(细胞生物学专业论文)结肠腺瘤息肉病蛋白APC通过非完整Armadillo

(细胞生物学专业)结肠腺瘤息肉病蛋白APC通过非完整Armadillo 摘要 结肠腺瘤息肉病是一种常染色体显性遗传性疾病。致病基因,,,位于,？,,染色体，整个;,,,编码区长度未,,,,,,，共有,,个外显子，其中第,,号外显子非常大，为,,,,,,。,,,基因突变频率较高，大约,,,的结肠腺瘤息肉病患者可检测到,,,基因的突变。突变的发生不是随机分布而是存在突变热点，生殖细胞突变与体细胞突变分布方式存在一定的差别。点突变大多数为;—,的转变，缺失多发生在有重复的核苷酸序列位置，以,个碱基的缺失最为多见，约占,,,。 ,,,蛋白有,,,,个氨基酸，分子量约为,,,(, ,,。,,,蛋白含有多个功能域，参与多种细胞生命活动。总体可分成三个部分:氨基端部分包含两个功能域，寡聚功能结构区和,,,,,,,,,区;中央部分包含,,个氨基酸重复区、,,个氨基酸重复区和,,,,结合区;羧基端部分含有,,，蛋白结合区域和,,,,结合位点。各个结构域赋予,,,蛋白不同的生物学功能。 ,,,作为一种肿瘤抑制蛋白参与,,,信号途径，主要是负调控,—;,,,,,,胞内水平。,,,蛋白与,,,,、,,,一,和,—;,,,,,,等组成蛋白降解复合物，使,,;,,,,,,泛素化并最终降解。,,,蛋白可以抑制,,,信号途径的非正常激活，从而防止结肠癌、黑色素瘤等肿瘤的发生。 ,,,蛋白的亚细胞定位还存在争论，导致争论的一个关键因素是抗体。,,,蛋白商业化抗体较多，已经证实部分抗体存在明显的非特异性反应。利用特异性被证实的抗体发现大部分,,,蛋白存在胞浆中。同时利用绿色荧光蛋白标记的方法活体观察,,,在爪蟾,,皮细胞中的运输过程，实验非常清楚地观察到,,,蛋白沿微管正向运输到细胞生长区域并定位在质膜皮层下。 ,,,蛋白与细胞骨架的关系比较复杂，研究报道非常多，有的甚至出现截然相反的结论。在,,,蛋白定位过程中，到底是微管起主要作用还是,;,,,骨架网作用更大,这些问题目前也存在争论。通过免疫荧光实验在激光共聚焦显微镜下观察到部分,,,蛋白分布微管的末端，用药物处理微管后，,,;蛋白不能正常的定位到质膜皮层下，因此微管对,,,蛋白的定位中起主要作用。 利用酵母双杂交技术，以,,,蛋白,,,—,,,,位氨基酸为诱饵，我们从人胎脑;,,,文库中成功筛选到人,,,,蛋白。,,,,是小鼠,,,,在人类中的同源物，共,,,个氨基酸残基，分子量约为,,,,，含有,个,,,,,,,,,重复结构。我们制备了,,,,蛋 白特异性的兔多克隆抗体，首先分析了,,,,蛋白在细胞和组织中的表达情况，证实它是一种广泛表达的蛋白。接着我们又证实,,,,蛋白可以进入细胞核。这些情况都与己报到的,,,,定位情况类似。同时我们在小鼠组织匀浆液中利用免疫沉淀技术证实,,,蛋白可以和,,,,蛋白共沉淀。反之，利用商业化的,,,抗体也了二者可以共沉淀。接下来我们利用免疫激光共聚焦显微镜在未转染,,,,细胞这一自然状态下分析了,,,蛋白和,,,,蛋白的亚细胞定位，以及二者与细胞骨架蛋白,;,,,和,,,,,,,共定位情况，证实了,,,部分蛋白可以定位在微管的生长末端区域而,,,,蛋白则广泛分布:虽然它们表达模式存在一定差异，但是在细胞生长区突起的地方可以很好的共定位。这也为解释,,,蛋白沿微管正向运输并定位膜下皮质区并参与细胞粘附和细胞迁移提供了依据。 我们注意至，,,,,蛋白,,,,,,,,,重复区域共报道了,个互作蛋白，它们分别是,,,,,,,,,、,,,,，,,,,，，,,,,，。我们用的诱饵是,,,蛋白的,,,—,,,,,,,塞,个片段，而后三者用的都 是,,,,,,,,,,片段。两个片段含有,,,—,,,,,的重叠区域，因此我们将这一重叠区域构建到原核表达载体,,,,,,。通过免疫沉淀实验证实了,,,—,,,,,这个片段的长度足够结合其互作蛋白,,,,。从而证明,,,蛋白与,,,,或,,,,的互作并不需要完整的,,,,,,,,,重复结构域。关键词 微管，,,,,，,;, ,,，,,,,,,，激光共聚焦显微镜 ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,似,;),,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,;,,,, ;,,;,, ,, ,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,; 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,;,, 乙二胺四乙酸 ,,,, 垦，,,,,;,, ,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, 增强型绿色荧光蛋白 ,,, ,,,,, ,,,,,, ,;,,, 胎牛血清 ,,,; ,一芴氧羰基 ,,,, ,一(,一偶氮苯并三氮唑)一,，,，,?，,?一四甲基脲六氟磷酸酯 ，,, ,,,,,;,,,,,,, 碘乙酰胺 ,, ,,,,,,,,,,,,,, , 免疫球蛋白 有关诚信问题的本人声明 本人保证，所呈交的研究论文是本人在导师指导下参加中国医学遗传学国家重点实验室所承担的科研课题的部分研究工作取得的实验数据，没有任何的抄袭、剽窃等行为。 研究生签名:,,玄乒 日期:,兮年,胡,,日 有关知识产权问题的本人声明 遵照科技部关于国家重点实验室应加强知识产权保护的文件(国科发基字〔,,,,〕,,号)精神，本人声明所呈交的研究论文的知识产权归中国医学遗传学国家重点实验室所有，同时，本人保证遵守: ?本人与实验室于——年一月一日签定的有关个人及单位署名的; ?本人与于——年一月一日签定的有关的保密协定。 若有违约行为，承担相应的法律责任。 研究生签名:毛，乞扛 日期:,厂年，明乙，日撵士学位论文 刖罱一,,;研究遗震 缝肠腺瘸息海病(,,,)悬一种常染色体程救遗传性痰病，,,,患者通常,,岁时息晦逐渐形成(,,岁翁和,,岁焉出现症状者少见)。息肉最歼始为滴璩状隆起，随篇逐渐增大，数目也随之增多，布满肠壁。突燮梭测发现家族性缩肠腺癌息离瘸(,,,)患者中存在庙叼基困的突变，丽散发的?结弱肿瘤颊咧校福埃ホ跫焖荩础僖苹 蛲槐洹 ,保 岜蛘粢颍保 ?“，,基因的定位和克隆 ,,,,年，,,,,,,,等。?莆先在,捌,,,,,,,综会援患者的淋巴纲耱中发现,号染色体存在部分缺失。随嚣,,,,,,等”?与,,,,,,,等“?遥过研究发现,,,的表现型与一种定位每,？,,—,, ,的,,,标记,,,,,,之闻存在涟锻关系。,,,,年,,,,,,,,等“?进一步确定了,怒基嚣定位在,？,,—,,送闻，并且谣实,,,和,,是来自问一基雕不同位点豹突变。 ,,,,年，,,,,,,等“?从含有,？,,染氛体部分缺失的细胞株分离?，舞个克隧，在该缺失区确认了,个新豹候选基因(,,，，,,,,,，,,,(,)，并铡得全部;,,,序列。在此基础上,,,,,,“?遵过突变检测发现,,，及,,,,,来见碱基突变，掰,,,。, 刘在第,、,、,,、,,、,,号外显子上检测到突变，这表明,,,(,就是,,,相关基 因也就是膝瘤样结肠息离易感基因。,,,,,及,,,,,,,,,豢舞鉴定并确定了“彤? 基因豹全长,,,,…。 ,(,直昭基因韵臻梅 ,,,基因位于,？,,染色体，整个;,,,编码区长度未,,,,,,，共有,,个外显 子(最常见形式)，其中第,,号外显子菲常大为,,,,,,，占该基因编码区的,,, 以上。?。第,号外量子存在两种剪切形式，一种是整个外显予(,,,—,,,,):舅一 种是,,(,,,,—,,,,)，它比薪一种形式熬译台成的多驮链少了,,,个氨基酸。 ,(, ,阿基因突变的特点 ，,,,基因突变频率较高，大约,,,的,,;患者可检测到,彤基因的突变。,，, 基圜突变存在一下特点”?: ,(突变的发生不是随机分布的，存在突变热点。生殖细胞突变散布予基因的 , ,端，,,,的突变集中在第,,号，,显予,?端，阻,,,,和,,,,为糖对 热 患，突变率分别为,,(,,和,,(,,。丽体细靡突变则相对集中予,,,,,博士学位论文 ,,,,之间的,,,左右的编码区，约,,,,,,,的体细胞突变发生于此， 因此被称为“突变密集区”(,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,，,,,)。其中又以 ,,,,和,,,,为相对热点。这也为高危人群的筛查和早期诊断提供了参 考。 ,(,,,的突变导致,,,基因蛋白产物的交化，一般产生截短的蛋白。 ,(,,,基因突变主要为点突变和移码突变。前者包括:无义灾变和错义突 变:后者包括:缺失和插入。点突变大多数为,—,的转变，且大部分集 中在,,,和,,,位点上(见表,)。缺失多发生在有重复的核苷酸序列位 置，以,个碱基的缺失最为多见，约占,,,(见表,) ,(,,,基因突变符合二次打击理论(,,,,,,, ,,,,,)“”。,,,:基因单个拷贝 的突变导致结肠息肉病，如果,个拷贝都突变失活则导致结肠直肠癌。,,, 基因突变还与散发性的直肠癌、食管癌、胃癌、小细胞肺癌等肿瘤相关。 表, ,,,基因单碱基突变发生的特点„”。“” 表, ,彤基因突变碱基改变的数目,，,,,““” ,(, 基因型与表现型的关系 在家族性结肠息肉病(,,,)的研究中已经证实,,,基因突变的位置与特定的 表型有关“?，,,,基因突变位点与息肉的数量存在关联。突变位于,,,,和,,,,位 氨基残基之间，患者表现为重型或多发性结肠息肉病，息肉一般多达,,,,多个， ,博士学位论文尤其是在,,,,及其附近位点，患者症状更为严重而且发病时间提前;而如果突变点位于蛋白氨基端则多形成,,,,,,,,,,个息肉;如果突变点位于蛋白羧基端，结肠息肉较少并导致衰退型腺瘤息肉病结肠(,,,,)。 如果突变点在,,,到,,,,位氨基残基之间患者还常伴发先天性视网膜色素上皮增生(,,,,,，由于,,,,,便于检测，,,,,,可作为,,,的早期诊断标志)。突变点位于,,,,到,,,,和,,,,到,,,,区间的,,,患者还可伴发结肠外其它类型的肿瘤如硬纤维瘤、骨瘤、表皮样囊肿。,,,基因型与表现型之间的这种关系方便今后的,,,遗传学早期遗传学诊断，可以不用对整个,,,基因进行扫描筛查，只需对这些突变高发区进行突变检测。, ,,,蛋白,(, ,,,蛋白结构特点 ,,,蛋白有,,,,个氨基酸，分子量约为,,,(, ,,“?…。,,,蛋白含有多个功能域，参与多种细胞生命活动，行使多种生物学功能。,,,基因编码的蛋白质可分成三个部分(见图,)，氨基端部分包含两个功能域:寡聚功能结构区和,,,,,,,,, 区;中央部分包含,,个氨基酸重复区、,,个氨基酸重复区和,,,,结合区;羧基端部分含有,,,蛋白结合区域和,,,,结合位点。氨基端区(,,,,,,,,): ,)寡聚结构域(,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,)(,,,,,,) ,,,蛋白氨基端,—,,位氨基酸的,个氨基酸重复使,,,蛋白可以形成二 聚体“”。野生型的,,,蛋白可以和野生型的蛋白形成同二聚体，也可和因突 变截短的蛋白形成异二聚体，此异二聚体可能发挥显性负效应作用，从而影响 野生型具有正常功能的,,,蛋白“””。 ,),,,,,,,，,区(,,,—,,,,,) ,,,,,,,,,区含有,个,,,重复。此区域非常保守，在突变的蛋白中常常 被保留下来，提示该区域对维持,,;和细胞的基本功能非常重要。已报到有 ,,,,(,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,)„,”、,,,,(,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,,;,,,,, ,,;,,,)„,”、,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,) “,?与,,,蛋白在此区域互作。我们利用酵母双杂交技术，以,,,蛋白,,,一 ,,,,,,为诱饵成功筛选到,,,互作蛋白,,,,(,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,,)， 其结合位点也定位在这一区域。 中央区(,,,,,,,,,,,):主要参与,,,,信号途径，与信号传导相关。博士学位论文,),,个氨基酸重复区(,,,,,,,,, ,;,, ,,,,,,,)(,,,,一, ,,,,,) ,,个氨基酸重复区定位在,,,,一, ,,,位氨基酸之间，为,—;,,,,,,提供 结合位点“。。,),,个氨基酸重复区(,,,,,,,,, ,;,, ,,,,,,,)(,,,,,,,,,,) ,,个氨基酸(,,,,)重复序列(在,,,,,,,,,,,,之间重复七次)，每个,,,, 序列都含有,,,,,的保守序列并可作为糖原合成酶激酶,(,,,一, ,)的磷酸 化位点“”，主要参与,—;,,,,,,的降解。,),,,,结合区(,,,, ,,,,,,, ,,,,,) 散布在,,各氨基酸重复和,,个氨基酸重复序 (,,,—,,,,,,,—,,,)构成的重复序列之间的是由,,,,,残基 列区，它是,,,与,,,,,;,,,;,,,的结合位 点“”。此位点共有,个，分别位于,,个氨基酸重复序列的第,到第,个重复 之间，第,到第,个重复之问以及第,个重复之后。羧基端区(,,,,,,,,,,,,),),,,,,区(,,,,; ,,,,,,)(,,,,—,,,,,,) ,,,,;区定位在第,,,,到,,,,位氨基酸之间,?，是一个主要包括精氨酸、 赖氨酸以及脯氨酸残基在内大约,,,个氨基酸的碱性区。此区域与,,,蛋白 结合微管位点氨基酸组成类似。实验证实,,,蛋白包含,,,,—,,,,氨基残基 的片段可以体外结合未组装的微管蛋白并促使其组装，因此,,,,;区可能参与 与微管的结合。“,?。 ,),,，结合区(,,, ,,,,,,, ,,,,,,)(,,,,—,,,,,,) ,,,是最初从酵母体内发现的一种微管结合蛋白。,,,羧基端存在,,,结 合位点。,,,蛋白可能引导,,,蛋白定位到微管生长末端，并促进,,,蛋白与 细胞膜的互作。最近,,,,, ,等证实,,,蛋白通过与,,,的结合调控减数分裂 过程中染色体的配对和排列以及纺锤体的形成”,?…。 ,),,,结合区(,,,,—,,,,,,) 与,,,(,,,,蛋白结构中蛋白质互作的结构域)结合的位点位于末端,, 个氨基酸区域。有研究证实切除掉羧基端,,个氨基酸的截短蛋白丧失结合 ,,,,蛋白的能力„,。。羧基端,,,,,氨基残基位点被认为,,,结合域。过度表 达,,;蛋白将抑制细胞周期的进程，使细胞不能从,。,,;过度到,期。。。有研 究表明,,,与,,,,复合物参与此调控细胞周期过程„,。”?。 ,博士学位论文 前言 图, ,,,蛋白结构功能域及相互作用蛋白，参考“,,(, ,,,蛋白亚细胞定位 ,,,蛋白亚细胞定位研究的文章很多。?。由于免疫染色使用的抗体来源于不同公司，得出来的结论也不尽相同。但大部分实验都证实:细胞中,,,蛋白弥散分布在胞浆中，在成纤维细胞等多种细胞的细胞核中检测到,,,蛋白的存在。,,,,细胞,,,蛋白免疫染色实验都能观察到在细胞突起末端存在„个非常明显的,,,蛋白聚集区。目前普遍认为培养的细胞中,,,蛋白主要有,个分布区:胞浆、核内、微管依赖的细胞突起末端以及肌动蛋白依赖的与膜相连区域。免疫组化研究发现同?，组织不同部位的细胞，,,,定位并不相同。小肠隐窝底部的上皮细胞常是,,,阴性的， 然而从隐窝到肠腔上,,,的区段，,,,表达逐渐增加，到肠腔表面时所有的细胞到表达,,,蛋白”“?。, ,,,蛋白功能,(, ,,,与,,,,信号途径:,,,是一种抑癌基因一负调控,,;,,,,,, ,,,是一种分泌型的糖蛋白，无论在脊椎动物还是无脊椎动物中它都可作为配 体激活受体介导的信号传导途径犯,?。,,,信号途径的激活可以调节细胞增殖、细胞 行为和细胞分化。经典,,,信号途径是目前研究的比较清楚的一个信号途径(见 图,)。尽管可能存在组织或种的特异性，它的核心成员在进化过程中都非常保守。 没有,,,信号时，胞浆中由,,,,、,,,、,,,一,和,,,;,,,,,,等蛋白组成降解蛋白 复合物，,,,一,使,,,,、,,,和,—;,,,,,,磷酸化，并进一步促进,一;,,,,,,与, —,,,,(,,一,,,,,,,;,,—,,,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,,)结合，导致,—;,,,,,,泛 素化并被蛋白酶降解。同时，,,,和,,,,存在核内并具有核输出活性，它们可以 将核内的,—;,,,,,,运送回胞浆中，因此,,,和,,,,对维 ;,,,,,,具有重要意义。 在低密度脂蛋白相关受体(,持核内低水平的, — ,,,或,,,,)协助下，,,,信号通过细胞膜上博士学位论文,, , ,,,,螺旋受体和低密度脂蛋白相关受体(,,,,或,,,,)结台，激活胞浆中磷脂蛋白,, ,,,,,,,,,，,,,与,,,,,,,互作可跌被像磷膳酰肌醉聚糖相关蛋白,,, ,,等糖蛋鑫增强，也可以被一些分泌蛋白所抑制，比如,,;,,,,,和,,,,(分泌型,,,,,,,相关蛋白)家族成员。,,,,,,,激活届，,,,,,,,,,,,能够直接与,,,,,,,结合并通过降解复合物降低,,,,蛋白活性，从而减少目一,,,,”,,的磷酸化和降解速率，使得,—;,,,,,,可以在核内聚集，并和特异的转最网予结合，扁动下游基因的表达。 细胞核内，如果没有,,,信号，淋巴刺激园子,,,和,细胞因子,,,同源物(统称,,,,,,,)在目的基因的启动予区和增强子区与,,,结合，和,,,,,,,与,,,, 一起抑制基因的表达。‰,信号提高了核内,—;,,,,,,水甲，目,,,,,,,,竞争结 合,,,,,,,，邋过与,,,(缀蛋自乙酰转移酶)等诈用疆子菸间激活下游备静靶基 闲的表达。由于,,,;,,,,,,水平翔高和其信号途径遣度刺激导致细胞恶性佐，因 此,,;,,,,,,是一种致癌基因街,,,作为押癌基嬲可以抑制,—;,,,,,,活性。,,, 途径非正常的激活可以导致多种癌症，包括结肠癌，黑色素瘤等等。,,,信号途径 也与骨密度综合征，神经退行性疾病相关，并有可能与家族性玻璃体视网膜渗出 瘸变相关。 霉,经典,,,,,,，:,,,,,,信号途径压细胞粘附连接，引自? ,(, ,,,与细胞鞋附(;,,, ,,,,,,,,) 粘附连接呈带状，环绕整个细胞，一般位于上皮细胞顶侧面紧密连接的下.