【doc】还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响

【doc】还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响 还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性 的影响 l9卷6期 2003年11月 生物工程 ChineseJournalofBiotechnology Vo1.19No.6 November2003 还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响 熊盛张美英钱垂文冉延超王一飞任向荣粟宽源余宙耀* .(暨南大学生物医药研究开发基地,广州510632) (解放军458医院全军传染病中心,广州510640) 摘要探讨大肠杆菌细胞质氧化还原环境对重组蛋白溶解性的影响.选择含有1对二硫键的牛碱性成纤维细 胞生长因子(BbFGF)作为简单蛋白的模式分子,选择含有2对二硫键的人抗HBsAg单链抗体(HBscf’v)作为复杂蛋 白的模式分子,分别构建达质粒并转化普通宿主菌和还原酶缺陷型宿主菌E.coliO咄ami(DE3),比较表达产物 的溶解性和纯化产物的活性.结果发现,BbFGF在普通宿主菌中大部分形成包涵体,在Origami(DE3)中为可溶性表 达,但表达量降低.两种工程菌的表达产物经离子交换和肝素亲和层析两步纯化后,M1Tr法测定活性,发现来自还 原酶缺陷型宿主菌的BbFGF活性高于普通宿主菌表达产物,二者的ED分别是1.6n异,mL和2.2ng/mL;HBscf’v在 两种宿主菌中均形成包涵体,包涵体以6mol/L盐酸胍缓冲液溶解后,镍离子螫合亲和层析纯化并透析复性,间接 ELISA测定抗原结合活性,发现二者活性无明显差异,但在Origami(DE3)菌体破碎后的的上清中可检测到HBscf’v活 性,纯化后产量为1—2mg/L,而在普通宿主菌破碎后的上清中检测不到HBscFv活性.上述结果说明,改变宿主菌 细胞质氧化还原环境对于含有1,2对二硫键的重组蛋白的可溶性表达具有明显促进作用. 关键词还原酶,缺陷,碱性成纤维细胞生长因子,单链抗体,包涵体 中图分类号Q786文献标识码A文章编号lOOO一3061(2003)O6—0686.06 到目前为止,大肠杆菌仍是重组蛋白表达的首选 表达系统.经过近加年的发展,大肠杆菌表达系统的 主要改进方向之一是提高重组蛋白在宿主细胞质中的 溶解性…,这可通过两条途径实现:其一,通过DNA重 组技术,使目的蛋白与分子伴侣或折叠酶形成融合分 子,pE332,pET44即是这一类表达载体的代表;其二, 利用遗传学技术,改变大肠杆菌细胞质的氧化还原环 境,即突变其中的还原酶系,这一途径的效果如何还知 之甚少.为了探讨细胞质环境对不同类型外源蛋白表 达的影响,我们选择前期研究获得的牛碱性成纤维细 胞生长因子(BovinebasicFibroblastGrowthFactor,BbF— GF)和人源抗HBsAg单链抗体(humananti—HBsAgsingle— chainFv,HBscFv)作为含有一对二硫键的简单蛋白和含 有多对二硫键的复杂蛋白的模式分子,将其分别转入 普通大肠杆菌和还原酶系缺陷型大肠杆菌Origami (DE3)中表达,比较表达产物的溶解性,为其它同类重 组蛋白的表达提供借鉴. BbFGF是一种具有多种生物活性的非糖基化单 链多肽,其开放阅读框编码长155个氨基酸残基的 多肽分子,分子中含有4个半胱氨酸,其中,c和 c...形成二硫键,而c和C96游离存在.多项研究表 明,重组BbFGF在大肠杆菌中高表达时,容易部分 形成包涵体.定点突变c和C%后,可以一定程度 上克服这一问题,但需要改变基因结构,并且突变后 的蛋白分子活性降低,不利于该蛋白的药用开 发-.HBscFv_5是一株人源重组小分子抗体,分 子中也含有4个半胱氨酸,但均参与二硫键形成. 由于单链抗体分子中的二硫键为构象和活性所必 须,不能通过定点突变减少蛋白在折叠过程中形成 错配中间体的可能性和数量,并且,单链抗体本身是 一 种人工的分子,折叠过程中的不确定因素更 多,所以HBscFv比BbFGF更难在大肠杆菌细胞质 中获得可溶性表达. 1材料和方法 1.1实验材料 1.1.1菌株和质粒:质粒pJN—BbFGF以pET3c衍生 收稿日期:2003—03—10,修回日期:2003—06—10. 基金项目:国家863高技术研究项目(N0.2001AA215041)及广州市科技局重大攻关项目(No.99—2-010—01)基金资助. *通讯作 者.Tel:86.20—85222706;Fax:86—20—85220908;E—mail:xs123@263.n et 6期熊盛等:还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响687 质粒pJN982为载体而构建,含有BbFGF编码序 列;质粒pQE—HBscFv源自pQE一40,携有腮c编码 序列,这两种质粒均为Amp抗性质粒.宿主菌 E.coliBL21(DE3)购自Novagen公司,基因型为F— OmpThsdSB(一,MB一)dcmgal(DE3),E.coli Origami(DE3)购自Novagen公司,基因型为?ara— leu7697?laeX74AphoAPvuHphoRaraD139galE galKrspLF[z们一(1acP)pro]gor522::10(%) trxB::kan(DE3),E.coliM15[pREP]购自QIAGEN 公司,表型为:Nal,Str,RiF,Thi一,lac一,Am, Gal,Mtl一,F一,RecA一,Uvr,Lon. 1.1.2主要试剂:质粒提取试剂盒购自上海华舜生 物工程公司;诱导剂IPTG购自Promega公司;层析基 质BioRex70购自Bio—Rad公司,HeparinHyperD购 自Kronlab公司,His.TrapTM镍离子螯合柱,SP—seph— aroseCL一4B购自Pharmacia公司;Mr不购自Sigma公 司;重组HBsAg购自中山生物工程公司;兔抗HB— scFv由本室自制;其它化学试剂为进口或国产 纯试剂. 1.2实验方法 1.2.1工程菌构建:质粒提取及转化大肠杆菌均参 照文献[7]进行. 1.2.2BbFGF的表达:工程菌BL[pJN—BbFGF]新鲜 培养物单菌落接种2mL含抗生素的LB培养基, 37?,220r/min振荡培养过夜;第2天按1:100比例 转入200mL含相同抗生素的2×YT培养基中,振荡 培养4h至D|D锄为1.0,加入IPTG至终浓度为 1retool/L,诱导4h后离心收集菌体,超声破碎,收集 沉淀和上清,供表达分析或小量纯化用.工程菌 Origami[pJN—BbFGF]以相同条件培养,并诱导目的蛋 白表达. 1.2.3BbFGF的纯化J:含BbFGF的组分上样Bio Rex70,缓冲液洗去未交换的蛋白,用含0.6mol/L NaC1的PBS洗脱目的蛋白;然后上样HeparinHyper D,用含0.6mol/LNaC1的PBS洗脱未结合的蛋白,收 集含1.2mol/LNaC1的缓冲液洗脱组份,得到BbFGF 重组产物.凝胶光密度扫描结果表明,重组BbFGF 纯度大于96%. 1.2.4BbFGF的活性测定:MTY法,参照文献E9]进行. 1.2.5HBscFv的表达:工程菌M15[pQE—HBscFv]单 菌落接种5mL含100mg/LAmp,25mg/LKana的LB 培养基中,37?振荡培养过夜;第2天按1:100比例 转入200mL含相同抗生素的2×YT培养基中,振荡 培养4h至D|D锄为1.0,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,诱导6h后离心收集菌体?...工程菌Origa— mi[pQE—HBscFv]接种于含100mg/LAmp的培养基 中,相同条件培养,并诱导目的蛋白表达. 1.2.6HBscFv的纯化.’川:诱导后的菌体超声破 碎,离心收集沉淀,溶解于含6mol/LGuHC1的变性 缓冲液中,上样His—TrapTM镍离子螯合柱,收集目的 峰,然后使用优化的透析工艺,分步透析复性.位于 上清中的HBscFv先以SP—sepharoseCL-4B柱初步纯 化,然后以His.TrapTM镍离子螯合柱精制. 1.2.7HBscFv的活性测定:间接ELISA法?.包 被有HBsAg的酶标板加入HBscFv样品,以兔抗HB— scFv作为第一抗体,HRP标记的羊抗兔IgG作为第 二抗体,TMB显色,酶标仪450nm/630nm波长测定 吸光度 2结果 2.1工程菌构建 质粒pJN—BbFGF转化E.coliBL21(DE3)后,得 工程菌BL[pJN—BbFGF],转化E.coliOrigami(DE3) 后,得工程菌Origami[pJN.BbFGF].Fig.1是质粒 pJN—BbFGF的结构示意图,目的基因位于r不噬菌体 启动子的下游,IPTG诱导宿主菌含有的溶源噬菌 体(DE3)上的T7RNA聚合酶表达,从而启动BbFGF 的转录和翻译,表达分子量为20kD的BbFGF融合 蛋白;质粒pQE—HBscFv转化E.coliM15[pREP]后, 得工程菌M15[pQE—HBscFv],转化E.coliOrigami (DE3)后,得工程菌Origami[pQE—HBscFv].Fig.2 是质粒pQE—HBscFv的结构示意图,目的基因由T5 噬菌体启动子控制,在启动子下游含有LacO序列, 所以目的基因也受IPTG诱导表达.另外,在HB— scFv的N末端含有6×His标签,可以应用IMAC纯 化目的蛋白. 图1表达质粒oJN-BbFGF结构 Fig.1StructureoftheexpressionplasmidpiN-BbFGF 2.2BbFGF在两种宿主菌中的表达 分别诱导两种BbFGF工程菌,超声破碎后分别 取上清和沉淀进行SDS.PAGE分析.Fig.3是 688生物工程l9卷 图2表达质粒pQE.HBscFv结构 Fig.2Stmc【ureoftheexpressionplasmidpQE-HBscFv pJN—BbFGF在E.coliBI2.1(DE3)中表达后的蛋白图 谱,其中,Lane2是诱导后菌体破碎的上清,Lane3是 菌体破碎后的沉淀,从图中可以看出,BbFGF在 E.coliBI2.1(DE3)中主要以包涵体形式存在,凝胶 光密度扫描结合蛋白定量分析结果表明,65%目的 蛋白以包涵体形式存在;pJN.BbFGF转化至氧化还 原缺陷型大肠杆菌Origami(DE3)后,表达产物为可 溶蛋白,Fig.4是含有BbFGF表达质粒的E.coli Origami(DE3)菌体破碎后不同组份的SDS—PAGE图 谱,其中Lane2是菌体破碎后的上清,Lane3是菌体 破碎后的沉淀,可见目标蛋白位于上清中,含量占可 溶性蛋白的11.6%. 图3BbFGF在E.coliBI21(DE3)中的表达性质 Fig.3CharacterofBbFGFinE.coliBL21(DE3) 1.Molecularweightstandard;2.Supemalantofthebacterialysate;3 Pelletofthebacterialysate 2.3BbFGF的纯化与活性测定 分别破碎两种BbFGF工程菌,超声破碎后,离 心收集上清,上清液经过阳离子交换和肝素亲和层 析两步纯化后,都可以得到纯度超过96%的目的蛋 白.MTT法活性测定结果表明,二者均有促有丝分 裂活性,Fjg.5是活性测定曲线,经计算,来自Origa— mi(DE3)的BbFGF的ED?是1.6ng/mL,来自BL21 (DE3)的BbFGF的ED是2.2ng/mL,活性略低于 Origami(DE3)表达产物.但在实验中发现,Origami (DE3)中BbFGF的表达量明显较低,不同菌落的表 达量在5%,10%之间,而BI21(DE3)表达BbFGF 的表达量在l5%,23%之间,二者差异明显(SDS— PAGE原始结果未显示). 图4BbFGF在E.coliOrigami(DE3)中的表达性质 - Fig.4CharacterofBbFGFinE.coliOrigami(DE3) 1.Molecularwei【shtstandard;2.Supemalantofthebacterialysate; 3.Pelletofthebacterialysate 图5两种来源BbFGF的生物活性测定结果 Fig.5BioactivityofBbFGFproducedfrom twostrainsofE.coli kD 974 662 427 310 201 144 Fv 图6HBscFv在E.coliM15EpREP4]中的表达性质 Fig.6CharacterofHBscFvinE.co//M15[pREP4] 1.Molecularweightstandard;2.Supemalantofthebacterialysate;3 Pelletofthebacterialysate 2.4HBscFv在两种宿主菌中的表达 工程菌M15[pQE—HBscFv]经诱导培养后,表达 D424k卯驼加H 6期熊盛等:还原酶缺陷型大肠杆菌对重组蛋白溶解性的影响689 大量重组蛋白,但以包涵体形式存在.Fig.6是 M15lpQE-HBscFv]诱导后菌体的上清和沉淀的SDS. PAGE分析结果,可见目的蛋白HBscFv(28kD)位于 沉淀中.工程菌Origami[pQE.HBscFv]以相同条件 培养并诱导,收集菌体后超声破碎,SDS.PAGE分析 目的蛋白性质,结果发现,HBscFv在E.c0liOrigami (DE3)中仍然以包涵体形式存在.Fig.7中【ane2 是菌体破碎后的上清,Lane3是菌体破碎后的沉淀, 可以看出HBscFv位于沉淀中,但在上清的相应位置 也有增粗的蛋白带,含量占可溶性总蛋白的4.7%, 为了确定该条带性质,对上清进行活性测定. 图7HBscFv在E.coliOrigami(DE3)中的表达性质 Fig.7CharacterofHBmFvinE.coliOrigami(DE3) 1.Pelletofthebacterialysate;2.Supematantofthebacterialysate;3 Molecularweightstandard 2.5HB~Fv的纯化与活性测定 收集两种工程菌破碎后的组分,上清调整蛋白 浓度,使其一致,然后直接测定活性.发现M15 [pQE.HBscFv]的上清中检测不到HBscFv活性 (30=0.05,与阴性对照相当),而在Origami [pQE.HBscFv]菌体破碎后的上清中可检测到较弱的 HBscFv活性(:0.21).Fig.8中空心柱是等 量菌体可溶性总蛋白的活性测定结果,可见二者差 异明显.对Origami[pQE.HBscFv]上清中的HBscFv 进行纯化,产量为1,2mg/L. 将两种菌体破碎后的沉淀溶解于变性缓冲液 中,纯化并透析复性后,调整蛋白浓度一致,测定活 性,结果也示于Fig.8中(实心柱),可以看出,两种 工程菌表达的HBscFv包涵体经复性后,均有抗原结 合活性,二者相比较,活性无明显差异. 3讨论 在大肠杆菌细胞质中,至少有5种蛋白质可以 ControlHBscFvlHBscFv2 图8两种HBscFv的抗原结合活性 Fig.8BioactivityofrecombinantHB~Fvsproduced fromtwostrainsofE.coli HBscFvl,HBscFvproducedfromM15[pQE—HBscFv] HBscFv2,HBscFvproducedfromOrigami[pQE—HBscFv] 将瞬时形成的二硫键还原n.这5种蛋白质分别 是thioredoxins1,2和glutaredoxinsl,2,3,这两类蛋白 质又需要硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶使其 保持在还原状态,因此,通过遗传工程手段全部或部 分突变这些”破坏”二硫键的蛋白后,可在一定程度 上促进外源蛋白在胞质中的正确折叠. E.coliOrigami(DE3)是一种硫氧还蛋白还原酶 基因(Thioredoxinreductase,trxB)和谷胱甘肽还原酶 基因(Glutathionereductase,gor)均被插入失活的新型 宿主菌,该宿主菌细胞质中的氧化还原电势较高,有 利于外源重组蛋白在细胞质中形成正确空间构象. 有研究表明,一些结构复杂的酶蛋白在这种氧化还 原缺陷型宿主菌中也可部分形成正确构象?.本 文的研究结果发现,pJN.BbFGF在E.coliBL21 (DE3)中表达时,产物大部分形成包涵体,但在 E.coliOrigami(DE3)中可获得可溶性表达;而结构 复杂的单链抗体在氧化还原缺陷型宿主菌中的表达 产物主要以包涵体的形式存在,另有少量蛋白可以 正确折叠,以活性形式存在于细胞质中,但其表达量 极低,只相当于包涵体表达量的3%,6%(包涵体 复性后,产量可达30,35mg/L?..),说明改变细胞质 氧化还原环境可克服一些简单蛋白高表达过程中形 成的包涵体,但对于含有多对二硫键的复杂蛋白,只 能获得部分正确折叠的蛋白,仍无法实现可溶性高 效表达的目标. 蛋白质的折叠是一个复杂的生化过程,涉及到 多种蛋白和辅助因子的参与,克服一种影响因素可 能促进某些重组蛋白的折叠,但无法设计一种适用 于所有重组蛋白的”万能”表达系统.因此,在需要 852963O ??lOOO 0n0 427O?4 卯舵加H 生物工程l9卷 高表达一种新的复杂蛋白时,常常要通过”trial—and— eiTor”来选择合适的表达系统,并结合宿主菌遗传特 性的改造和培养条件的优化来进行. 本文应用E.coliOrigami(DE3)表达BbFGF时, 获得可溶性目的蛋白,但表达量下降,由此而产生的 问题是:BbFGF的可溶性表达是否因目的蛋白的表 达量下降而引起?更进一步,表达量的下降是否因 为细胞质氧化还原环境的改变而致?对于BL [pJN—BbFGF]来说,曾尝试改变诱导条件来降低目的 蛋白表达量,但仍无法改变目的蛋白形成包涵体这 一 特性.至于表达量下降与还原酶缺陷之间的关 系,从本文结果看,似乎二者之间存在一定联系,进 一 步结论有待更多实验结果证实. 本文所表达的HBscFv是一株重组人源小分子 抗体.重组抗体适合在高等哺乳动物细胞表达系统 中表达,但其大规模培养技术在国内进展缓慢,如何 高效廉价生产重组抗体是制约抗体工程发展的最后 一 道瓶颈.本株HBscFv曾在多种大肠杆菌表达系 统中表达,但均形成包涵体.本文的研究在可溶性 表达方面有所突破,如果能结合其它影响因素,比 如:优化工程菌的培养条件,或者利用低表达的 兼容质粒,适当提高宿主菌胞质中分子伴侣和/或折 叠酶的含量,都有可能进一步提高大肠杆菌胞质中 活性分子的比例,Kurokawa等就利用DsbC促进了 hNGF在大肠杆菌周质腔中的可溶性表达.如果 这些能获得预期结果,则对重组抗体和其它药 用蛋白的工程化意义重大. 致谢:感谢暨南大学生物工程研究所张玲老师协助 进行BbFGF的纯化工作. 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TostudytheinfluenceofE.colicytoplasmonthesolubilityofrecombinantproteinsproducedinit,bovinefibroblastgrowthfac— tor(BbFGF),withsingledisulfidebond,andanti—HBsAgsingle?chainFv( HBscFv),withtwodisulfidebonds,wereselectedas thepatternmoleculesofsimpleproteinandcomplexprotein,respectively.pJN98一BbFGF,aBbFGFexpressingplasmidbasedon thevectorpET3c,wasconstructedandtransformedintonormalhostBL21(DE3)andareductasedeficientstrain,E.c02Orig. ami(DE3).Atthesametime,pQE?HBscFv,aHBscFvexpressingplasmidwasconstructedandtransformedintoM15[pREP4] andOrigami(DE3).TherecombinantBbFGFandHBscFvwereproducedin2typesofbacteriaandtheirsolubilitiesandbioac. tivitiesweredetermined,respectively.ItwasfoundthatthemajorityofBbFGFhadformedinclusionbodyinthecytoplasmof BL21(DE3)andallofthemturnedintosolubleproteininOrigami(DE3).ItwasalsofoundtheproductivityofBbFGFinOrigami (DE3)was5%一10%ofthetotalproteinandthevaluewas15%一 23%inBL21(DE3).BbFGFsproducedin2recombinant bacteriawerepurifiedbycationexchangeandheparinaffinitychromatography.MTI”assayrevealedthatthebioactivityofBbFGF purifiedfromOrigami(DE3)washigherthanitscounterpartfromBL21(DE3).TheED50ofBbFGFsfromdifferentbacteriawas 1.6ng/mLand2.2ng/mL,respectively.AsfarasHBscFvs,bothofthemformedinclusionbodyinthecytoplasmofM15 [pQE.HBscFv]andOrigami[pQE.HBscFv].Theinclusionbodywassolubilizedin6mol/LGuHC1,purifiedwithaHis.TrapT~ columnandthenrefoldedbydialysisstep?by?stepagainstbufferscontainingdowntrendconcentrationofGuHC1.IndirectELISA wasappliedtodeterminetheHBsAgbindingactivityofHBscFvs.Itwasfoundtherewasnoobviousdifferencebetweenthebioac— tivityofrefoldedHBscFvsproducedfrom2recombinantbacteria.Ontheotherhand,thesupernatantofOrigamilpQE—HBscFvJ lysatedisplayedweakbioactivityanditscounterpartfromM15[pQE—HBsc Fv]displayedwithoutanybioactivity.Thesoluble HBsFvinthecytoplasmofOrigami[pQE—HBscFv]waspurifiedbycatione xchangeandimmobilizedmetalaffinitychromatogra? phy(IMAC)andtheyieldwas1—2mg/L.Thoseresultssuggestedthatmodifi cationoftheredoxenvironmentofE.colicyto— bondedprot plasmgreatlyimprovedthesolubilityofrecombinantdisulfide— einsproducedinit.Inthenextstep.wehadliketoco. expressofmolecularchaperonesorrefoldasetoraisetheyieldofsolublerecombinantproteins,aswellasoptimizingtheculture conditionofthe’’oxidizing”E.coli. Keywordsreductase,deficient,bFGF,single?chainFv,inclusionbody Received:03.10.2003 11lisw0rkwassupportedbyGrantofNational”863”High?techProject(No.2001AA215041)andKeyGrantProjectofGuangzhouMunicipaJDepartmentof ScienceandTechnology(No.99?2?010?01). *Correspondingan~orTel:86?20?85222706;Fax:86—20?85220908;E-m ail:xsh123@263?net