【2016年】胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响【临床医学论文】

【2016年】胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的影响【临床医学】 临床医学论文-胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞增殖的 影响 【摘要】 目的: 研究胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)增殖的影 响。: 采用细胞计数和MTT法观察不同稀释度胎盘多肽作用72 h后，ECV-304 细胞增殖情况。同时以免疫组织化学法检测不同稀释度胎盘多肽对ECV-304细胞 增殖细胞核抗原(PCNA)达的影响。结果: 一定稀释度的胎盘多肽可促进 ECV-304细胞的增殖，25 ml/L即可发挥作用，200 ml/L作用最明显。ECV-304 细胞PCNA表达阳性率与胎盘多肽稀释度呈剂量相关性。结论: 胎盘多肽可促进 体外培养的ECV-304细胞增殖。 【关键词】 胎盘; 细胞计数; 免疫组织化学; 胎盘多肽; 内皮细胞 ,Abstract, Objective: To investigate the effects of placenta polypeptide on the proliferation of human umbilical vein endothelial cell (ECV-304) in vitro. Methods: ECV-304 cells were treated with different concentrations of placenta polypeptide, and the ECV-304 proliferation was observed with cytometry, and MTT in 72 h.Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was observed with immunohistochemistry method at the same time. Results: in the range of 25~400 ml/L, placenta polypeptide showed effect on ECV-304 proliferation in vitro in a dose-dependent manner and the maximal effect showed at 200 ml/L. Positive PCNA expression of ECV-304 correlated with placenta polypeptide concentrations used. Conclusion: Placenta polypeptide could promote the proliferation of ECV-304 in vitro. ,Key words, placenta; cell count; immunohistochemistry; placents polypeptide; endothelial cell 近年来，随着人们对胎盘研究的逐步深入，胎盘的加工从简单的烘干与水煮发展到生物萃取，使人们对胎盘所含的生物活性物质及其功能有了更深入的认识,1,。2007年3~10月通过测定胎盘多肽注射液对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)增殖可能产生的影响，为进一步研究利用胎盘多肽对血管内皮进行修复做初步的探讨。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 胎盘多肽注射液 贵州益康制药有限公司惠赠。批准文号:国药准 字H20046260，4 ml/支。 1.1.2 细胞株 ECV-304购自中科院上海细胞生物学研究所。 1.1.3 主要试剂 RPMI 1640培养液(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);MTT和二甲亚砜(国产纯)。增殖细胞核抗原PCNA免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。 1.1.4 仪器 二氧化碳培养箱(美国FORMA公司)、倒置相差显微镜(日本NIKON公司)、酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)。 1.2 方法和步骤 1.2.1 药物及细胞处理 将胎盘多肽注射液用含0.4%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释成下列稀释度: 200、100、50、25、12.5 ml/L。4 ?保存备用。ECV-304培养至单层，细胞处于对数生长期备用。 1.2.2 细胞计数 取对数生长期的ECV-304细胞，0.25%胰酶消化后,用含10%胎牛血清的RPMI 1640制成细胞悬液，以8×104/ml接种于96孔板，每孔100 μl。待细胞贴壁后换成含不同稀释度胎盘多肽注射液的维持培养液(含0.4%胎牛血清),并设对照，每个稀释度做3个复孔。置于37 ?,5%CO2 培养箱培养。加药后72 h各剂量组做细胞计数,重复实验3次。 1.2.3 MTT比色法 取对数生长期的ECV-304细胞，0.25%胰酶消化后,用含10%胎牛血清的RPMI 1640制成细胞悬液，以8×104/ml接种于96孔板，每孔100 μl。待细胞贴壁后换成含不同稀释度胎盘多肽注射液的维持培养液,每个稀释度3个复孔。培养72 h后每孔加入10 μl MTT(5 ml/L),置37 ?,5 %CO2 培养箱培养4 h 后,弃培养上清液,每孔加入100 μl DMSO ,振荡器振荡10 min，酶联免疫检测仪进行检测，参比波长490 nm，实验重复3次。 1.2.4 增殖细胞核抗原(PCNA)的表达 在6孔板中预置盖玻片，以8×104/ml接种ECV-304于6孔板，每孔1 ml,并在每孔中补加1 ml培养液。待细胞贴壁后换成含不同稀释度胎盘多肽的维持培养液。 置于37 ?,5 %CO2 培养箱培养72 h，取出盖玻片，用4 ?冷丙酮固定后，以免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。ECV-304染色阳性率计算方法:分别在4个高倍视野下，计算阳性细胞数和总细胞数，阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%。 2 结果 实验结果见表1。表中可见，与ECV-304共培养72 h，除12.5 ml/L组细胞数量与对照组无差异，其余不同稀释度的胎盘多肽处理组较对照组差异有显着性;胎盘多肽可促进ECV-304的增殖，且呈剂量相关性，最小剂量为25 ml/L，在200 ml/L时发挥最大作用(P，0.05)。MTT比色结果显示，12.5 ml/L组细胞OD值与对照组无差异，其余各组OD值与对照组存有差异，胎盘多肽可促进ECV-304的增殖，且呈剂量相关性，最小剂量为25 ml/L，在200 ml/L时发挥最大作用(P，0.05)。PCNA的表达各组均阳性，除12.5 ml/L组外，各组阳性细胞率与细胞对照组均存有差异，且呈剂量相关性，最小剂量为25 ml/L，在200 ml/L时发挥最大作用(P，0.05)。表1 不同稀释度胎盘多肽72 h对ECV-304细胞数量、增殖、PCNA表达的影响 3 讨论 当前，如晚期冠状动脉病变这样的缺血性疾病严重威胁着人类健康，也成为我国病死率和病残率不断上升的主要原因,2,。血管新生是个过程，实验研究表明，血管新生和重建是一个逐步的过程，在此过程中的不同阶段，有如VEGF、bFGF和Angiopoietin-1等多种诱导因子参与。这些因子的参与对血管内皮细胞的增殖和迁移，形成均匀一致的初始血管网和后期重塑均有重要作用,3~5,。如仅用单一因子诱导血管新生，则难以形成完整、具备正常功能的成熟血管网，此种血管往往都有渗漏且不稳定。 胎盘多肽作为人胎盘的生物萃取物，含有多种分子量在3~5 kDa的小分子多肽，其中可能含有血管新生所需的多种诱导因子,6,。本研究初步发现，胎盘多肽在一定稀释度范围内，可有效促进ECV-304细胞的增殖，提示其在诱导 治疗性血管新生上存有潜在的应用价值，胎盘多肽对血管新生在功能上可起到何种效果，有待进一步的实验研究工作予以阐明。 【参考文献】 [1] Odorisio T, Schietroma C, Zaccaria ML，et al. Mice over-expressing placenta growth factor exhibit increased vascularization and vessel permeability[J].Cell Sci, 2002(12) : 2559. [2] 金惠铭. 治疗性血管新生研究的若干进展[J]. 国外医学 生理病理科学与 临床分册,2003(4):331-333. [3] 张淑二,陶勇,张运海,等.胎盘的有效成分及其应用[J]. 动物医学进 展,2007(9):103-107. [4] 刘小雨, 王行宽.促血管新生的中医药治疗现状[J]. 中国组织研究与 临床康复,2007(11):1918-1922. [5] 金惠铭,梁光波,张国平.用Millicell底膜培养皿研究Tourmaline对 ECV-304细胞增殖的影响[J].中国微循环,2003(5):309-311. [6] 张焱,胡光,洪思佳,等. 黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用[J].中药药理与临床,2007(2) :34-37.