大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防护作用

大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防护作用 大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防 护作用 氨基酸和生物资源2009,31(4):51,55 AntinoAcids&BioticRe$ol~rce5 大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防护作用 贾海泉,金宏,李培兵,吴健全,南文考,王永辉,邓炳楠,高兰兴 (军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050) 摘要:目的研究大豆异黄酮(SI)对小鼠淋巴细胞的辐射防护作用.方法24只雄性昆明小鼠,随机分为正常对照组,辐射 对照组和辐射补充0.5%SI组,喂养2周后,4.0Gy照射.照射后24h处死小鼠,取血,胸腺和脾脏分离淋巴细胞,进行血淋巴 细胞计数,观察DNA损伤情况;培养胸腺和脾脏淋巴细胞,检测H—dT掺入量,观察淋巴细胞的增殖能力,计算淋巴细胞的增 殖指数.结果辐射使小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞数明显减少,胸腺淋巴细胞增殖能力和脾脏淋巴细胞转化指数降低,血淋巴细 胞DNA损伤增加,这些变化均具有统计学意义;补充sI可降低胸腺和脾脏淋巴细胞数的减少幅度,降低胸腺淋巴细胞增殖能 力和脾脏淋巴细胞转化指数下降幅度,减少辐射对血淋巴细胞DNA损伤程度,其中sI对胸腺淋巴细胞增殖能力和对血淋巴 细胞DNA损伤程度的防护作用与辐射对照组相比有统计学意义.结论大豆异黄酮可对小鼠的血,胸腺和脾脏淋巴细胞有一 定的辐射防护作用. 关键词:电离辐射;大豆异黄酮;淋巴细胞 中图分类号:R151.2文献标识码:A文章编号:1006—8376(2009)04—0o51一O5 大豆异黄酮(soybeanisoflavones,SI)具有防癌, 抗衰老,抗氧化,防治骨质疏松以及调节细胞的基因 达,抑制细胞凋亡,调节免疫功能等作用,最 近的研究表明其还具有良好的抗电离辐射作用』. 电离辐射为非特异性刺激,作用于机体引起细胞,组 织,器官系统乃至整个机体代谢功能的损伤,其中机 体的免疫系统对电离辐射极为敏感,淋巴细胞是免 疫系统发挥作用的关键细胞,也是对辐射最敏感的 细胞群体之一;人受到电离辐射后,可引起淋巴细胞 转化能力下降,T淋巴细胞亚群失调等一系列变 化.因此,在辐射防护中增强对淋巴细胞的保护 是非常必要的.本文观察了大豆异黄酮对辐射损伤 小鼠淋巴细胞的影响,为大豆异黄酮抗辐射功能食 品的开发提供实验资料. 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1实验动物:清洁级昆明小鼠,体重16,18g, 由军事医学科学院实验动物中心提供. 1.1.2大豆异黄酮的制备与鉴定:按文献[5]的方法 进行. 1.2主要试剂和仪器 1.2.1主要仪器 "Cs辐射源,中国医学科学院放射医学研究所 收稿}{期:2009—07—01 作者简介:贾海泉,男(1978一)博士,从事营养代谢研究 通讯作者 提供. 液体闪烁计数仪:芬兰Pharmacia—wallac1209 Rackbeta 1.2.2主要试剂 小鼠淋巴细胞分离液:中国医学科学院血研所 产品,比重1.092.RPMI一1640培养基:Hyclone公 司,外加青霉素1×10u?L,链霉素1×10Ixg? L和10%小牛血清.H—TdR:中国原子能研究 所,每毫升37MBq.ConA:Sigma公司. PBS液:NaC18g?L,,KC10.2g?L.., Na2HPO4?H201.56g?L,,KH2PO40.2g?L 细胞裂解液:2.5mol?LNaC1和100mmol? L—Na2EDTA的10mmol?LTris缓冲液,pH8.1, 临用前加入1%的TritonX一100和10%二甲基亚砜 (DMSO). 电泳缓冲液:1mmol?L,Na2EDTA,300mmol ? LNaOH溶液,pHl2. 1.3实验方法 1.3.1动物实验方法 雄性昆明种小鼠24只,体重18,20g,领养后 适应喂养3d,换15%酪蛋白合成饲料(饲料配方参 照AIN一93M略有改进)适应5d,按体重随机分为 正常组,对照组和实验组,每组8只,正常组和对照 组继续喂15%酪蛋白饲料,实验组在15%酪蛋白饲 料的基础上添加0.5%的大豆异黄酮;喂养2周后, 对照组和实验组4.0Gy照射,于照射后24h杀死小 鼠取血,胸腺和脾脏.分离血淋巴细胞,观察DNA ? 52?贾海泉等:大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防护作用 损伤情况;分离胸腺和脾脏淋巴细胞,显微镜下进行 淋巴细胞计数,培养淋巴细胞,检测HdT掺入量,观 察淋巴细胞的增殖能力,计算淋巴细胞的增殖指数. 1.3.2观察指标和测定方法 1.3.2.1胸腺,脾脏淋巴细胞计数 取小鼠胸腺和脾脏,研碎经200目滤网过滤,细 胞悬浮于5mLPBS液中,显微镜下计数. 1.3.2.2胸腺和脾脏淋巴细胞3H—TdR掺入实验 按文献[6]的方法,无菌下取小鼠胸腺和脾脏, 置于盛有RPMI一1640培养液的平皿中,剪成小块, 研磨,200目网过滤制成单细胞悬液,1500r?min 离心10rain,弃上清,Hank液洗涤细胞2次,将其 悬浮于培养液中计数后备用. 胸腺淋巴细胞自发增殖能力测定:细胞培养板 每:fL~1人100L细胞数为1×10m个/L的胸腺细 胞悬液和100txL培养液(含H—TdR1.85× 10Bq),每样品设3个复孔,置37?,饱和湿度,5% CO,条件下培养4h,细胞收集于49型玻璃纤维滤 纸上,抽吸过滤,洗涤,滤纸用红外线烤干,浸于5 mL闪烁液中,在液闪计数仪上测定cpm值. 脾淋巴细胞对有丝分裂原反应性测定:培养板 每孔加入细胞数为5×10个/L的细胞悬液100 txL,ConA100IxL(终浓度为每毫升5g),每样品设 3个复孔;对照孔中加入不含ConA的培养液.置 37~C,饱和湿度,5%CO条件下培养72h,在终止培 养前6h加入H—TdR(1.85×10Bq/~L),培养物 收集于49型玻璃纤维滤纸上,抽吸过滤洗涤,滤纸 烘干浸于闪烁液中,计数器测定3H—TdR掺人量, 以每分钟脉冲数(cpm)表示.按下式计算淋巴细胞 转化指数(或称ConA刺激指数StimulationIndex): 淋巴细胞转化指数= 1.3.2.3外周血淋巴细胞单细胞凝胶电泳实验 (SCGE) 按文献[7,8]方法进行,具体操作如下:(1)制 备单细胞悬液:取血加在淋巴细胞分离液面上,1500 r?min一离心10min,取淋巴细胞,用PBS液洗涤2 次,之后细胞悬于PBS液,进行细胞计数,调整细胞 数2×10个/L. (2)制片:在磨砂载玻片上铺0.5%琼脂糖100 L,为第一层胶;取细胞悬液l0L,在37?下与90 ILL0.75%低熔点琼脂糖混匀铺在第一层胶上,为第 二层胶;取1000.5%低熔点琼脂糖铺在第二层 胶上,为第三层胶. (3)细胞裂解:将铺好的凝胶置于细胞裂解液 中,4?裂解2h,去离子水冲洗凝胶板. (4)电泳:将凝胶板放入电泳槽内,静置20 min,使DNA解旋,25V,300mA电泳20min. (5)中和与固定:电泳后,用0.4mol?LTris — HCI中和胶板至中性,无水乙醇固定40min. (6)染色:凝胶板用5mg?L的溴乙啶染 色15min,蒸馏水漂洗,用显微拍摄装置和Metaph series4.5分析软件拍摄图像,分析图像,计数照片上 彗星状细胞所占百分比及DNA移动距离(m). 1.4统计学处理 数据以均数?标准差(面4-s)表示,采用单因素 方差分析. 2实验结果 2.1SI对辐射小鼠胸腺,脾脏淋巴细胞数的影响 小鼠受到照射后胸腺和脾脏淋巴细胞数急剧减 少,大约比正常对照组低一个数量级,补充SI后,小 鼠胸腺和脾脏淋巴细胞数比照射对照组有所增加, 但无统计学意义,详见表1. 表1Sl对辐射小鼠胸腺,脾脏淋巴细胞数的影响(n=8.i ?S) 与正常对照组比较,P<0.05 2.2SI对辐射小鼠胸腺,脾脏淋巴细胞功能的影响 小鼠受到4Gy射线照射后,不论是胸腺细胞 的自发增殖能力还是脾细胞在有丝分裂原作用下的 转化能力都明显降低;照射前补充SI可提高受照射 小鼠胸腺细胞的增殖活力和脾脏淋巴细胞转化指 数,其中胸腺细胞的自发增殖能力变化有统计学意 义,详见表2. 表2SI对辐射小鼠胸腺细胞增殖能力及脾细胞转化能力 的影响(n=8.?s) 与正常组比较,P<0.05;与辐射对照组比较,P<O.05. 氨基酸和生物资源?53? 2.3SI对照射小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度 的影响 1,2,3分别短示出常对照组,辐射对照组 及SI组小鼠淋巴细胞的彗星实验图像.在本实验 条件下常对照组有2.8%的淋巴细胞拖尾,其尾 长仅为3.2?0.7m,照射对照组受照后【lIL淋巴细 胞的拖尾率及尾长均明增加(P<0.01);补充sI 组小鼠淋巴细胞拖尾牢和尾长均明显低于照射对照 组,并目.差异有显着性(P<0.05),详见表3. 图1正常小鼠淋巴细胞无拖尾 图2辐射小鼠拖尾淋巴细胞增多拖尾较长 图3补充sl小鼠拖尾淋巴细胞较照射组少且拖尾较短 表3SI对照射小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度的影响 与常对照组比较P<0.05;j照射对照组比较P<0.05. 3讨论 淋巴细胞是辐射敏感性最高的细胞之一,研究 sI对淋巴细胞的辐射防护作用,最终应体现在sI对 辐射损伤小鼠淋巴细胞数量和功能的影响.为此, 我们观察了4Gy射线照射后24h,小鼠胸腺和脾 脏的淋巴细胞数量的变化;结果显示,小鼠受照射后 胸腺淋巴细胞数量急剧减少,几乎只有正常对照小 鼠的5%左右;脾脏淋巴细胞数量也显着降低,约为 正常对照小鼠的10%.辐射引起的胸腺细胞减少 比脾脏更为严重,其原因可能是胸腺淋巴细胞比脾 淋巴细胞在发育成熟方面更为幼稚,对辐射的敏感 性更高所致.补充sI可以降低辐射引起的胸腺和 脾脏淋巴细胞数量减少的幅度,说明sI可对辐射所 致的免疫功能损伤有一定的保护作用. 淋巴细胞增殖实验是检验淋巴细胞功能的常用 方法之一,其中H—TdR掺人法是较灵敏的一种淋 巴细胞增殖实验方法.胸腺内的淋巴细胞是处在不 同成熟阶段的T淋巴细胞,具有自发增殖活性, 与H—TdR一起培养可以将培养液中的H—TdR 掺入到合成的DNA分子中,可通过检测掺人DNA 中的H—TdR水平反映淋巴细胞的功能状态;脾脏 中的淋巴细胞属于终末分化细胞,只有在有丝分裂 原的刺激下转化为原始母细胞才具有增殖活性j, 也称为淋巴细胞转化实验,本实验中我们用有丝分 裂原一ConA激活脾脏中的T淋巴细胞,观察其对淋 巴细胞体外转化的刺激作用.实验结果显示小鼠受 到辐射损伤后,不论是胸腺细胞的自发增殖能力还 是脾细胞的转化指数均显着降低,尤其是胸腺细胞 TdR的掺人率仅为正常对照组的5%左右, 的H— 表明电离辐射不论是对中枢免疫器官一胸腺中未完 全成熟的淋巴细胞还是对外周免疫器官一脾脏中的 成熟淋巴细胞都造成了严重的损伤,而对胸腺中淋 巴细胞的损伤更为严重.补充SI可使受照射小鼠 的胸腺细胞H—TdR掺入水平和脾细胞的转化指 数比辐射对照组明显升高,表明补充sI可以减轻辐 射对胸腺和脾脏淋巴细胞的损伤作用,对胸腺淋巴 细胞的防护作用更显着,而胸腺是T淋巴细胞的生 发中心,对胸腺淋巴细胞的防护作用比对外周淋巴 细胞的防护作用意义更大. 电离辐射作用于机体,从照射开始直至出现生 物学效应(细胞死亡或癌变)是一个极其复杂的过 程,DNA的辐射损伤是其中最关键最重要的一环, 而DNA的双链断裂又是辐射引起的各种生物效应 中最重要的原初损伤?.单细胞凝胶电泳实验又 称彗星实验能够在细胞水平上检测DNA损伤,其原 ? 54?贾海泉等:大豆异黄酮对电离辐射小鼠淋巴细胞的防护作用 理是在碱性条件下DNA解螺旋,DNA断片在电场 中移动形成彗星样图像,细胞拖尾表示细胞有DNA 断裂碎片生成,拖尾越长表示DNA断裂越严重. 本实验观察到正常小鼠有少量淋巴细胞产生拖尾现 象,这可能是淋巴细胞进行自我更新时产生的凋亡 细胞;小鼠受到照射后细胞拖尾率和尾长都明显增 加,表明辐射造成淋巴细胞DNA断裂损伤,这可能 是辐射导致小鼠血液中淋巴细胞死亡加速的原因; 补充SI后小鼠淋巴细胞的拖尾率及尾长均与照射 对照组比较有不同程度的降低,表明SI可以减轻辐 射对小鼠淋巴细胞DNA的损伤.这与我们实验观 察到受照时淋巴细胞减少,补充sI时淋巴细胞增加 是一致的. 以上结果表明,小鼠受到4Gy^y射线照射后,使 胸腺和脾脏的淋巴细胞数量和功能明显降低,血淋 巴细胞的DNA断裂增加,细胞凋亡增加,说明电离 辐射造成免疫系统的淋巴细胞严重损伤.照射前膳 食中补充SI可以使上述损伤一定程度上得到减轻, 对小鼠的免疫系统具有一定的防护作用,这与我们 以往实验观察的电离辐射对小鼠免疫系统的其他指 标的影响规律是相同的卜?J. 参考文献 [1]刘丽,金宏.大豆异黄酮抗氧化作用的研究进展[J]. 中华放射医学与防护杂志,2003,13(2):132,134 [2]闫祥华,顾景范,孙存普.大豆异黄酮抗癌作用机制研 究进展[J].生理科学进展,1998,28(4):362—363 [3]金宏,刘丽,王先远等.大豆异黄酮抗电离辐射作用 的观察[J].氨基酸和生物资源,2004,26(3):23,26. 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Cone1usi0nisthats0v1)eanisoflav0neshasradioprotectiveeffectonthelymphocyteinthethymusandthe spleenandperipheralbloodinradiatedmice. Keywords:Thesoybeanisoflavones;radiation;lymphocyte ?????????????????????????????????? ???????????? (上接第45页) Abstract:TI1eEffe(.tsofpHandglucosefed— batchfermentationofSaccharomycescerevisiaeonproductionof glutathionewasinvesligatedin5Lfermentor.Aimedtosearchthebestfermentativeconditions.severaldifferent c()ncentralionsofg1Llcosefe(t— batchandpHvaluesweretestedontheabilityofproductionofglutathione.Theex Derimenta1resuItsshowedthatwhenthepHvaluewas5.0,andflowrateofglucoseat5g.L_'?h_.for30h,the yieldcouldbe6timesoftheconlro1. Keywords:Sacch,nromycescerevMaP;glutathione;fed—batchfermentation;glucosefed —batch;pH