免疫球蛋白m在上皮源性恶性肿瘤及细胞系中的表达

免疫球蛋白m在上皮源性恶性肿瘤及细胞系中的表达 免疫球蛋白M在上皮源性恶性肿瘤及细胞系 中的表达 作者:覃纲, 余玲, 杨金亮, 李祖茂, 杨洪斌, 文艳君, 魏于全,梁传余, 田聆 【摘要】 目的探讨IgM在多种上皮来源恶性肿瘤及肿瘤传代细胞系中的表达情况。方法应用组织芯片技术结合免疫组化SABC法检测IgM在10种上皮源性肿瘤及对应阴性组织中的表达情况，并通过流式细胞仪、间接免疫荧光法检测IgM在8种上皮源性肿瘤及Burkitt's淋巴瘤(Raji)传代细胞系中的表达。结果IgM在10种上皮来源恶性肿瘤组织及部分对应阴性组织中均有表达，其阳性表达率分别为70.0%和20.0%(P<0.05);IgM在8种上皮来源恶性肿瘤传代细胞系及Raji细胞中存在表达，与阴性对照比较差异有统计学意义 (P<0.05)。结论IgM在上皮来源恶性肿瘤及传代细胞系中存在广泛表达，其意义和机制有待进一步研究。 【关键词】 免疫球蛋白M;组织芯片;免疫荧光;上皮性恶性肿瘤;癌细胞系 Expression of Immunoglobulin M (IgM) in Multiple Epitheliogenic Malignant Tumor Tissue and Carcinoma Cell Lines 1 Departmant of Otorhinolaryngology and Head & Neck Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China; Department of Otorhinolaryng ology and Head & Neck Surgery, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College， Department of Ophthalmology; Division of Cancer Biotherapy, State Key Laboratory of Biotheragy, West China Hospital, Sichuan University Abstract:Objective To examine the expression level of immunoglobulin M (IgM) in multiple epitheliogenic malignant tumor tissue and carcinoma cell lines. MethodsTissue microarray and immunohistochemistry were utilized to detect the expression level of IgM in ten epitheliogenic malignant tumor tissue and control negative tissue. Furthermore, flow cytometry and indirected immunofluorescence were utilized to detect the IgM expression level in eight epithelial carcinoma cell lines and the Burkitt's lymphoma cell line (Raji). ResultsIgM was expressed in all ten epitheliogenic malignant tumor tissue. The overall positive expression rate of IgM in tumor tissue (70.0%) was significantly higher than that of control (20.0%) (P<0.05). IgM was also expressed in Raji and eight epithelial 2 carcinoma cell lines. The positive IgM expression rate in each tumor cell line was significantly higher than that of control (P<0.05). ConclusionIgM is highly expressed in multiple epitheliogenic malignant tumor tissue and carcinoma cell lines when compared to negative control. Further study is necessary to fully understand the significance and mechanisms underlying the elevated IgM levels in epitheliogenic malignant tumors. Key words:Immunoglobulin M; Tissue microarray; Immunofluorescence; Epitheliogenic malignant tumor; Carcinoma cell lines 0引言 正常细胞癌变后出现基因表达及调控异常， 可引起许多因子 和激素的异位表达。 近年来， 国内外多个研究小组发现非淋巴细胞 性恶性肿瘤细胞也能产生免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)或免疫球 蛋白样物质(Ig like substance)。 最近， 我们应用血清蛋白组学 技术从鼻咽癌细胞株CNE1中筛选出候选肿瘤抗原膜结合型IgM[1]。 为了明确IgM在鼻咽癌病理过程中的作用， 我们对IgM在鼻咽癌组织 及相应细胞中的表达进行了研究， 并进一步观察了IgM在上皮来源恶 性肿瘤组织及传代细胞系中的表达情况。 本文对后面部分研究内容进 3 行报道。 1材料与方法 1.1组织芯片及细胞系多种器官肿瘤与癌旁正常组织组合芯片购自西安超英生物科技有限公司，编号CC00 11，点样直径1.5mm，点阵总数60。分为两组，即恶性肿瘤组和正常组织组，恶性肿瘤组30例，包括食管鳞癌、胃腺癌、结肠腺癌、直肠腺癌、肝细胞性肝癌、肺鳞癌、肾透明细胞癌、乳腺非浸润性导管癌、宫颈鳞癌、卵巢乳头状腺癌10种上皮来源恶性肿瘤，每种肿瘤均为3例病例，患者年龄29,82岁，平均54.9岁，男16例，女14例;正常组织组30例，为肿瘤来源器官的正常组织，年龄31~73岁，平均52.4岁，男13例，女17例。人结肠癌细胞系SW480，人卵巢癌细胞系SK OV 3，人肝癌细胞系HepG 2，人乳腺癌细胞系MCF 7，人鼻咽癌细胞系CNE 1，人宫颈癌细胞系Hela，人舌癌细胞系Tca8113，人肺癌细胞系A549，人Burkitt's淋巴瘤细胞系Raji均为本实验室保存。 1.2主要试剂及仪器兔抗人IgM多克隆抗体购自美国LABVISION公司，FITC标记猪抗兔IgG购自美国DAKO公司。即用型兔抗人SABC试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RPMI 1640 及DMEM培养基购自美国Gibico BRL公司;流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司 4 产品，型号EPICS ELITE ESP。 1.3实验方法 1.3.1免疫组化采用链霉亲和素生物素法(StreptAvidin Biotin Complex,SABC)，切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温封闭20min，微波抗原热修复，加热至沸腾断电，间隔10min后重复一次，滴加5% BSA室温封闭30min，加入兔抗人IgM(1?400)4?过夜，PBS洗3次后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温20min，PBS洗3次，加入SABC室温20min，PBS洗4次，DAB室温显色，镜下控制反应时间，自来水冲洗终止显色，充分水洗后，苏木素轻度复染，常规脱水、透明，中性树胶封片观察。以扁桃体切片作为阳性对照，见图1，PBS代替一抗作为阴性对照。 1.3.2免疫组化结果判断由两位病理医生通过OLYMPUS BX60显微镜放大400倍，并应用Nikon ECLIPSE E600图像采集系统及SPOT软件，在显示器上观察每个组织点阵，细胞浆和(或)细胞膜见到棕黄色染色的细胞计为阳性细胞，计算肿瘤或阴性组织中阳性细胞数占所有肿瘤或阴性组织细胞数的百分率，参考邱晓彦[2]的，以百分率?10%计为染色结果阳性，无染色或染色细胞比例,10%计为阴性。 1.3.3细胞培养SW480、A549、MCF 7、Hela、CNE 1、 5 Tca8113、Raji细胞用含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI 1640培养基，于37?，5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中常规培养;HepG 2、SK OV 3细胞用含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，于37?，5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。选用对数生长期细胞进行实验。 1.3.4流式细胞仪间接法免疫荧光检测IgM表达收集细胞， 调整细胞浓度为1×106， 4%多聚甲醛固定， 4?过夜， PBS洗2次后， 加入0.1%皂素200μl细胞膜打孔， 室温10min， PBS洗涤2次， 1%胎牛血清室温封闭20min后， 加入兔抗人IgM抗体(1?400)室温60min， PBS洗涤2次， 加入FITC标记猪抗兔二抗(1?40)， 室温避光20min， PBS洗涤2次后， 重悬细胞于500μl PBS中， 上机检测。 阴性对照组加等量的PBS代替一抗, 其余操作同前。 Raji细胞为B细胞来源的淋巴瘤细胞， 本试验将其作为阳性对照。 以荧光阳性率比较表达水平的差别。 1.4统计学处理IgM染色阳性率及免疫荧光阳性率比较采用四格表χ2检验，并在SPSS11.0 统计软件中进行统计学处理，检验水准α=0.05。 2结果 6 2.1上皮来源恶性肿瘤组织表达IgM 本组30例上皮来源恶性肿瘤中，21例IgM染色阳性，阳性部位主要在胞浆，仅有1例肺高分化鳞癌及1例肾透明细胞癌胞膜阳性。其中，食管癌3例均为阳性(3/3,100%)，见图2。胃癌1例为未分化腺癌阳性(1/3,33.3%)，结肠癌2例为高分化腺癌阳性(2/3,66.7%)，见图3。直肠癌1例中为分化腺癌阳性(1/3,33.3%)，肝癌1例高分化及1例中分化肝细胞性肝癌阳性(2/3,66.7%)，见图4。肺癌高、中、低分化鳞癌各1例均为阳性(3/3,100%)，见图5。肾透明细胞癌1例阳性(1/3,33.3%)，乳腺3例非特殊性浸润性导管癌均为阳性(3/3,100%)，见图6。宫颈3例低分化鳞癌均为阳性(3/3,100%)，卵巢癌2例低分化浆液性乳头状腺癌阳性(2/3,66.7%)，总阳性率70.0%。IgM表达与肿瘤分级无关(P>0.05)。对应30例正常组织中，6例IgM染色阳性，阳性部位除2例食管粘膜鳞状上皮为膜阳性外，其余4例均为浆阳性。其中，食管粘膜2例阳性(2/3,66.7%)，胃粘膜组织1例胃底腺上皮阳性(1/3,33.3%)，结肠粘膜组织1例腺上皮阳性(1/3,33.3%)，直肠粘膜组织1例腺上皮阳性(1/3,33.3%)，肝脏组织1例阳性(1/3,33.3%)，肺组织3例阴性，肾脏组织3例阴性，乳腺组织6例阴性，卵巢组织3例阴性，总阳性率20.0%。与恶性肿瘤组比较阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。 2.2上皮来源恶性肿瘤细胞系表达IgM应用流式细胞仪间接法免疫荧光检测多种上皮来源恶性肿瘤传代细胞系中IgM的表达，结果如下:SW480细胞荧光阳性率为9.0%，SK OV 3为8.4%，HepG 2为17.8%，MCF 7为13.1%，CNE 1为17.2%，HeLa 7 为25.2%，Tca8113为17.6%，A549为21.0%，Raji为49.4%，分别与阴性对照1.9%比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明IgM在上述细胞系中均有表达。 3讨论 传统免疫学理论认为，免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排，转录翻译成有功能的免疫球蛋白，机体的其它细胞一般不表达免疫球蛋白，即Ig是B淋巴细胞的特有产物。但近年来的研究表明上皮细胞及上皮来源恶性肿瘤有Ig或Ig样物质的表达。Kimoto等[3]报道在4种上皮来源肿瘤细胞系SW116(人结肠癌)、Hep 2 (人喉鳞癌)、MCF 7及MDA MB 231(人乳腺癌)中检测到5种免疫球蛋白IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgE和IgA基因重链恒定区部分外显子转录的基因片断，并推测可能有相应蛋白质的表达;国内邱晓彦等[2]分别从蛋白质和mRNA水平证实多种上皮来源肿瘤组织、传代细胞系及部分上皮细胞存在IgG的表达;黎明等[4]采用免疫组化、Western blot及ELISA等方法在7种上皮来源肿瘤细胞系蛋白提取液和培养上清中检测到IgA的表达;类似地，汪泱等[5]采用免疫组化SP法，分别用鼠抗人IgG、IgD、IgA和IgM单抗对多种上皮来源恶性肿瘤组织及其部分传代细胞进行检测，发现在上述癌组织及癌细胞中有不同程度的阳性反应。我们研究发现上述10种上皮来源恶性肿瘤组织中均存在IgM表达，其阳性表达率70%与汪泱等[5]报道上皮来 8 源癌组织IgM抗体反应阳性率45.2%的结果有所不同，本研究还发现大肠癌、肝癌、胃癌也存在有IgM表达，这种差异可能与肿瘤组织标本选取以及染色结果判断标准有关。通过流式细胞仪间接免疫荧光法检测，我们还发现IgM在8种上皮来源恶性肿瘤传代细胞系及Burkitt's淋巴瘤Raji细胞中存在表达，与汪泱等报道的5种癌细胞系IgM抗体阳性的结论相似，但与黎明等报道的7种上皮来源肿瘤细胞系IgM和IgG抗体表达阴性的结果相反，究其原因可能与采用的检测方法和抗体不同有关。此外，在作为对照的30例9种正常组织中，我们发现2例食管粘膜鳞状上皮，1例胃底腺上皮，2例大肠粘膜腺上皮和1例肝脏组织IgM染色结果阳性，与以往报道结果[2,5]有所不同。现有的研究[2,4,5]表明，无论是在肿瘤组织还是传代细胞系，免疫球蛋白异位表达的部位主要位于胞浆，但也有少数位于细胞膜，我们免疫组化检测的结果与此相同，免疫球蛋白出现这种表达部位不同的原因是否与其功能有关有待进一步研究证实。有关免疫球蛋白在恶性肿瘤组织和细胞中表达意义及可能机制的研究才刚刚起步。邱晓彦等[2,6]认为肿瘤来源的免疫球蛋白具有生长因子样活性，可促进肿瘤细胞的生存和生长;曹亚等[7,8]通过同源性比较和基因分析，证实Tx是一个缺乏V区的异常人类免疫球蛋白kappa轻链基因，认为这种异位表达的Ig可能与肿瘤的恶性转化有关，Tx杂合型可能是鼻咽癌的危险因素;郑树等[9,10]发现的新基因SNC73是一个IgA样消化道肿瘤相关基因, 它的表达降低或缺乏可能在胃肠道上皮细胞增殖、代谢和突变中发挥作用，但SNC73在大肠癌及正常黏膜的表达与分化程度、 9 侵袭深度和转移等临床病理因素无明显相关性;我们的研究结果也未 发现IgM表达与肿瘤病理分级存在相关性(P>0.05);Babbage等[11] 则认为恶性上皮细胞活化诱导胞苷脱氨酶(Activation induced cytidine deaminase,AID)的激活对于Ig重链可变区基因的异位重排 和修饰具有潜在作用。我们通过研究发现多种上皮来源的恶性肿瘤组 织及传代细胞系中存在IgM的广泛表达，但其意义和机制有待进一步 研究。探讨IgM在癌细胞中的表达将为肿瘤癌变机制提供新的线索和 理论依据，也将为肿瘤生物治疗提供新的靶点和研究方向。致谢:感谢 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室(肿瘤生物治疗研究室)陈 县城博士后、王炼博士在免疫组化技术及结果判断中的指导和帮助， 以及毛咏秋、雷松实验员在流式细胞技术方面的指导。 【参考文献】 ,1,宋鑫,杨金亮,唐小海,等.应用血清蛋白组学技术筛选 鼻咽癌肿瘤抗原[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2005,12(2):94 97. ,2,Xiaoyan Qiu, Xiaohui Zhu, Liang Zhang,et al.Human Epithelial Cancers Secrete Immunoglobulin G with Unidentified Specificity to Promote Growth and Survival of Tumor Cells[J].Cancer Research,2003,63(19):6488 6495. ,3,Y Kimoto.Expression of heavy chain constant region 10 of immunoglobulin and T cell receptor gene transcripts in human non hematopoietic tumor cell lines[J]. 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