硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保护作用的实验研究

硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保护作用的实验研究 硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保 护作用的实验研究 IntJOphthalmol,Vo1.11,No.9 Tel:029-8224517283085628 Sep.2011WWW.IJ0.ca Email:UO.2000@163.conl ? 实验论着? 硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保护作用的实验 研究 王宏伟,邱姣,赵青 基金项目:中国辽宁省教育厅高等学校科学研究资助项目(No. 2009A445) 作者单位:(121001)中国辽宁省锦州市,辽宁医学院附属第一医 院眼科 作者简介:王宏伟,女,教授,研究方向:角膜病与眼表疾病. 通讯作者:王宏伟.flashing7712@sina.con.cn 收稿日期:2011—06—03修回日期:2011.07—22 Experimentalstudyofthechondroitin sulfateinglycerolfreezingsolutiononthe protectionofcornealendothelium Hong-WeiWang,JiaoQiu,QingZhao Foundationitem:ScientificResearchPrqiectofLiaoningProvincial EducationDepartmentforInstitutionofHigherLearning,China(N0. 2009A4451 DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalof LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,LiaoningProvince,China Correspondenceto:Hong—WeiWang.DepartmentofOphthalmology. theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity.Jinzhou 121001.LiaoningProvince,China.flashing7712@sina.coin.cn Received:2011—06—03Accepted:2011—07—22 Abstract ?AIM:ToevaluatechondroitinsuIfateontheglyceroI cryopreservationofcorneaIendotheIialceIlsfCEC). ?METHODS:FortyWistarratscorneaIpieceswere dividedintotheexperimentalgroup:glycerol cryopreservationmediumcontainingchondroitinsulfate (CS);andthecontrolgroup:mereglycerolcryopre— servationmedium.Thetwogroupsweresavedat一20oCfor 2months.AlIpieceswereexaminedwithtrypanblue combinedwithalizarinredstaining(viabilitystaining) andelectron—microscopeexaminationforCEC.30SDrats weretakentoestablishWistar—SDratmodelofallogenic penetratingkeratoplasty.Slitlampmicroscopedetected theOCCUrrenceofcorneaIrejection,TNF.aandIFN.y expressionwasexaminedbyimmunohistochemistryto testthee仟ectofpreservation. ?RESULTS:Thestainingresults,electron-microscope examinationandTNF—oc,IFN—yexpressionshowed.the differencewassignificantinthesetwogroups(P<0.05), theresultsoftheexperimentalgroupwasbetterthanthe centrelgroupafterthesavingandthecorneaI transpIantati0n(尸<0.05).Theelectron—microscope examinationshowedindivduaIvacuolesinCECcytoplasm. slightswellingofmitochondriaJandendoplasmicreticulum inexperimentalgroup,obviousswellingofCEC mltochondriaIandendoplasmicreticuIumincontroI group- ?CONCLUSION:Glycerolcryopreservationcanpreservethe viabilityofCEC.Chondroitinsulfatecanobviously improvethee仟ectofpreservation. ?KEYWORDS:chondroitinsulfate;glycerolcryopreservation; cornea:corneaIendotheIiaIcells WangHw.QiuJ.ZhaoQ.Experimentalstudyofthechondroitin sulfateinglycerolfreezingsolutionontheprotectionofcorneal endothelium.GuYankeZazhi(IntJOphthalmol2011;11(9): 1525—1527 摘要 目的:探讨硫酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)在甘油冷 冻保存角膜中对角膜内皮细胞(cornealepithelialcells. CEC)的保护作用. 方法:Wistar大鼠角膜片40只随机分为实验组和对照组, 对照组角膜片直接放入纯甘油中,实验组则在内皮面均匀 黏附10g/Lcs后再放入甘油中.一20%保存2mo后行 CEC台盼蓝一茜素红活性染色及电镜检查.取30只sD大 鼠与保存后角膜片建立Wistar—SD同种异体穿透性角膜移 植模型,测定术后不同时间点植片内TNF一和IFN一的表 达水平,检验保存效果. 结果:台盼蓝.茜素红活性染色结果及术后植片内TNF.ot 和IFN一^y的表达结果显示,两组差异有显着性(P< 0.05),实验组保存效果和角膜移植术后效果均优于对照 组.电镜检查示,实验组CEC胞质内可见个别空泡,线粒 体及内质网轻度肿胀;对照组CEC线粒体及内质网明显 肿胀. 结论:甘油冷冻能够保持CEC的活性,且cs能进一步增 进保存效果. 关键词:硫酸软骨素;甘油冷冻;角膜;角膜内皮细胞 DOI:10.3969/i.issn.1672-5123.2011.09.009 王宏伟,邱姣,赵青.硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保 护作用的实验研究.国际眼科杂志2011;11(9):1525—1527 0引言 角膜内皮细胞(conq_ealepithelialcells,CEC)的活性是 角膜移植成功的关键.甘油用作角膜保存已有较长的历 史,但甘油与角膜内皮接触对CEC可造成一定损害.硫 酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)因其特有的生物活性而 广泛用于临床尤其眼科中,本研究旨在探讨cS在甘油冷 冻保存角膜时对CEC的保护作用,以期获得更好的眼库 保存效果. 国际眼科杂志2011年9月第11卷第9期~PCVW.IJO.crl 电话:029—8224517283085628电子信箱:IJO.2000@163.com 1材料和方法 1.1材料成年健康Wistar大鼠20只(购自中国医科大 学实验动物中心),成年健康SD大鼠30只(购自辽宁医 学院实验动物中心),CS(Alcon公司),无水甘油(天津市 东丽区天大化学试剂厂),手术显微镜(德国NIDEK公 司),RM2135切片机(德国Leica公司),CIAS一1000型细 胞图像分析系统(北京大恒图像视觉有限公司),兔抗大 鼠TNF—d抗体,兔抗大鼠IFN.抗体,SABC二抗试剂盒, DAB显色液(北京博奥森生物工程有限公司). 1.2方法 1.2.1甘油保存液的配制取125mL的广口瓶装入80mL 纯甘油,140~C电烤箱消毒2h,用高压灭菌的青霉素空瓶 分装甘油2.5mL,置于4?冰箱内预冷备用. 1.2.2角膜片的制作和分组及保存以成年健康Wistar 大鼠(购自中国医科大学实验动物中心)20只为实验对 象,按文献报告方法眼库常规处理…,取下带2ram巩膜环 的角膜片,于庆大霉素复方氯化钠溶液中浸泡lOmin,共 取得40只角膜片,随机分为2组,每组20只眼角膜.对 照组:直接将角膜片内皮面向上装入甘油保存液中.实验 组:在每个角膜片的内皮面均匀黏附10g/LCS0.2mL,然 后内皮面向上装入甘油保存液中.两组均放入一20?冰箱 冷冻保存,保存时间为2mo. 1.2.3角膜片的复温和复水保存到期后,将两组角膜片 取出,立即置于100mL4~C眼内冲洗液中,每2min轻轻漂 洗1次以洗去黏附的甘油,5min后再转置于另一杯lOOmL 4qC眼内冲洗液中,再复水5min. 1.2.4应用冷冻保存的角膜行穿透性角膜移植术取30 只SD大鼠,随机分为2组,每组15只大鼠,按文献报告方 法常规处理后,均以3.0mm直径环钻(苏州六六仪器厂) 在大鼠右眼角膜中央区压痕,制作植床.将复温复水后带 巩膜环的两组经保存角膜片随机各取15只自内皮面用直 径3.5mm环钻冲切获取中央植片,建立Wistar—SD同种异 体穿透性角膜移植模型. 1.2.5茜素红一台盼蓝活性染色检查经保存角膜片复温 复水后,将每组未移植的5个角膜片于复温复水后以安全 刀片剖为两半,一半用于活性染色检查,另一半按常规行 透射电镜检查.用于移植的角膜片首先在术中取手术钻 切剩下的角膜环进行染色.染色剂配制参照谢立信的 方法,以细胞核明显蓝染或细胞内有茜素红斑为细胞死亡 标准.每个角膜观察5个视野,计算标定面积内的CEC 密度,细胞死亡率及异形细胞率. 1.2.6电镜检查按常规超薄切片制作方法做超薄切片 (包括取材,固定,脱水,浸透,包埋聚合,切片机染色等步 骤),在透射电镜(JEM一1200EXElectronMicroscope)下观 察CEC超微结构变化. 1.2.7免疫组织化学检查测定各组术后14d移植片内 TNF一0l和IFN一^y的免疫组织化学表达水平.每张切片随 机取5个视野(X400倍),用CIAS一1000型细胞图像分析 系统分析阳性细胞数,结果用(元?s)表示. 统计学分析:采用SPSS17.0软件包进行数据处理, 采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1CEC形态学变化对照组细胞轻度水肿,细胞间隙 增宽,细胞形态多呈不规则六边形或近圆形,可见散在分 表1两组最佳保存区域的角膜内皮细胞活性染色结果元?S P<0.05VS实验组. 表2角膜移植术后14d各组植片TNF-a和IFN-Y阳性面积百 分比(?s,%) P<0.05VS实验组. 布的核明显蓝染的细胞,细胞边界不清晰.实验组未见明 显细胞脱落区,细胞多呈规则六边形,细胞连接紧密,边界 清楚,极少量细胞核明显蓝染.CEC密度,细胞死亡率及 异形细胞率两组之间差异有显着性(P<0.05,表1). 2.2CEC超微结构变化实验组CEC胞膜完整,胞浆丰 富,胞质内可见个别空泡,线粒体及内质网轻度肿胀;对照 组CEC核膜完整,核仁存在,胞浆较丰富,线粒体及内质 网明显肿胀. 2.3角膜植片内TNF-a和IFN-y的变化-和IFN一^y 在大鼠完整的角膜上皮层,内皮层均有基本表达;在病变 角膜,其主要表达于上皮基底部和基质层以及浸润的炎症 细胞,在胞浆中染成棕黄色,着色的深浅表示阳性程度. 实验组与对照组间14d时,TNF一和IFN.^y阳性面积百分 比有统计学差异(P<0.05,表2). 3讨论 角膜移植术是治疗角膜盲的主要手段,但是角膜供体 严重缺乏,研制一种简便高效的长期角膜保存方法十分必 要.CEC的活性是角膜移植成功的关键,甘油用作角膜 保存已有较长的历史,有研究发现_20~C甘油冷冻保存后 的角膜用于穿透性角膜移植可部分保持植片长期透明. 但采用甘油保存角膜片时,CEC直接与甘油接触,细胞 因迅速脱水而皱缩,导致细胞间隙增宽,细胞连接受损,从 而影响CEC的泵功能.此外,甘油在高温消毒过程中会 少量分解,并与空气中的氧及氮发生反应,生成微量的硝 酸甘油及醛类等有毒物质,这些物质能对CEC均造成损 害.因此,有必要采取一定的措施消除在甘油冷冻保存角 膜的过程中对CEC的损害. CS是一类广泛存在于人和动物的软骨等组织中的一 类酸性黏多糖,是动物蛋白聚糖的代表物质,因其特有 的生物活性而广泛用于临床.CS用作滴眼液能改善眼角 膜组织的水分代谢,在角膜表面形成透气保水膜,促进角 膜创伤愈合及改善眼部干燥症状.角膜中期保存法研 究证明,Optisol角膜保存液中含有的CS和低分子右旋糖 苷可保持角膜的半透明状态.cS对角膜胶原纤维有保 护作用,能促进基质中的纤维增长,增强通透性,改善血液 循环,加速新陈代谢,促进渗透液的吸收及炎症的消除,其 聚阴离子有强保水性,能改善眼角膜组织的水代谢,对角 膜有较强的亲和力.黏弹剂在眼科手术中有重要作用, 30L透明质酸(hyaluronan,HA)与40g/LCS的合剂(商 品名Viseoat)兼具高黏滞性和良好的涂敷性,能较好地维 In:JOphthalmol,Vo1.11,No.9,Sep.2011www.HO.cn Tel:029-8224517283085628Email:IJO.2000@163.com 持前房并保护CEC,有利于减少异位性白内障患者因行晶 状体手术所引发视网膜脱离的发病率.但cs用于长 期甘油冷冻保存是否对CEC也具有保护作用的研究较 少.我们认为,可IIII入cs后既能充分利用甘油保存角 膜的特性,又能避免甘油与角膜内皮直接接触对CEC造 成的不良影响. 台盼蓝.茜素红活性染色是评价CEC活性最常用的 一 种方法,透射电镜检查能进一步观察CEC的超微结 构.活性染色结果显示,在角膜内皮面添加cS进行长期 甘油冷冻保存后,CEC密度较高,细胞死亡率及异形细胞 率降低,明显减少了角膜内皮与甘油直接接触对CEC所 造成的损害.透射电镜观察,虽然有部分空泡变,这可能 与固定过程和操作手法有关,但CEC结构尚完整,细胞器 损伤程度较轻.以上结果均证实,在甘油冷冻保存角膜内 皮面添加cs对CEC具有明显的保护作用,能长期保持 CEC的活性. 有研究TNF.参与介导角膜移植排斥反应的发生, 术后监测血清TNF一0【水平有助于对排斥反应的早期预测 及诊断.Skurkovieh等经研究证明,IFN一^y在角膜移 植排斥反应中起着重要作用.结果表明,行移植术后植片 中TNF—和IFN.的表达水平实验组明显低于对照组. 本研究结果表明,在角膜内皮面添加CS后,cs可聚集在 CEC周围,形成一层保护外壳,减慢CEC脱水与复水的速 度,并消除甘油内的有毒物质对CEC的损害,防止机械性 因素对CEC微绒毛及细胞膜的损害,起到了一定的保护 作用.同时,cs降解产生糖醛酸,可与CEC氧化代谢所 产生的毒物结合成无毒物质排出体外,有一定的解毒作 用.CS作为一种抗氧化剂,可抵抗氧自由基的侵袭,防止 细胞膜脂类的过氧化反应,维持细胞膜的稳定,保护细 胞的完整性和正常功能,提高CEC的抗氧化能力及生物 活性,使自由基对细胞的损伤减低,有效延长角膜保存 时间. 综上所述,加入cs进行长期甘油冷冻保存角膜可视 为一种简便易行,经济实用,适合基层医院普及推广的长 期有效的保存方法,其临床应用效果值得进一步研究. 参考文献 1谢立信.角膜病学.北京:人民卫生出版社2007:421—422 2谢立信.角膜移植学.北京:人民卫生出版社2000:155—156 3谢立信,董晓光,李绍伟,等.甘油冷冻保存角膜用于穿透性角膜移 植的初步报告.眼科研究1999;17(3):202—205 4蒋华,范军华.透明质酸钠在甘油冷冻保存角膜中的应用.解放军 医学杂志2007;32(7):694—696 5徐传屯,关瑞章,郑江.硫酸软骨素测定方法的研究进展.集美大学 (自然科学版)2008;13(1):52—56 6宋涛.硫酸软骨素研究概况.食品与药品2006;8(7A):31.32 7WagonerMD,Gonnahel—S.Cornealgraftsurvivalafterprolonged storageinOptisol—GS.Cornea2005;24(8):976-979 8RainerG,MenapaceR,SchmidK,eta1.Naturalcourseofintraocular pressureaftercataractsurgerywithsodiumhyaluronate3%versus hydroxypmpylmethylcellulose4%.Ophthalmology2005;112(10):1714—1718 9LiouSW,ChiuCJ,WangU,eta1.Effectofintracameralinjectionof lidocaineandcarbacholOiltherabbitcornealendothelium.JCataract ReFractSurg2004;30(6):1351—1355 10ZhuS,DekarisI,DunckerG,et.Earlyexpressionof proinflammatorycytokinesinterleukin?-1andtumornecrosisfactor--alpha aftercornealtransplantation.JInterferonCytokineRes1999;19(6): 661—669 llSkurkovichS,KasparovA,NarbutN,eta1.Treatmentofcornea[ transplantrejectioninhumanswithanti—interferon—gammaantibodies.Am JOphthalmol2002;133(6):829—830 12KohSW,WaschekJA.Cornealendothelialcellsurvivalinorgan culturesunderacuteoxidativeseress:effectofVIP.InvestOphthalmol VisSei2000;41(13):4085—4092 1527