交结果的验证，已初步总结论文3篇。本课题也是在此基础上选题进行的 七、申请者和项目主要成员业务简历(按人填写最高学历、学位、身份证号和研究工作简历～近期发表的与本项目有关主要论著目录和科研成果名称及获奖情况～标明本人名次) 申请人简历 八、合作单位意见(对合作研究内容、参加人员科研素质及保证研究工作条件等签署具体意见) 单位(公章) 年 月 日 九、申请者所在单位学术委员会或同行专家审查意见(对本项目的意义、研究方案、申请者和项目组主要成员的科研能力等签署具体意见～如单位无学术委员会～可由五人以上同行专家评议审查) 主任或副主任委员(签章) 年 月 日 十、申请者所在单位审查意见(对是否同意学术委会意见～经费预算是否合理～有无其他经费来源～能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等签署具体意见) 单位领导(签章) 年 月 日 单位(公章) 年 月 十一、参加审查人员 年 姓名 专长 职称、职务 工作单位 签 字 龄 登记序号: 项目编号: 中医药、中西医结合科研项目 课题设计书 课题名称:痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究 申报单位: 江苏省中医院 课题负责人: 朱萱萱 计划年限: 邮政编码: 210029 联系电话: 86617141—30306 申报日期: 江苏省中医药局制 填写提纲 一、立项依据:与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势;选题的理论和实践依据;研究目的、意义;本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。 二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标(达到的主要技术指标或技术经济指标)，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。 三、研究试验方法及技术路线(工艺路线)。 四、现有工作条件和基础:开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等;已有工作基础，预试验情况。 五、计划进度:根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。 六、参加(协作)单位意见及具体分工(附书)。 七、经费概算(包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主)和核算依据，以及分年度使用计划。 填写说明 一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。 二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。 三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。 1、 立项依据 1.1 研究目的、意义 骨关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，55—64岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%~90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。 西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。 1.2 国内外现状水平和发展趋势 近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下: 1.2.1 流行病学研究已广泛开展 在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%(男6.4%，女11.4%)，80岁以上为11.2%(男5.4%，女15.8%);而放射学膝OA70岁以上为27.4%(男30.4%，女25.1%)，80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、45—59岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%;无症状性OA患病率53%，其中30—39、40—49、50—59岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、40—49、50—59和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。 1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破 目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说:由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致 细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说:认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺(PG)合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放 -大量O和HO;细胞因子学说:细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白222 细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨基质降解的主要驱动因子;软骨酶降解学说:OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成?型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏;一氧化氮学说:NO是一种分 细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说:细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH(nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase)和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过,as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸 传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴 --离子,反应,生成氧化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH2 和NO自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受2 损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-α、PGE2、Aggrecan G1区等。 1.2.3 治疗方面有了不少新方法 目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用;第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用;第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题:?多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。?缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。?未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。?缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA—骨内高压—血瘀证—氧自由基之间的密切关系;谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本;散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。 1.2.4 实验研究方面有了较大的进展 随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用2 到实验研究中来。 1.3 选题的理论和实践依据 祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对《备急千金要方》中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪;威灵仙舒筋通络止痹痛;淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药;当归养血柔肝、舒筋活血;川芎则通达四肢关节，为血中气药;虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。 1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景 1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际 公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平(包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响)研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。 1.4.2目前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用《千金要方》中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。 2.科研假说或技术构想:主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。 2.1主要内容 2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。 2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。 2.2主要技术关键 2.2.1膝OA模型的复制 目前所使用的OA动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生;另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属(包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征)、不同方法的造模机制和OA模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术 造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。 2.2.2关节软骨细胞的获取和培养 基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM(高糖)等，其中加入12 胎牛血清(占15%)，一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，PH7.4。培养过程中一般使用5%CO37?2的恒温培养箱。 2.2.3采用的检测手段及指标 在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标:?大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况;?HE染色观察有关的形态变化;?Masson三色染色观察胶原的变化;?Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法;?电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用MTT法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对iNOS、NO含量的测定则使用分型NOS试剂盒和NO试剂盒。 2.3目标(达到的主要技术指标或技术经济指标)、技术特征及创新之处。 现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗OA的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗OA的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的OA研究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗膝OA的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的 发展方向和新的探索。 3.实验研究方法及技术路线。 3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 OA模型的制备:(1)取SD雄性大鼠50只，体重200,220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。(2)取SD雄性大鼠50只，体重200,220g，4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/L半胱氨酸溶液1:1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。 方法:将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组(维骨力组)、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，2000rmp15min离心获取含药血清;切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作HE染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈2mm×1mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨一并切下，10%福尔马林溶液固定24小时以上，分别作HE、沙红-O及Masson三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。 观察指标:?大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况;?HE染色观察有关的形态变化;?Masson三色染色观察胶原的变化;?Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法(附评分等级表如下);?电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。 评分等级 ?.结构 正常 0 表面结构微小不规则 1 表面结构中等不规则 2 表面结构严重不规则 3 过渡层出现裂隙 4 辐射层出现裂隙 5 钙化层出现裂隙 6 过渡层消失 7 辐射层消失 8 钙化层消失 9 结构完全破坏 10 ?.细胞 1. 切线的区域 正常 0 细胞肿胀 1 细胞消失 2 2. 过渡和辐射的区域 正常 0 少量的细胞增多 1 中等量的细胞增多 2 大量的细胞增多 3 少量的克隆 4 中等量的克隆 5 大量的克隆 6 少量的细胞减少 7 中等量的细胞减少 8 大量的细胞减少 9 细胞消失 10 ?.变异标记 完整 0 多层 1 模糊 2 血管的交叉 3 ?.血管翳形成 没有 0 少量 1 中等量 2 大量 3 3.2 对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响 3.2.1 兔膝软骨细胞的原代培养 无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液(PBS)的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中 3u将其细切至不大于1mm。切碎后将其装入10试管内，按1:10量加入消化酶类进行化学解离。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%胶原酶?消化7~8小时后，1500rpm10min离心，弃上清，加入PBS，摇匀在同上离心弃上清，在加PBS反复三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻吹打均匀，200目筛网过滤，放入培养瓶中， 5%CO37?培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用0.25%胰酶消化传2 代。 3.2.2 对软骨细胞增殖反应的作用 将在培养瓶中长满的细胞消化，接入96孔培养板中，100ul/孔， 待细胞长成单层后，将旧液弃去，用PBS轻轻荡洗一遍，然后加入含药血清，100ul/孔，每组4个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT试剂20ul(5g/L)既无血清培养液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲 瓒液，以主波长570nm，参比波长690nm于酶标仪上比色，读取吸光度(A)值。 3.2.3 对软骨细胞的细胞凋亡的影响 单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组4个复孔，于5%CO37?培养箱中培养48h，弃去旧液，用0.25%胰酶消化待细胞有变2 圆趋势即取出消化液，加入PBS，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，1000rpm，5min，去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或注射器将细胞迅速注入4?冷乙醇中(乙醇终浓度为70%)，用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。 3.2.4 对软骨细胞蛋白合成和NO含量的影响 同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，CO恒温培养箱培养48h后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测2 总蛋白含量，用分型NOS试剂盒和NO试剂盒检测各组iNOS、NO含量。 3.2.5 拆方后对软骨细胞的影响 进行拆方实验，筛选出补肝肾组方、祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组(维骨力组): 细胞毒性实验 将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察24h、48h、72h细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆、萎缩、漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。 对软骨细胞的细胞凋亡、增殖、NO含量及iNOS基因表达的影响 将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。 4.现有工作条件和基本条件 本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等一系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风湿科，该科拥有专科病房(20张病床)及全天专科门诊，同时还开展了专病门诊(包括OA)，技术力量较强，技术水平较高，在省内外中西医风湿界均有一定的影响。本课题负责人朱萱萱主任药师，副教授，是省药理学会理事、中华中医药学会制剂分会委员。主要从事中药药理，毒理和中药制剂的研究工作。 《养阴生肌膜治疗口腔溃疡的临床及实验研究》获省中医药科技进步一等奖、排名第3;《保精片治疗前列腺炎的实验研究》获省中医药科技进步二等奖、排名第4 ;《中医治疗原发性视网膜色素变性临床及机理研究》获省中医药科技进步 一等奖、排名第5;《小儿退热滴肠液的临床研究》获省中医药科技进步二等奖、排名第4;《洋金花伤膏》获省中医药科技进步二等奖、排名第4;《克乳痛治疗乳腺炎的临床及机理研究》获省政府二等奖、排名第6;《津血源治疗干燥综合症的临床及实验》获省政府三等奖、排名第5;《宫颈宁治疗宫颈炎的临床及实验研究》获省中医药科技进步二等奖、排名第5;《养心托毒颗粒剂治疗病毒性心肌炎的临床机理研究》获省政府三等奖、排名第5;《血康糖浆治疗小儿贫血的临床和实验研究》获市科技进步三等奖、排名第3;《中药缓释口腔粘附片的研制》获市科技进步三等奖、排名第1。通过成果鉴定项目有:《病毒清眼膜的研制》《消症饮治疗子宫内膜异位症临床和实验研究》《强心合剂治疗心衰的临床及实验研究》《病窦灵治疗窦房结综合症临床及实验研究》《乌鳖口服液治疗卵巢功能早衰的实验研究》《 益肾健脾颗粒剂治疗青春期功血的临床和实验研究》《四通颗粒剂与紫外线照射充氧自血回输结合治疗急性缺血性中风的临床及机理研究》 《热痹消治疗急性痛风性关节炎的研究》 《从脾肺论治免疫性溃疡性结肠炎(IUC)的临床和实验研究》《大黄蛰虫丸对阿霉素肾病伴高血脂症大鼠的实验研究》 《滋阴抑元颗粒对免疫性不孕的机理研究》 《脑血通对急性出血性脑中风的实验研究》 《茱萸颗粒对病毒性心肌炎免疫损伤作用的研究》。完成新药基金的药效学和毒理学研究3项，其中1项为863计划，编号2002AAZ3214，排名第5;1项为口腔膜的研制(省中管局)排名第1;1项为薤白胶囊的研制，(省科委高新开发项目)，排名第4。 近年来发表论文33篇，其中国家级刊物30篇[第一作者30篇]，省级刊物3篇[第一作者3篇] 。 现阶段我们已完成了一部分痛痹颗粒机理的实验研究，其中包括该方抗炎镇痛作用、抗氧化作用及改善血液微循环等方面一系列的实验工作， 同时我们也进行了一些预实验，包括对OA模型的复制等。 已有以下主要仪器设备，可满足本项研究使用。 超低温冰箱 MDF-382E 日本三洋公司 倒置显微镜 CK 日本TOKYO公司 紫外分光光度计 751G 上海分析仪器总厂 低温高速离心机 MEGAFUGE2.0R 德国HERMLE公司 蛋白核酸分析仪 DU600 美国Beckman公司 PCR仪 PE-9600 美国PE公司 96孔酶标仪 3550 美国Bio-Rad公司 紫外线检测仪 ZF-2 上海长兴机械厂 DNA荧光定量分析仪LightCycle 美国Roche公司 FA1004电子天平 上海天平厂 净化工作台 苏州净化设备厂 CO恒温培养箱 德国贺利氏公司 2 欠缺的有TBX细胞流式仪 2 5、计划进度: 总研究期限,年(2005. 4 ~200 )分三个阶段实施。 第一阶段:(2005.4~2005.6)调研及资料检索，准备阶段并上报待批。 第二阶段:(2005.6~200 )完成全部实验工作。 第三阶段:(200 )资料汇总、总结、处理数据、分析与研究成果撰写论文、上报鉴定、鉴定后申报成果。 6、经费预算: 6.1检索、调研、研制药物、检查费、购买特殊试剂盒、打字复印约2万。 6.2动物实验、药理、毒理、细胞培养材料约3万。 总计 5万 7、主要研究人员 在本项目中姓名 性别 年龄 单位 专业 职务 的主要工作 朱萱江苏省中医主任药 女 药学 课题负责人 萱 院 师 董朝南京中医药 24 女 药学 药理毒理 岚 大学 刘丽南京中医药 27 女 药学 药理毒理 敏 大学 闻国女 江苏省中医动物饲养 兰 院