冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究_52575

冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究_52575 冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究 [标签:来源] 作者:胡慧红 钱宝华 郭峰 花美仙 查占山 徐建林 【摘要】 目的:探讨不同冰冻血小板复温后对血液系统免疫功能的影响。方法:按不同的 实验条件将血液反应系统分为 4 组，自体血小板组(自然体系对照组)、新鲜异体血小板组 (自然体系实验组 1)、新型血小板冷冻保护剂组(自然体系实验组 2)、6% DMSO 组(自然 体系实验组 3)，以灭活 S180 作为激活抗原，采用免疫荧光标记流式细胞仪分析方法，检测 血细胞表面相关免疫分子表达影响的变化规律。结果:血小板 CD55 和白细胞 CD25 表达水 平，自然体系实验组 1较自然体系对照组呈明显上调(P < 0.05)，自然体系实验组 2 及组 3 均较自然体系对照组上调。血小板 CD59 表达水平，自然体系实验组 1 较自然体系对照组 呈明显上调(P < 0.05)，自然体系实验组 2 及组 3 较自然体系对照组下调。红细胞 CD59 表 达水平，自然体系实验组 3 较自然体系对照组呈明显下调(P < 0.05)。结论:冰冻血小板 对红细胞免疫反应性的抑制作用强于新鲜异体血小板，对血小板、白细胞免疫反应性的激活 作用弱于新鲜异体血小板。 【关键词】 冷冻保存;血小板;CD55;CD41;CD59;CD25 〔Abstract〕 Objective To investigate how cryopreserved platelets influence systemic hematogenic immunological function by means of contemporary systemic immunology theory and methodology. Methods Hematological immune systems was divided into four groups according to different conditions, including autogenic platelets group (control), fresh allogenous platelets group (group 1), the new cryopreserved agent group (group 2), 6% DMSO group (group 3). Mouse Ehrlich's carcinoma cell S180 was used as activating agent and the expression of correlated moleculars on the surface of blood cells were detected and compared by means of immunofluorescence labeling flow cytometry. Results The expression of platelet CD55 and white blood cell CD25: the expression level of group 1 was higher than that of control (P < 0.05). The expression level of group 2 and group 3 was higher than that of control. The expression of platelet CD59: the expression level of group 1 was higher than that of control (P < 0.05). The expression level of group 2 and group 3 was lower than that of control. The expression of erythrocyte CD59: the expression level of group 3 was lower than that of control (P < 0.05). Conclusion The inhibition of cryopreserved platelets to immune response of red blood cell is stronger than fresh allogenous platelets. The activation of cryopreserved platelets to immune response of platelets and white cell is weaker than fresh allogenous platelets. 〔Key Words〕 Cryopreservation; Platelet; CD55; CD41; CD59; CD25 冰冻保存血小板可以延长保存时间克服原有保存方法的不足，具有良好的临床止血效果， 可长期大量库存，是目前唯一可被接受的传统常规保存血小板的替代方法[1]。但低温保存后 的血小板与新鲜、液态保存的血小板比较，细胞生物学特性发生了多方面的改变，单用血小 板聚集功能、低渗休克反应等体外功能的改变不能够较全面准确评价冰冻血小板的整体功能 [2]，需用多种参数来考量。血小板不仅具有止血功能，而且具有重要的免疫功能，要弄清血 小板在新型血小板冷冻保护剂[3]作用后对机体生理功能的影响，尤其是对免疫调节功能是否 有负面影响。我们利用系统免疫学自然与分离研究体系[4]，模拟体内血液循环系统，采用直 接免疫荧光标记流式细胞仪测定法，检测其影响对血细胞表面相关免疫分子(CD55、CD59 、 CD25 等)的变化情况，探索不同保存液的冰冻血小板对系统血液天然免疫功能是否有不同的 影响。寻找更科学更合理的血小板冷冻保存液与最佳的保存方法。 1 材料和方法 1.1 材料 所用试剂均为分析纯，二甲基亚砜、硝普钠、阿米洛利(Sigma，美国)，腺苷(Amresco， 美国)，FITC 标记抗人 CD55、PE 标记抗人 CD59、CD25、PE/Cy5 标记抗人 CD41(BD，美国)， 新型冷冻保护剂的配制:阿米洛利 0.0033 g、硝普纳 0.0007 g、腺苷 0.0013 g，溶解于 1 mL DMSO 中，在作为血小板冻存保护剂时，以 1:50 比例加入血小板，使得 DMSO 终浓度为 2%[5]。 1.2 实验设计 1.2.1 冰冻血小板的制备及分组设计 采集 10 位健康合格献血员全血 10 mL(ACD-B 抗凝)，2 000 r/min 离心 5 min 获得 富含血小板血浆(PRP)，后将每份 PRP 按不同的冷冻保护剂等分为 2 组(n = 10)，分别应 用 6% DMSO(组 1)、新型血小板冷冻保护剂(组 2)作为冷冻保护剂分装至冷冻保护管中放 入 - 80? 低温冰箱冷冻保存 1 周。 1.2.2 灭活癌细胞(S180)悬液的配制 S180 冰冻试剂(5×106 细胞/mL)37?水浴箱中解冻，2 500 r/min 离心 5 min，用生 理盐水调节 S180 浓度为 4×106 细胞/mL 悬液待用。 1.2.3 新鲜血小板及全血细胞悬液的制备 1.2.3.1 冷冻血小板的复苏方法 从低温冰箱中快速取出上周冻存的冰冻血小板，直接放入 37?恒温水浴箱中复温，使其在 1 min 内融化，备用。 1.2.3.2 富含血小板的血浆(PRP)及贫血小板血浆(PPP)的分离制备 新鲜采集与冰冻血小板同血型的健康成人 ACD 抗凝全血 10 mL×2，2 000 r/min 离心 5 min，吸取上层 PRP 至硅化管中备用。再从 PRP 试管中取出 500 L，3 000 r/min 离心 10 min，吸取上层 PPP 至另一试管中备用。 1.2.3.3 全血细胞悬液的分离制备 将上述全血细胞用 0.9% 生理盐水(NS)恢复原体积，混匀即为全血细胞悬液。 1.2.4 系统免疫学自然实验体系的设计[6] 试管1:0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 自体富含血小板血浆(自然体系对照组);试管 2:0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 自体贫血小板血浆(无血小板对照组);试管 3:0.2 mL NS+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 自体富含血小板血浆(无 S180 对照组);试管 4:0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 同型异体新鲜富含血小板血浆(自然体系实验 1 组);试管5:0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 同型异体新型血小板冷冻保护剂冰冻血小板悬液(自然体系实验 2 组);试管 6:0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 同型异体 6% DMSO 冰冻血小板悬液(自然体系实验 3 组)将上述试管混匀后置于 37?水浴箱中温育 1 h，加盖防止水蒸气进入。中间轻轻摇匀 2 次，使反应充分进行;取出后 2 000 r/min 离心 5 min;小心取出上清液，将沉淀物用 200 L PBS 重悬，使其体积为 200 L。 1.2.5 流式细胞仪检测各组血细胞表面相关免疫分子 1.2.5.1 红细胞表面 CD55、CD59 检测 取待测样品 1 L、PBS 缓冲液 50 L、 CD55-FITC、CD59-PE 单抗 4 L，充分混匀，室温避光 20 min;再加入 2 mL PBS 液，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 400 L PBS，立即上流式细胞仪(Becton Dickison FACS caliber，美国)检测。 1.2.5.2 血小板表面 CD55、CD59、CD41 检测 取待测样品 30 L，加入 300 L 的 1% 的多聚甲醛固定 30 min，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 PBS 缓冲液 50 L、 CD55-FITC、CD59-PE 单抗各 4 L、CD41-PE/Cy5 单抗 5 L 充分混匀，室温避光 20 min;再加入 2 mL PBS 液，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 400 L PBS，立即上流式细胞仪检测。 1.2.5.3 淋巴细胞表面 IL-2 受体链分子 CD25 检测 取待测样品 50 L，每管加入红细胞裂解液 1 mL，室温避光反应 10 min，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 CD25-FITC 抗体 3 L，充分混匀后室温避光 20 min;抗体结合后，再加入 2 mL PBS 液，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 400 L PBS，立即上流式细胞仪检测。 1.3 统计学处理 实验数据以 x?s 表示，统计学处理采用 t 检验，P < 0.05 为差异显著，P < 0.01 为差异非常显著。 2 结 果 2.1 自身血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响 无血小板对照组红细胞 CD55、CD59 阳性细胞平均荧光强度较自然体系对照组明显下调(P 值分别为 P < 0.01、 P < 0.05)，表明自身血小板对红细胞 CD55 和 CD59 分子表达有上调作用。白细胞 CD25 略有上调，但差异无统计学意义(表 1)。 2.2 异体血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响 新鲜异体血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响:自然体系实验组 1 白细胞 CD25 阳性细胞平均荧光强度较自然体系对照组明显上调(P < 0.05)，表明新鲜异体血小板对白细胞 CD25 有激活作用。红细胞 CD55、CD59 出现一定程度的下调，但差异无统计学意义(表 1)。血小板 CD55、CD59 阳性细胞平均荧光强度较自然体系对照组明显上调(P < 0.05)，表明异体血小板有被 S180 和受者血液有关成分激活现象(表 2);不同冷冻保护剂作用下的冰冻血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响:自然体系实验组 2(15.69?5.40)红细胞 CD55 表达水平较自然体系对照组(17.13?4.86)下调，自然体系实验组 2(37.91?10.04)红细胞 CD59 表达水平较自然体系对照组(41.84?10.14)下调，自然体系实验组 2(13.67?3.45)白细胞 CD25 表达水平较自然体系对照组(12.44?5.09)上调(表 1)。自然体系实验组 2(17.52?7.07)血小板 CD55 表达水平较自然体系对照组(16.58?5.41)上调，自然体系实验组 2(17.92?7.06)血小板 CD59 表达水平较自然体系对照组(18.76?4.33)下调(表 2)，差异无统计学意义;自然体系实验组 3 红细胞 CD59 阳性细胞平均荧光强度较自然体系对照组明显下调(P < 0.05)，白细胞 CD25 分子出现一定程度的上调，红细胞 CD55 出现一定程度的下调，但差异无统计学意义(表 1)。血小板 CD55 分子出现一定程度的上调， 血小板 CD59 出现一定程度的下调，但差异无统计学意义(表 2)，表明对于冰冻保存血小板血小板 CD59 维持原水平效果比常温下保存的好，可能是因为血小板冰冻保存时补体调节蛋白未受到激活和影响。新型血小板冷冻保护剂组优于 6% DMSO组。 3 讨 论 血液中存在复杂的天然免疫和特异性免疫物质(包括各种血细胞和血浆蛋白等)[7]，将血小板输入异体血循环，必然会导致一定的机体免疫状况的变化。本实验运用郭峰教授提出的“血液免疫反应路线图体外仿真实验研究体系”[8]，利用 S180 作为免疫原快速激活系统血液天然免疫反应[9]，模拟体内血液系统的天然免疫反应过程，探讨不同血小板冷冻保护剂作用下的冰冻血小板复温后对血液免疫系统的影响。 在天然与适应免疫过程中，T 淋巴细胞分泌的细胞因子与其相应的受体结合使其发生活化反应。IL-2 受体α链，又称 CD25，是一类具有特殊免疫调节功能的免疫分子，分布在 T 细胞、NK 细胞。它的激活对天然免疫及适应性免疫均起到调控作用，是活化T淋巴细胞的标志[10]。 血小板与红细胞膜表面共同表达多种免疫相关分子，其中较为重要的是 CD55 和 CD59 分子[11，12]。CD55 即衰变加速因子(DAF)，其分子基础和化学构成与 CD59 相似，其作用机理是即可阻止经典或替代途径 C3 和 C5 转化酶的装配，并使已形成的C4、C5 转化酶失去稳定性，从而抑制补体攻击单位的活化，CD55 还参与 T 细胞信息传递过程。异体血小板各组的红细胞 CD55 表达水平与自体血小板组相比均有所下调。新鲜异体血小板组血小板 CD55 与自体血小板组比较明显上调。冰冻血小板各组与自体血小板组相比血小板 CD55 出现一定程度的上调。CD59 亦称攻膜复合体抑制因子，其机制主要在于阻碍膜攻击复合物(MAC)的组装，阻碍 C7、C8、C5b-6 复合物结合，保护自身细胞免除补体的攻击，CD59 还是 T 淋巴细胞 CD2 的配体，参与 T 淋巴细胞活性的调控。体外研究显示血小板膜表面形成的 MAC 是补体激活引起血小板变形，ATP 释放的关键，CD59 对依赖补体血小板损伤有保护作用。CD59 单抗作用于血小板，可使上述反应增强，表明CD59 对上述作用具有抑制效应。CD59 缺乏或表达下降时，少量 MAC 生成即可导致血小板活化，血液凝固性增强。异体血小板各组的红细胞 CD59 表达水平与自体血小板组相比均有所下调，表明 CD59 的免疫调节功能有所下降。新型血小板冷冻保护剂组与新鲜异体血小板组比较表达有所下调，但无明显差异，与 6% DMSO 组比较上调较明显，新型血小板冷冻保护剂组较 6% DMSO 组更接近于自体血小板组。但实验中差异无统计学意义，考虑可能由于样本例数太少、FCM 测定技术的误差所致，在以后的实验中需要进行大样本量的进一步验证。 CD41 是血小板膜糖蛋白?b/?a 复合物的α亚单位，在静息和活化的血小板上均表达，可作为血小板特异性膜抗原用以鉴别血小板群。在本研究中测定 CD41 是明确血小板群标记作用，使流式细胞仪分辨更为准确。 本实验证实了血小板能够提高红细胞表面的CD55、CD59 免疫分子的表达水平，因此可以认为自身血小板对系统血液天然免疫反应有以正调控为主的调控作用。通过比较新鲜异体血小板及冰冻异体血小板对系统血液天然免疫反应的作用发现，冰冻血小板对红细胞免疫反应性有抑制作用，其作用强度强于新鲜异体血小板;而对血小板、白细胞免疫反应性有有以激活为主的作用，但其影响弱于新鲜异体血小板。但在新型血小板冷冻保护剂作用下的冰冻血小板对机体的血液天然免疫功能的抑制作用低于在 6% DMSO 作用下的冰冻血小板，表现为新型血小板冷冻保护剂作用下的冰冻血小板在本次实验中对红细胞表面的 CD55、CD59 及血小板表面的 CD59 免疫分子的表达水平高于 6% DMSO 作为冷冻保护剂保存的冰冻血小板。目前冰冻保存后的血小板对机体免疫功能的影响的研究主要集中在膜表面分子标志的变化，具体的机理尚有待于进一步的深入研究，可以进一步为血小板的冷冻保存和新型血小板冷冻保护剂的开发与应用提供理论依据与更好的参数，为临床应用研究提供新思路。 【参考文献】 〔1〕 Alving BM, Reid TJ, Fratantoni JC, et al. 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