抗可提取性核抗原Sm和抗RNP单克隆抗体的制备与特性鉴定

抗可提取性核抗原Sm和抗RNP单克隆抗体的制备与特性鉴定 抗可提取性核抗原Sm和抗RNP单克隆抗 体的制备与特性鉴定 百 292 s—R荤宪嘞懈. 组胞与分子免疫学杂表(JCellMoiImmuno1)1998DecI14(4) 玎 72,7抗可提取性核抗原sm和NP单克隆抗体的制备与特性鉴定 堑壹刈玉翠整塑同静辉胨荚球柚建荣静天王 (河北省科学院生材研究所-石索庄050061河北大学生?技术研究中心) 可提取性核抗原(extracta51ehue1earantigen, ENA)为哺乳动物细胞棱的生理盐水抽提物.从广 义上讲,包括1O多种核抗愿成分,狭义脚指Sm和 RNP两种,它们是由棱内棱糖校瞳和蛋白质组成 的复合物.测定抗ENA抗体对系统性红斑狼疮, 混合性鳍缔组织病,类风墨性关节嶷等自身免疫性 ,痰病的鉴别诊断和治疗具有重要的意义].Sm 和RNP的理化性质十分相似,一般情况下梗难将 两者分开.由于得不蓟高纯度的Sm和RNP抗愿, 目前一般只能对抗Sm抗体与抗RNP抗体同时测 定,且常用的方法(对流免疫电濂,琼脂双扩敌和 间接血凝法)费时费力,特异性和灵敏度均较低. 通过研制抗Sm和抗RNP两种单克隆抗体(mAb), 并以mAb亲和层析法制备纯化的Sm和RNP?即 可进而建立商特异性,高曼敏的ELISA法,以应用 于临床对两种抗ENA抗体的测定. 1材料和方法 I.1抗原翻备与动物免疫抗原由本室自制瑚. 选用5周龄雎性Balb/c小鼠(从卫生部药品生物审j 品检定所引种白行繁殖).将经过初步纯化的ENA 抗原吸附在硝酸纤维素滤膜小片上,植人小鼠颈背 部及蕨股沟皮下.3周后开始监测小鼠血清抗体教 价,选择效价较高的小鼠,经腹腔注人用不完全福 氏佐剂乳化的ENA抗原,于融合前8d再经尾静 脉加强免疫1次. 1.2杂交囊细胞株的t立免疫用抗原由本室制 备.即以新鲜健摩疆辟为原料,通过几个关键性步 骤,获得高度纯化的细胞核,并从中提取出不被细 胞质,组蛋白和DNA污染的ENA制品.然后进一 步分商纯化Sm和RNP并免疫Balb/c小鼠.取其 脾细胞与Sp21o小鼠骨羹瘤细胞融合,间接ELISA 法筛选及有限稀释法克隆化t并按常规制备腹水. l-3mAb的特异性爱裹位分析参照Soos等? 的方法.特异性分析i是将ENA,Sm,RNP,以及 另外两种ENA组分La(SS-B)和Ro(SS—A)gS~J包 被板(各种抗原均为5rag/L),以上述问接ELISA 法检测各阳性杂交瘤细胞的培养上清,根据显色程 度分析交叉反应情况.表位分析t是向包被有Sm (或RNP)抗原的板上,先加入一种抗SmmAb(或 抗RUPmAb),37?温育2h后,加人HRP标记 的另一种抗smmAb(或RNP=lAb).根舞量色程 度爿断两种mAb所识别的表位是吾相同,’并将测 试的垒捧mAb按所识别的哀位进行分组. ,,4n 的ll亚类鉴定采用免疫双扩告哪进 行. 1.5mAb亲和常数的翻定按文献[6,7]的方法 进行.即将一定量的mAb(,10.tool/L)与一定 范围内(一1o.mol/L,1Omo!/L)不同量的纯抗 原在0.1mol/LH7.8)的磷酸钾盐缓冲体系中保 温,直至抗原,抗体反应达到平衡.然后将反虚体 系转移刮授先包被抗原的板中,用ELISA法渊定 游离的抗体量,读取A492nm值,并按下列公式计 算亲和常数(Ka). Ka=(卜垒尘)/[(叁)/(.,i..叁尘)] 式中的ao和分别为抗原,抗体的初始浓度JA. 和A分别为不加抗恩和加抗原后的嗳光值. 2结果和讨论 2?l杂交?阚胞株的童立进行了3次细胞融合, 平均融合率为62.5.共获得19株能毽定分泌抗 ENA*nAb的杂交瘤细胞. 2.2mAb的特性鉴定 2,2.1特畀性鉴定19株杂交窟细胞中,对Sm 特异的3株(1D12,1G5和2E5)I对RNP特异的 8株(1G6,IH4.2C6,3E9,3H11,4C10.4D7和 4E6). 2?2?2袁往分析B株抗RNPmAb可分为两组z ?zc6.3G11和?1G6,IH4.3E9,4C10,4/)7, 4E6.它1门分别识别RNP分子上的2个不同的表位 (袭1).而3株抗SmmAb只识别1个相同的表位 (未列出). 作者蕾彳r?邦鲁奇,J,,53岁.Ij听克蔓,硪士生导坪 石末庄审友谊由大街46号,Te1.(0311)3o32219.0354 (下转第294页) 螺 麦许 凝 294细胞与分子免疫学杂卷0CellMolImmunoD1998Dec}14(4) 株的OD值普遍较低,可能与半抗原的分子量较小 有关叫. 6株抗GSHmAb的杂交瘤细胞,除3B11分泌 IgG2a外,其余5株细胞均分泌IgM,可能是因为 IgM为免疫早期产生的主要抗体,并与加强免疫后 48h融合有关.另外,由于M在结合位点的数量 上占有优势,故筛出的杂交瘤细胞大多散是分泌 lgM的细胞.mAb的抗原结合部位的N端前2O个 氨基酸残基中.古有3,4个丝氨酸,经苯甲基磺酰 氟(PMSF)活化,再用Hll;e处理后,可转变成硒代 半肮氨酸($esys),而形成具有GPX活性的催化抗 体[.】.该催化抗体的奠活性是天然GPX的5倍,因 此.抗GSHmAb的研1lj,为基因抗体奠的研 究奠定了良好的物质基础. (上接第284页) 参考文献 1BookA,D_W.you.~R4.Selenoeystlnetthe21st -H血m?MolMi=ol~ol,l鲫1-5(3)_316—525 3RoeherC,FaueheuC.HerveF.aDofmu妇& GPXcDNA-丑da}~themkofmut丑GPXprote~ ched曲0oli.Ge酏.1991-151_193—198 3A.udulH,Hendle~I.r-KaspaIda,,C?t|,an’,~mdies, MiliuuyM出i瞻.1996I161_1--? 4Gu曲L,L?nmLD,Gene~atlo,ofsele~ium-ccmtsinlng Ib珂?嶂by哪i丑|ch?icI,mutation,Biochem?nd鼬IphRes Cbm盈衄.19?193(3)f1340--1349 5柬早4mAb的Ig亚类鉴定昧AS?2E5和AR一 4E6分别为IgG2a与IgG2b外t其余3株mAb (AS-1G5,AR一2C6和4C10)均属于IgGl亚类. 2.2.5mAb索和常数的洲定5株抗SmmAb, 抗RNPmAb(AS.185,A2E5,AR一2C6,AR一4c 10和AR?4E6)的Ka值依次为t(3.24士1.08)× 10一’,(,,,0士0.65)×10一’,(7,72士1.74)× 10.,(5.56士3.18)×10一”及(3.02士0.76)× 10一.可以看出t本文测定的结果数据离散小,两 株抗SmmAb的亲和常数均比抗RNPmAb的亲 和常数约小1,2个数量级. sm和RNP均为弱免疫原t使用常规方法很难 激发小鼠的免疫应答.应用ENA免疫有所改善t 但仍需使用皮下包埋的方j缶,而且免疫时间较长. 本研究中融合率虽较高,但阳性克隆甚少,说明针 对Sm和RNP的B细胞比倒偏小.提示在研制抗 弱免疫原的mAb时,应格外重视免疫这一环节. 本文研制的8株mAb特异性甚好.抗Sm mAb与RNP,La(SS?B)及抗RNPmAb与SmtLa (sB)均无交叉反应.但8株mAb与Ro(SS—A) 却有轻度交叉反应,可能与Ro(SS-A)的纯度稍差 有关.也可能为其它因素所致t有待进一步证实. 霾们制备的抗SinmAb和抗RNPmAb,可用 于制备mAb亲和层析柱纯化Sin和RNP,进而研 谢有关的诊断试赉喑盒,供临床测定抗Sin抗体和抗 RNP抗体. 参考文献 1瘩建国主?,实用赣床免疫学撞毪南京扛苏科学拄术出版 址?1990_279--228 3事皓虹?马一良?橱膏单辱.免疫抗 ENA抗体的比较.中目竞痤拳杂毒.1997-lS(8)tS14 3尊天王,羽t荣,王t平等.精鼻可挺取性棱抗原的憎备生? 化学与生??蕊进晨?19~6,6-37—4O 4M,K.Ch~mationof螂瑚,do岫曲湘 h.ma.I|l?hof丑?e,mpp=~of-mdn 岫ontheho~mane.a?al曲,1983-133,333— 224 5镣毒电主?,宴用单竞?抗体技术.酉安一陕西科学技木出版 牡,l神?一82 9FrigaetB,a船砒eAF,0h_ni眦L时a1.M哪I舶} mtofthetIIIe?f,in|铒coat,antinsoludonof血ibody bycreChe-linkediml蚺啦tusay.J呐olMethDdl. ,985{“{3o5—319 7张魅全,陈轴?,郜岳奇辱.抗牛FsIl单克t抗体真实素和力 膏效的甜皇.上毒免疫掌杂考,1993I13(8)t154--155 (收籍1998-03?18謦圄1998-04-15)