医学论文-人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干-祖细胞扩增与分化的作用

医学论文-人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干-祖细胞扩增与分化的作用 医学论文-人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造 血干/祖细胞扩增与分化的作用 作者:王建伟,王亚平,王莎莉,姜蓉 【摘要】 为探讨人参总皂甙:total saponins of panax ginseng, TSPG:协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞:HSC/HPC:扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+ HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数:CFC:、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示: 10-70 μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数, 50 μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5?79.96)×103、(53.96?4.29)×100%和(21.86?3.09)×100%; 20 μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2?9.03)×103、(26.78?1.91)×100%和(16.98?1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG:10-50 μg/ml:均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20 μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。 【关键词】 人参总皂甙;CD34+造血干/祖细胞;细胞扩增; 细胞分化 Synergistic Effects of Total Saponins of Panax Ginseng in Combination with Hematopoietic Growth Factor on Proliferation and Differentiation of CD34+ Cells Ex Vivo AbstractTo investigate the effects of total saponins of panax ginseng (TSPG) in combination with hematopoietic growth factors (HGF) on proliferation and differentiation of CD34+ cells ex vivo, the purified CD34+ cells from cord blood and bone marrow were expanded by various concentrations of TSPG with combination of cytokines in liquid culture systems and the expanded cell number, CD34+ cell number, CD33+ cell ratio, the numbers of total CFC and hematopoietic progenitor cell number were detected. The results showed that TSPG (10-70 μg/ml) could raise the expanded cell number, CD34+ cell number, and the numbers of total CFC, TSPG 50 μg/ml was identified as the most potent stimulating concentration, and increased total nucleated cells to (2470.5?79.96) ×103 、 CFC to (53.96?4.286)×100% and CD34+ cells to (21.86?3.094)× 100%; TSPG (10-50 μg/ml) could raise the colony formation rate of CFU-GM, TSPG(20μg/ml) induced the best effect on granulocytopoietic differentiation committed of CD34+ cells. It is concluded that the optimal concentration of TSPG can promote CD34+ cells to proliferate and differentiate by cooperating with hematopoietic growth factors. Key wordsTotal Saponins of Panax Ginseng; CD34+ Cells; Proliferation and differentiation 造血干/祖细胞的体外扩增和定向诱导分化是造血干细胞工程研究的关键课题,其研究现状展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用潜力,同时也为中医药现代化研究带来了新的切入点。人参是祖国传统医学的"补气"要药,人参皂甙是人参中主要的有效药物成分。我们前期工作研究明:人参总皂甙:TSPG:是人参促进血细胞生成的有效成分。TSPG在体内外均能刺激造血干细胞:CFU-S:和造血祖细胞:CFU-GEMM、CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK:的增殖分化,1-3,。本研究 将进一步采用造血细胞工程技术,以分离纯化的CD34+HSC/HPC为靶细胞,探讨TSPG对CD34+HSC/HPC扩增及诱导分化为粒系血细胞的作用,旨在阐述人参"补气生血"的现代生物学机理,为临床治疗血液学疾病提供指导。 材料和方法 主要试剂 RPMI 1640与IMDM培养基购自美国Gibco公司,淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂,马血清:HS:由军事医学科学院提供,胎牛血清:FBS:购自Sigma公司。FL、TPO、SCF和G-CSF购自美国Santa Cruz 公司,IL-3、GM-CSF和EPO由军事医学科学院提供。小鼠抗人FITC标记的CD33抗体购自Santa Cruz 公司,小鼠抗人FITC标记的CD34抗体购自美国Bection Dickinson公司。StemsepTM分选系统购自加拿大StemCell Technologies公司,流式细胞仪FACS Vantage 购自美国Bection Dickinson公司。 药物 人参总皂甙:total saponins of panax ginseng, TSPG:由重庆中药研究所惠赠,纯度95%以上,用IMDM配成1 mg/ml的工作液,正压过滤除菌。 细胞来源 正常骨髓细胞取胸外科无血液疾病患者切除的肋骨骨髓,淋巴细胞分离液 ,相对密度1077:分离单个核细胞:MNC:,用RPMI 1640培养液:Ficoll 洗涤,用4号针头制备单细胞悬液,并计数MNC。 脐血细胞取自足月妊娠正常分娩脐带血:重庆医科大学第一附属医院提供:,采集按Broxmeyer报道方法进行,细胞在12小时内经Ficoll:相对密度1077:梯度离心,制成MNC悬液。 CD34+HSC/HPC的分离纯化 将:4-8:×107骨髓、脐血MNC悬浮于含2%胎牛血清的PBS缓冲液中,加入antibody cocktail 100 μl,0? 30分钟,再加入磁性胶体60 μl,0? 30分钟。采用CD34 StemsepTM分选系统,操作按说明书进行。将标记后的骨髓、脐血MNC加入磁场中的分离柱内,加缓冲液冲洗,从流出道收集未标记的细胞群。离心洗涤后,流式细胞仪FACS Vantage (Becton Dickinson Immunocytometry System, USA)检测分离CD34+细胞纯度;采0.1 ml收集细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞活力。 TSPG对CD34+细胞扩增影响液体培养检测 以含有12.5% HS、12.5% FBS、5×103/ml脐血CD34+细胞的IMDM为基础体系。对照组:在以上体系内加入FL/TPO/SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF/EPO:FL、TPO、SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF和EPO的终浓度分别为40、10、100、2、50和20 ng/ml及2 U/ml:重组细胞因子组合。 TSPG组:以对照组培养体系为基础条件,加入不同剂量的TSPG,终浓度分别为10、20、50、70和100 μg/ml。细胞因子每48小时加入体系1次,均连续加入5次;TSPG每周加入1次。上述体系接种于24孔板中,每孔1 ml,复种3孔,37?、5% CO2及饱和湿度下培养18天,每周半量换液,取出细胞用于细胞总数、CD34+细胞比例及造血祖细胞检测。 TSPG对CD34+细胞分化影响的液体培养检测 骨髓CD34+细胞培养:细胞数、TSPG浓度以及培养条件均同脐血细胞培养:体系中加入重组细胞因子组合SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF,培养时间为2周。每周半量换液,取出细胞用于细胞总数、CD33+细胞比例及CFU-GM祖细胞检测。 CD34+、CD33+细胞的检测 将扩增的细胞经PBS洗涤后,用直接荧光法标记行流式细胞仪检测,每个样品分析细胞数?1×104,用PC-Lysys II软件在VAX3300微机:Digital, USA:上进行分析。 造血祖细胞培养 体系中含30% HS、10% BSA、SCF、IL-3、GM-CSF、EPO及在此基础上分别加入5×103/ml CD34+细胞、 5×104/ml扩增细胞,IMDM及0.9%甲基纤维素。所有 培养均在96孔板(每孔0.2 ml,复种3-5孔)进行,37?、 5% CO2及饱和湿度下培养6天后计数CFU-E,14天计数CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E,其总数即集落形成细胞总数:CFC:。 TSPG对CD34+细胞形成CFU-GM能力影响的甲基纤维素半固体培养检测 、10% BSA、SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF及5×103/ml CD34+ 体系中含30% HS 细胞,IMDM及0.9%甲基纤维素。药物组为在CD34+ 细胞培养体系中加入不同剂量的TSPG(剂量同前),以不加TSPG为对照组。所有培养均在96孔板(每孔0.2 ml,复种3-5孔)进行,37?,5% CO2及饱和湿度下培养14天后计数CFU-GM。 统计学方法 显著性分析用t检验,P，0.05为差异有显著性。 结果 CD34+细胞的分选、纯化与鉴定 骨髓、脐血MNC中仅有少量细胞表达CD34抗原,CD34+HSC/HPC仅占1%-3%,用StemsepTM系统分离纯化可得到高纯度的CD34+细胞,经流式细胞术检测,其纯度为86%-92%。台盼蓝拒染测定,CD34+细胞活性为95%-99%。 体外扩增细胞的形态学观察 CD34+细胞经体外培养18天后,出现不同发育阶段的血细胞,形态各异:图1:。 TSPG协同细胞因子对细胞总数及CFC和CD34+细胞的扩增作用 将CD34+细胞在液体培养中扩增,同时加入不同浓度的TSPG刺激培养18天。结果显示: 以原数为100%,FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/G-CSF/GM-CSF细胞因子组合可使细胞总数、CFC和CD34+细胞分别增至:2346.5?65.03:×103、:42.56?5.61:×100%和:15.59?271:×100%; TSPG 10-70 μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFCs和CD34+细胞数,TSPG 50 μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC和CD34+细胞分别增至:2470.5?79.96:×103、:53.96?4.286:×100%和:21.86?3.094:×100%:表1,图2:。Table 1. Effect of TSPG on expansion of CD34+ cells from human cord blood:略: TSPG诱导CD34+细胞定向分化为粒系血细胞的作用 不同浓度的TSPG协同造血生长因子诱导CD34+细胞分化2周,结果显示: TSPG 10-70 μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM数及CD33+细胞比例,TSPG 20 μg/ml是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,但TSPG 100 μg/ml则对细胞总数的增加有所抑制,与对照组相比有显著性:表2:。Table 2. Effect of TSPG on granucytopoietic differentiation of purified CD34+ cells derived from human bone marrow cells:略: TSPG对CD34+细胞形成CFU-GM能力的影响 以甲基纤维素半固体培养法检测不同剂量TSPG诱导CD34+HSC/HPC向CFU-GM增殖能力,结果显示: TSPG:10-50 μg/ml:能提高CD34+细胞形成CFU-GM 的集落产率,以TSPG 20 μg/ml效果最为明显:P，0.01::表3:。Table 3. Effect of TSPG on the CFU-GM colony formation of CD34+ cells:略: 讨论 从应用的角度出发,在较为圆满地解决了CD34+细胞的体内动员和体外富集后,目前所面临的最大挑战是如何有效地在体外扩增所富集的少量CD34+细胞,使其在既定的时限内既能增加其数量又能保证其质量,真正达到临床应用的要求,这是当今生命科学极为关注的焦点。人们在努力探索各种以寻找解决这一问题的途径。人参是祖国传统医学的"补气"要药,人参皂甙是人参中主要的有效药物成分。我们前期工作研究表明:TSPG在体内外均能刺激造血干细胞:CFU-S:和造血祖细胞:CFU-GEMM、CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK:增殖分化。由此,我们构想将中药TSPG应用到造血干/祖细胞体外扩增工程中,观察TSPG对CD34+造血干/祖细胞体外扩增和分化的作用,期望通过中医中药的应用途径来寻找克服这一难题的新视角。造血生长因子支持的体外扩增是目前造血干/祖细胞体外扩增应用最为广泛的方法。TPO是促进巨核细胞发育和血小板生成的细胞因子,但大量的研究表明TPO具有协同多系造血的活性,4,。FL可诱导处于静止期的造血干/祖细胞进入增殖期,使它们对早期造血细胞因子,如SCF、IL-3、IL-6产生增殖反应 ,5,6,。更有意义的是:在传统的细胞因子组合 SCF/IL-3/IL-6/G-CSF/EPO扩增体系中同时加入FL和TPO两种细胞因子后,对早期造血祖细胞则表现出明显的协同扩增作用。 FL/TPO/SCF/IL-3/IL-6/G-CSF组合扩增14天后,细胞总数、CFU-GM、CFU-MK分别增加2130?57、70?7和118?11倍,且CD34+CD38-细胞扩增46?5倍,7,。 邱录贵和Roger,8,将10份脐血中富集的CD34+细胞接种于含20% FBS的IMDM中,分别加入由SCF、FL与IL-1β、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO:合称136GE:组成的3组细胞因子:A:FL+136GE;B:SCF+136GE;C:FL+SCF+136GE:培养扩增7天,C组各项指标均显著优于前两组。这一结果提示: FL和SCF具有明显的协同效应;30%的脐血标本在FL/SCF/136GE刺激下经7天扩增可获得，50×106的CD34+细胞,足够用于体重，50 kg的成人移植造血干细胞;扩增后的CD34+细胞与扩增前的CD34+细胞相比,基本保留了较高的集落形成能力和体外扩增潜能。 在我们的实验中,采用的细胞因子组合包括了早期造血生长因子:SCF、IL-3、GM-CSF:,造血活存因子:G-CSF:、系特异性生长因子:G-CSF、EPO :以及FL和TPO,应用FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/G-CSF/GM-CSF与CD34+细胞共培养18天,可使细胞总数和CFC分别增至:2346.5?65.03:×103和:42.56?5.605:×100%,CD34+细胞数也扩增:15.59?2.712:×100%。以不同剂量的TSPG加入到含有FL/TPO/SCF/IL-3/EPO/G-CSF/GM-CSF细胞因子组合的基础培养体系中,刺激CD34+细胞18天,结果显示TSPG 10-70 μg/ml不仅可以提高细胞总数,而且也同样能提高CFC和CD34+细胞数,表明TSPG能够协同细胞因子促进CD34+造血干/祖细胞的增殖,而且也能促进早期造血祖细胞的扩增。对于TSPG能否促进CFU-GM的增殖,文献报道结论各异。黄干等,1,认为,TSPG对小鼠CFU-GM的集落产率无明显影响;但王勇等,9,同样以小鼠为实验对象,实验结果却表明TSPG对CFU-GM的刺激作用与剂量有关,TSPG在3 μg/ml浓度时对CFU-GM的增殖的影响不明显,而当浓度增高到20 μg/ml时,CFU-GM的集落产率明显提高;高瑞兰等,10,研究表明,人参皂甙能刺激正常人和再生障碍性贫血患者CFU-GM增殖;我们直接以分离纯化的人骨髓CD34+细胞为靶细胞,探讨TSPG对 CD34+细胞向粒系细胞分化的影响,观察到TSPG 10-70 μg/ml均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33+细胞比例,TSPG 20 μg/ml是液体培养诱导CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度。以甲基纤维素半固体培养法检测不同剂量TSPG诱导CD34+HSC/HPC向CFU-GM增殖与分化能力,结果显示TSPG:10-50 μg/ml:均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG 20 μg/ml效果最为明显。所以,我们认为TSPG能够协同其它细胞因子诱导CD34+HSC/HPC向粒系细胞分化。 【参考文献】 1 黄干,祝彼得,张淑慎. 人参总皂甙对小鼠血细胞生成的影响. 中华血液学杂志, 1990;11:66-68 2 王璐,王亚平. 人参总皂甙诱导人造血基质细胞表达IL-3的实验研究. 解剖学报,2004;35:49-54 3 王莎莉,陈笛,王亚平等. 人参总皂甙对人GM-CSF和GM-CSFR表达的调控. 生理学报,2003;55:487-492 4 裴雪涛,王立生,徐黎等. 血小板生成素对CD34+造血祖细胞的协同扩增作用. 中国实验血液学杂志,1997;5:229-235 5 Bhatia M, Bonnet D, Kapp U, et al. 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