醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究

醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 分类号 密 级 UDC 保密期限 博士学位论文 题 目 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究作者姓名陈学伟 指导教师刘洪涛研究员 培养单位军事医学科学院卫生学环境医学研究所 专业名称劳动卫生与环境卫生学论文提交日期 2012 年 5 月 20 日 学位授予单位中国人民解放军军事医学科学院 答辩委员会主席 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制军 事 医 学 科 学 院研 究 生 学 位 论 文独 创 性 声 明 秉 承 军 事 医 学 科 学 院 严 谨 的 学 风 和 科 研 作 风 , 本 人 声 明 所 呈 交 的 学位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下 独立进行 的 研 究 工 作 和 取 得 的 研 究 成 果 , 除了文 中 特 别 加 以 标 注 和 致谢 之处 外 ,论文 中 不 包 含 其 他 人 已 经 发 或 撰 写 过 的 研究成果 , 也 不包 含为获得 军 事医 学科 学院 或其它 教育 机构的学 位或证 而 使 用 过 的 材 料 。 与 我 一 同 工 作 的 同 志 对 本 研 究 所 做 的 任 何 贡 献 均 已 在 论 文中作了 明确的 说 明并表示 了谢意 。 论文作者 签字:签字 日期: 年 月 日 军 事 医 学 科 学 院保 护 知 识 产 权 声明 本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 军事医学科学院 对 研 究 生 在 学 其 间 撰 写 的 论 文 知 识 产 权 保 护 的 相关 规定。本 人 撰 写 的 论 文 是 在 导 师 具 体 指 导 下 , 并 得 到 相 关 研 究 经 费 支 持 下 完 成 的 , 其 数 据 和 研 究 成 果 归 属 于 导 师 和 作 者 本 人, 知识产 权单位 属 军 事医 学科 学院 。 本人 保证毕 业 后 , 以本论文 数据和 资 料 发 表 论 文 或 使 用 论 文 工 作 成 果 时 署 名 第 一 单 位 仍 然 为 军 事 医 学 科 学 院 。 军事 医学 科学院 有权保 留学位 论 文及其电 子版, 公 布论文的 全部或 部 分 内 容 , 可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 其 他 复 制 手 段 保 存 论 文 、 汇 编 以 供 查 阅 和 借阅。 (保密学 位论文 在 解密后适 用本声 明 ) 论文作者 签字: 签字日 期:年 月 日 指导教师 签字: 签字日 期:年 月 日 目 录 目 录. 1 中英文缩略词. 3 中文摘要 5 英文摘要 9 前言.13 第一章 哺乳动物肾上皮细胞模型建立及评价..17 一. 材料和方法. 17 1. 材料. 17 (1) 细胞模型 17 (2) 主要实验试剂. 17 (3) 主要实验仪器. 18 (4) 主要溶液的配制 19 2. 方法. 19 (1) 细胞培养 19 (2) SICM 扫描成像. 20 (3) 跨膜电阻测量. 22 (4) 单通道24 (5) 数据统计 24 二. 结果. 24 1. 细胞形态学. 24 2. 跨膜电阻测量 26 3. 单通道电流记录27 三. 讨论. 28 四. 小结. 30 第二章 醛固酮对肾上皮钠通道的快速调控作用.31 一. 材料和方法. 31 (1) 细胞培养:31 (1) 扫描离子电导显微镜技术33 (2) 跨膜电阻测量. 34 军事医学科学院博士论文 1(3) 膜片钳技术34 (4) 胞内 Ca2+浓度测试 37 (5) 数据统计:37 二. 结果. 38 1. 醛固酮对 mpkCCD细胞形态的影响. 38 2. 醛固酮对 mpkCCD?TEER 的影响 40 3. 单通道电流记录40 4. 醛固酮对 mpkCCD 胞内钙离子浓度的影响 43 三. 讨论. 44 四. 小结: 45 第三章 醛固酮快速调控肾上皮钠通道的作用机制47 一. 材料和方法. 47 (1) mpkCCD 细胞培养47 (2) 实验细胞分组: 47 (3) 主要实验技术. 48 (4)数据统计: 48 二. 结果. 48 1. PI3-K在醛固酮快速调控 ENaC 中的作用: 48 2. Ca2+在醛固酮快速调控 ENaC 中的作用:52 3. 细胞骨架结构与 ENaC 功能活性的关系: 52 三.讨论 55 结论.59 参考文献.61 (综述)醛固酮对肾上皮钠通道(ENaC)的重吸收调控68 发表的文章75 致谢.86 军事医学科学院博士论文 2 中英文缩略词 英文缩写 英文全称 中文 ALDO aldosterone醛固酮 PKAProtein kinase A 蛋白激酶 AAIP aldosterone induced protein 醛 固酮诱导蛋白 CCD cortical connecting duct皮质集合管Cyt D Cytochalasin D细胞 松弛素 D DMSO Dimethyl sulphoxide 二甲基亚砜 ENaC epithelia sodium channel 上皮钠通道 MDCK Madin-Darby canine kidney犬肾上皮细胞 MR mineralocorticoid receptor盐皮质激素受体 PI3-K phosphatidylinositol 3-kinase 磷脂酰肌醇 3激酶 TEER trans-epithelia electrical resistance 跨膜电阻 PIP2PhosPhatidylinosital biPhosPhate 磷脂酰肌醇二磷酸 RAAS renin-angiotensin-aldosterone system 肾素-血管紧张素-醛固 酮系统 军事医学科学院博士论文 3PIP3phosphatidylinosital 3,4,5- trisphosphate 磷脂酰肌醇三磷酸 SICM Scanning Ion Conductance Microscopy扫描离子电导显微镜 mpkCCD mouse principle cell of kidney incortical collecting duct 鼠肾皮质集合管主细胞HPICM Hopping Probe Ion ConductanceMicroscopy 跳跃探针离子电导显微镜 LY294002 2-4-morpholinyl-8-phenyl PI3-K抑制剂 4H-1-benzopyran-4- one军事医学科学院博士论文 4醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 中文摘要 醛 固酮快 速调控肾 上皮钠 通道的作 用 研究目的 :醛固酮在调节细胞外液,维持电解质平衡以及控制血压稳定的过程中 发挥着重要的作用,醛固酮重要的生理功能有赖于通过调控肾上皮钠通道(ENaC) 对钠的重吸收,目前已知相关的作用机制分为基因组作用和非基因组作用。其中, 研究较清楚的是醛固酮的基因组作用方式:醛固酮进入集合管主细胞后,与胞浆 内的盐皮质激素受体mineralocorticoid receptor,MR结合,形成激素-受体复合体, 后者进入细胞核与核中 DNA特异性结合位点相互作用,调节特异性 mRNA转录, 最终合成多种醛固酮诱导蛋白aldosterone-induced protein, AIP,使管腔膜apical sideENaC 活性增强,基侧膜basolateral side钠钾泵的活性增加,从而促进跨上皮 + 细胞的 Na 重吸收。醛固酮基因组作用的特点是作用起效较慢,作用时间长,对 MR 阻断剂敏感。此外,醛固酮还可发挥快速的非基因组作用来调控 Na+的重吸收, 此作用的特点为起效迅速,对 MR 阻断剂不敏感,但其内在机制还知之甚少。因此研 究醛固酮非依赖 MR 快速调控 ENaC 的作用及其相关的作用机制,有助于进一步 全面了解醛固酮调节 ENaC 作用的生理、病理意义,同时也可促进新型醛固酮拮 抗药物的研发,为醛固酮快速作用提供可能的应对。 主要内容: 1 建立具有 ENaC 活性的哺乳动物肾上皮细胞模型并进行评价。 2 研究醛固酮快速调控 ENaC 的作用。 3 探讨醛固酮快速调控 ENaC 的可能机制。 研究方法: 1. 实验细胞模型的建立 建立具有 ENaC 活性的哺乳动物肾上皮细胞模型-选择 MDCK(Madin-Darby canine kidney)、mpkCCD(mouse principle cell of kidney in cortical collecting duct) 两种细胞株,培养成具有完整膜,有极性,高阻抗,阿米洛利敏感的细胞模型,最 后通过观察细胞形态结构、测量跨膜电阻值、测量细胞单通道记录三个方面来评 估,择优选出适合进一步实验的理想细胞模型。 军事医学科学院博士论文 5 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 2. 醛固酮对 ENaC 的快速调控作用 -6 给予醛固酮10 M/L作用于 mpkCCD 细胞模型,观察醛固酮对细胞形态结 构、阿米洛利敏感的跨膜电阻、胞内钙离子浓度、单通道离子电流的影响。使用 MR 阻断剂螺内酯以及醛固酮转录、蛋白合成抑制剂,验证醛固酮对 ENaC 快速(< 3小时)调节作用主要是非依赖 MR 的非基因组作用。 3. 醛固酮对 ENaC 作用机制的研究 (1) 通过使用 PI3-K通路特异性的阻断剂 LY29400250um/L验证 PI3-K通路在 醛固酮快速调控 ENaC 过程中的作用。 (2) 通过使用钙离子载体 A23187(1um/L)快速增加胞内钙离子浓度来探讨胞 内钙离子在醛固酮调控快速调控 ENaC 过程中的作用。 (3) 通过使用细胞松弛素 DCyt D打断细胞骨架 F-actin,探讨细胞形态与 ENaC 功能活性之间的关系。 4. 主要的指标及测量方法 (1) 细胞形态学观察:扫描离子电导显微镜(SICM) (2) 跨膜电阻值:跨膜电阻仪(EVOM2) (3) 单通道离子电流:膜片钳 cell-attached 单通道记录 (4) 胞内钙离子: 高速比率钙离子浓度测量荧光显微技术 结果: 1. 建立了具有 ENaC 活性哺乳动物肾上皮细胞模型-mpkCCD细胞模型。 2. 醛固酮作用于 mpkCCD 细胞,细胞发生横向收缩纵向伸展,胞内钙离子浓度 升高,整体膜和单通道水平的 ENaC 活性增强,表现为阿米洛利敏感的跨膜电 阻升高和离子通道开放概率增加。 3. LY294002 能够阻断醛固酮对 ENaC 的激活作用,表现为细胞恢复原貌, 阿米 洛利敏感的跨膜电阻降低和离子通道开放概率减少。 4. A23187 能迅速增加胞内钙离子浓度,并增强 ENaC 活性,表现在阿米洛利敏 感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。 5. Cyt D 能使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变,ENaC 活性增强,表现为阿米 洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。 军事医学科学院博士论文 6 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 结论 : 1. 醛固酮能够快速增强 ENaC 活性。 2. 醛固酮快速增强 ENaC 活性作用机制可能是通过快速增加胞内钙离子浓度,激 活 PI3-K通路,使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变,从而增加的离子通道的 开放概率。 3. Cyt D能使细胞发生形变(横向收缩纵向伸展),ENaC 活性增强,说明细胞骨 架 F-actin 解聚有利于提高离子通道开放概率。 关键词: 醛固酮,EaNC,mpkCCD, TEER,SICM 军事医学科学院博士论文 7 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 英文摘要 Rapid regulation of Aldosterone on epithelia sodium channel Abstract Object: Aldosterone play an important role in regulation of extracellular volume, electrolytes homeostasis and blood pressure control. These physical function depend on the limited regulation of sodium reabsorption by epithelial sodium channel ENaC in cortical connecting duct, the mechanisms of ENaC regulation by Aldo is compose of genomic and nongenomic action in present study. The mechanism of genomic is clear: the Aldo enter the principle cell of cortical connecting duct CCD and binding with MR in intracytoplasm, and Aldo-MR complex transport into intranuclear and interact with the specific DNA bingding site which finally regulate specific mRNA transcripte and synthesis several aldosterone induced protein AIP. And then AIP increase the ENaC activity hence promote the sodium reabsorption by ENaC. An other mechanism is nongenomic ation ,the character of nogenomic of Aldo is rapid and non-MR-dependence, but the underlying mechanism is still unclear,. For further understand the physiology and pathology meaning of ENaC regulation by aldosterone , we will explore the rapid regulation of aldosterone on ENaC and its possible mechanism .On the other hand ,it could help to promote the development of new drugs like aldosteronic antagonistContent: 1 Establishment and assessment of the mammalian epithelial cell model that have ENaC activity2 Research the rapid regulation of ENaC activity by aldosterone3 Explore the mechanism of the rapid regulation by aldosteroneMethod: 1. Establishment of cell modelWe estabish mammalian renal epithelia cell mode that have ENaC activityMDCK and mpkCCD were cultured to integrate monolayer which have high resistance and sensitive to amiloride. Finally, the cell model were assessed by morphologic observation, TEER measurement and sigle channel recording and the better one were selected for further research 2. Rapid regulation by aldosteroneMR blocker- aldactone were added to Verify the non-MR-depended rapid regulation<军事医学科学院博士论文 9 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 -6 3hours.after addition of 10 M/L aldosterone on mpkCCD monolayer, toppgraphic image were observed , amiloride-sensitive ?TEER were measured ,single channel current were recorded and intracellular calcium concentration were detected 3. The mechanism of rapid ENaC regulation by aldosterone (1) The specific PI3-K blocker were used to identify the function of PI3-K pathway in rapid regulation on ENaC by aldosterone(2) Cacium loader A23187 were used to increase the concentration of intracellular calcium and explore the effect of intracellular calcium change on rapid regulation on ENaC by aldosterone(3) Cyt D were used to disrupt the F-acin of cystoskeleton and discuss the relationship of cell morphology and EaNC activity4. Main index and measurement(1) Morphology observation: SICM 2 (2) TEER: EVOM (3) Single channel recording: patch clamp cell-attached configuration Result: 1. Establish mpkCCD mammalian epithelia cell model that have EaNC activity2. After addition of aldosteron , cell transversal contract and ongitudinal stretching, EaNC activity increase both in monolayer and single channel and display amiloride-sensitive ? TEER and channel open probability improve3. LY294002 block the increase of aldosterone induced EaNC activity and recover the topographic change ,decrese the miloride-sensitive ?TEER and channel open probability4. A23187 rapid increase the intracellular calcium concentration and increase amiloride-sensitive ?TEER and channel open probability5. Cyt D make the cell transversal contract and longitudinal stretching and increase amiloride-sensitive ?TEER and channel open probabilityConclusion: 1. Aldosterone rapid increase the EaNC activity2. PI3-K pathway and cacium play an important role in aldosterone rapid increase EaNC activity 军事医学科学院博士论文 10 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠 通道作用的研究 3. Morphological change transversal contract and longitudinal stretching increase EaNC activity reveal that morphology and EaNC activity close relativeKeyword: Aldosterone, EaNC,mpkCCD,TEER,SICM 军事医学科学院博士论文 11 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 前言 醛固酮aldosterone作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的终产物,是一种已被发现 长达50多年之久的最重要的盐皮质激素,主要由肾上腺皮质球状带和网状带分泌, 其生理功能是通过调控肾小管对钠的重吸收来调节细胞外液容量、进而维持血压 的稳定[1-3]。当细胞外液容量下降时,刺激醛固酮分泌增加,使肾脏重吸收钠增 加,进而引起水重吸收增加,细胞外液容量增多,最终导致心排血量增加、血压 升高;相反当细胞外液容量增多时,醛固酮分泌减少,肾重吸收钠、水减少,细 胞外液容量下降、血压下降。机体具体表现为,当体内不能正常分泌醛固酮时导致 低血压;相反地,由肾上腺皮质瘤所引起醛固酮的过度分泌则导致患者血压 高,并 且在肿瘤摘除后血压恢复正常。因此,醛固酮在调节血压稳定和维持体内电解质 平衡的过程中发挥着重要的生理作用。 钠是细胞外液中最主要的电解质,对维持细胞外液的渗透压及容量具有重要 作用。正常人血浆钠浓度为 140mmol/L, 肾小球滤过率约为 180L/d,则每日滤过 钠约为 25200 mmol,每日由尿排出的钠仅 100-200mmol,滤过钠的 99%以上被肾 小管重吸收。其中,最后也是最重要的一小部分钠重吸收约 2%由肾皮质集合管 主细胞上皮钠通道epithelial sodium channel, ENaC完成,正是此部分对钠重吸收 量的精细调节最终决定了人体钠代谢的平衡 ,构成了跨肾上皮钠重吸收的主要限 速步骤, 在调节电解质内环境稳态及酸碱平衡扮演着重要角色,因此 ENaC 成为 醛固酮精密调控肾上皮细胞钠重吸收的作用的主要靶点[4]。ENaC 是一种跨膜糖 蛋白,其主要由 α、β、γ 3 个亚单位组成一般包括:2 个 α 亚单位、1 个 β 亚单位、 和 1 个 γ 亚单位。每个 ENaC 亚单位均包括四个部分: 2 个跨膜区域,1 个大的细胞 外袢,及细胞质内的末端。ENaC 的每个亚单位及其各自的四个组成部分都或多或 少参与了 ENaC 的组装、转运、膜上表达、降解、开闭特性和离子选择性的调控 [4, 5]。ENaC 是一种醛固酮诱导蛋白AIP,在内质网合成并组装,在高尔基体成熟, 以胞吐的方式与细胞膜融合并在细胞膜上表达并发挥转移钠离子的作用 ,之后被 泛素化,以胞吞的方式内摄和降解。ENaC 对醛固酮、胰岛素、抗利尿激素敏感, 其调控作用表现在 ENaC 在胞内库存和膜表面表达分布情况以及活性的改变[6, 7]。分布在肾皮质集合管上皮细胞的 ENaC 是非电压门控的阿米洛利(amiloride) 敏感的钠离子通道, ENaC 已被在调控钠重吸收及维持血压稳定中起着关键军事医学科学院博士论文 13 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 作用并且 ENaC 功能紊乱是某些遗传型疾病的发病基础:如 ENaC 基因的功能获 得性突变使该通道过度激活,钠重吸收增加, 细胞外液容量扩张,导致高血压如 Liddle 综合征;相反,由于 ENaC 基因突变而使该通道功能丧失,钠重吸收减少, 则导致低血压如 I 型假性低醛固酮血症[8-11] 目前已知醛固酮主要通过基因组genomic和非基因组non-genomic两种作用 方式来调控肾皮质集合管主细胞ENaC活性以实现钠的重吸收[12-14]。其中,研究 较清楚的是醛固酮的基因组作用方式。具体机制是:非活化的盐皮质激素受体 mineralocorticoid receptor,MR主要位于胞浆中,与分子伴侣热休克蛋白相结合, 一旦醛固酮进入集合管主细胞,即可引起受体构型发生变化,与分子伴侣热休克 蛋白脱离,与胞浆内的MR结合,形成二聚体并激活核定位信号,并使活化的受体 配体复合物转移至核内,调节特异性mRNA转录,随后NDA结合区暴露,锌指端 与靶基因上磷酸基团结合,识别特异性DNA序列并使之紧密结合,通过RNA聚合 酶?直接影响基因转录;或者通过与其他转录因子的作用,间接调节基因转录,最 终合成多种醛固酮诱导蛋白 aldosterone-induced protein, AIP,使管腔膜apical sideENaC活性增强,基侧膜basolateral side钠钾泵的活性增加,从而促进 跨上皮 细胞的Na+重吸收[6, 7]。基因组作用的特点是作用时间长,能够被MR阻断剂、 转录和蛋白合成抑制剂阻断。此外 ,醛固酮还可发挥快速的非基因组作用来调控 Na+的重吸收,此作用的特点为起效迅速,对MR阻断剂不敏感,其内在机制及其与 基因组作用的关系目前知之甚少[13, 18]。 醛固酮非基因组作用首先在非肾上皮细胞中发现, Wehling等[8]发现醛固酮 快速增加人淋巴细胞胞内Na+、Ca2+浓度,该作用不能被MR阻断剂阻断,还发现放 射性碘标记的醛固酮与细胞膜高亲和力结合,并由此提出了醛固酮膜受体假说[9]。 后来有研究表明,醛固酮在30分钟内增加了跨大鼠肾皮质集合管上皮细胞的离子 流,该作用不能被转录和蛋白合成抑制剂完全抑制,部分属于非基因组作用[21]。利 用膜片钳技术,Zhou等[21, 22]在急性分离的兔肾皮质集合管主细胞中发现,醛固 酮能在1-2分钟内迅速增加ENaC活性,且该作用不能被MR拮抗剂阻断,属非基因 组作用[23, 24]。目前,假想醛固酮膜受体的克隆努力已失败,且不同细胞的假想膜 受体与醛固酮的亲和力差异巨大,反映了假想膜受体与醛固酮结合的非特异性, 因此醛固酮通过何种受体来发挥其非基因组作用尚不清楚[6, 25]。 军事医学科学院博士论文 14 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 在大鼠肾皮质集合管细胞中,醛固酮增加Na+跨膜重吸收分为早期3小时增 加2-3倍的重吸收和晚期3-24小时增加约20倍的重吸收两个阶段[5]。早期增加的 Na+重吸收对MR受体阻断剂不敏感,用不能透过细胞膜的牛血清白蛋白偶联醛固 酮也可以引发该早期作用,说明早期阶段可能是不依赖传统MR的非基因组作用 [19]。而晚期的Na+重吸收则依赖于经典的MR和转录翻译过程,因而其晚期阶段是 基因组作用。醛固酮的非基因组作用涉及的第二信使通路非常广泛,并与细胞内 多种信号通路的激活有关,对细胞内Ca2+浓度的调节是醛固酮非基因组作用的常 见表现[8]。在肾脏皮质集合管细胞中,醛固酮非基因组作用与其基因组作用可能存 在相互的联系和作用,并可以在两者信号通路的共同环节上发生整合, 而第 二信使 通路的激活有可能是醛固酮的非基因组作用与基因组作用的有效整合途径[10], 但非基因组作用与基因组作用的确切关系有待进一步深入研究。 在醛固酮快速增加ENaC的活性的早期阶段,并没有发现ENaC基因mRNA表达 及蛋白表达的明显变化。因此,醛固酮非基因组作用只能通过增加已有ENaC的开 放频率和数目来提高ENaC的活性[11]。研究证明,醛固酮既可以通过诱导ENaC蛋 白的甲基化或磷酸化来增加ENaC的开放频率[12],也可以通过促进管腔膜上ENaC 各亚单位的组装来增加ENaC的密度及开放数目[23],但其调控ENaC活性的具体机 制不明。 人们很早就发现了ENaC的活性与肌丝细胞骨架的紧密联系,添加肌丝解聚药 物细胞松弛素D可以显著增加ENaC的开放频率[24, 25]。磷脂酰肌醇三羟基激酶 PI3-K就是一种可以通过引起细胞骨架变化[26],来影响ENaC活性的激酶。尽管 PI3-K不是一种AIP,但其激酶活性直接受醛固酮诱导G蛋白K-Ras2A的调控,并能迅 速增加PI3-K催化产物磷脂酰肌醇三磷酸PIP3的形成,而PIP3最近更被证明可以 直接与ENaC的胞内末端结合并增加通道的开放频率[27, 28]。因此,PI3-K 通路在 醛固酮快速调控ENaC活性过程的作用值得进一步探讨,同时,细胞骨架结构变化 引起细胞表面形态变化与ENaC活性之间的关系也值得更深入的研究。 在早期脊椎动物从海水到淡水再到陆地的进化过程中,醛固酮系统就是动物 们发展起来的一种调节自身盐代谢平衡以快速适应外界复杂多变环境的复杂系 统。而醛固酮非基因组作用的时间效应又使得这一调节系统在动物快速适应环境 改变时可能扮演着重要角色[29]。前期醛固酮调控ENaC机制研究中采用的大都是军事医学科学院博士论文 15 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 爪蟾Xenopus laevis肾上皮A6细胞等两栖动物模细胞型,但是哺乳动物与两栖动 物存在体温差异,其细胞内温度敏感的生化反应不存在可比性,而且细胞内的信号 传导路径也可能存在进化过程的趋异性[30]。稳定的具有ENaC活性的哺乳动物肾 上皮细胞模型还是一个难题,因此,我们首先要建立具有ENaC活性的肾上皮 细胞 模型,然后在哺乳动物肾上皮细胞深入研究醛固酮调控ENaC活性的非依赖MR的 快速作用机制,探讨PI3-K通路,胞内钙离子以及细胞松弛素D在醛固酮快速调控 ENaC过程的作用。军事医学科学院博士论文 16 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 第一章 哺 乳 动 物肾 上 皮 细 胞 模 型建 立 及评价 醛固酮通过调控肾上皮钠通道(ENaC)对钠的重吸收来调节细胞外液容积和血压。 目前相关醛固酮调控ENaC机制的研究主要是在爪蟾肾上皮A6细胞等两栖动物细胞模型 上进行,但是哺乳动物与两栖动物存在体温差异,其细胞内温度敏感的生化反应不存在 可比性,而且细胞内的信号传导路径也可能存在进化过程的趋异性[23, 31, 32]。因此 建立稳定的具有 ENaC 活性的哺乳动物肾上皮细胞模型显得尤为重要,本实验拟建立 MDCK、mpkCCD两种肾上皮细胞模型并从形态结构和功能方面进行评价。 一. 材料和 方法 1. 材料 (1) 细胞模型 犬肾上皮细胞(MDCK) 赛尔生物技术有限公司,天津 鼠肾皮质集合管主细胞(mpkCCD) 获赠于哈尔滨医科大学张志仁教授 (2) 主要实验试剂 RPMI 1640培养基 Gibco,USA 胎牛血清 Gibco,USA 谷氨酰胺 Gibco,USA 胰蛋白酶 Gibco,USA 硒酸钠-转铁蛋白ITS-G Gibco,USA 地塞米松 Sigma,USA 三碘甲状腺氨酸(T ) Sigma,USA 3 EGFSigma,USA 甲基亚讽Dimethy1Sulf。Xide,DMSO Sigma,USA 双抗(链霉素、青霉素) Hyclone,USA 军事医学科学院博士论文 17 醛固 酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 DMEM/F12 Hyclone,USA L15Invitrogen,USA (3) 主要实验仪器 超净工作台 长城空气净化,北京 CO2 恒温孵箱 ThermoForma,USA 扫描离子电导显微镜(ICnano SICM) Ionscope,UK PatchClamp 200B Axon,USA Digidata 1440AAxon,USA TiU 倒置显微镜购自日本 Nikon,Japan P-2000/G型程控水平激光微电极拉制仪 Sutter Instrument,USA 2 跨膜电阻仪 EVOM WPI,USA Micro 80 主动避震台 Halcyonics GmbH,Germany TMPT-ID精密光学平台 博天胜达科技发展有限公司,天津 AX205 型电子天平 METTLEER TOLEDO,SwitzerlandXSP-15C普通光学显微 镜 长方光学仪器有限公司,上海 QF-1台式恒温振荡器 市欧诺仪器仪表有限公司,天津 HVE-50高压蒸汽灭菌锅HIRAYAMA,日本 SC-3610低速离心机科大创新股份有限公司,中国 Milli-Q型Academic超纯水系统 MILLIRORE,USA PL403 型电子天平 梅特勒-托利多仪器,上海 JBZH 磁力搅拌器大普仪器有限公司,上海 PH 检测计 PSH-3C 雷磁紧密,上海 硼硅酸盐微电极玻璃毛细管 滨川科学仪器, 武汉 军事医学科学院博士论 文 18 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 移液枪,100uml、1000ul 大龙,中国 移液枪,10ul、100ul、1000ulLegondoff, USA (4) 主要溶液的配制 mpkCCD培养基配制: 1N NaOH:1L无菌水+40g NaOH 三碘甲状腺氨酸:0.00673g 溶于 10mL NaOH,1mM,稀释 1000 倍 10ul+10ml 1N NaOH,1um,500um分装,-20?保存。 地塞米松:0.063038g 溶于1ml无菌水中,10 mM,稀释20倍 10ul+190ul无菌水 -4 5×10 M,3ul分装,-20?保存。 EGF:100ug溶于10ml 无菌水中,10ug/ml,100ul 分装,-20?保存。 mpkCCD 培养成分:DMEM/F12 1:1 混合液(含 60nM 硒酸钠,5 μ g/ml 转铁蛋白,2mM 谷 氨酰胺,50nM地塞米松,1nM三碘甲状腺氨酸,10ng/mlEGF,100U/ml 青霉素、100ug/ml 链霉素,2%胎牛血清)。 MDCK 培养成分:RPMI1640含 100U/ml 青霉素、100ug/ml 链霉素,10%胎牛血清 2. 方法 (1) 细胞培养 MDCK 细胞的培养基选用 RPMI 1640,含 100 ?g/ mL 链霉素、100 ?g /mL 青霉素和 10 %胎牛血清,细胞均置于 37 ?、5 %CO 、95 %空气、饱和湿度的 CO 孵育箱(Thermo 2 2 Scientific,美国)中培养[13]。每 2~3 天更换一次新鲜培养基,当细胞长至 80~90 % 4 汇合时,分瓶传代。实验所用细胞以 2~5×10 个/mL浓度接种于 35 mm培养皿(Corning, 美国)中,每 2~3 天更换一次新鲜培养基,取培养 14~16 天形成紧密单层细胞膜时的 细胞进行后续的SICM 扫描观测、跨膜电阻测试和膜片钳实验。 MpkCCD细胞的培养基选用 DMEM/F12 1:1 混合液(含60nM 硒酸钠,5μ g/ml转铁蛋 白,2mM 谷氨酰胺,50nM 地塞米松,1nM 三碘甲状腺氨酸,10ng/mlEGF,100U/ml 青霉军事医学科学院博士论文 19 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 素、100ug/ml链霉素,2%胎牛血清),细胞均置于 37 ?、5 %CO 、95 %空气、饱和湿度 2 的 CO 孵育箱(Thermo Scientific,美国)中培 2 养[14]。每2~3天更换一次新鲜培养基,当细胞 长至 80~90 %汇合时,分瓶传代。实验所用细胞 4 以 2~5×10 个/mL 浓度接种于 35 mm 培养皿 (Corning,美国)中,每 2~3 天更换一次新鲜 培养基,取培养 14~16天形成紧密单层细胞膜时 的细胞进行后续的 SICM扫描观测、跨膜电阻测试 和膜片钳实验。 (2) SICM扫描成像a. 玻璃微探针拉制及其性状分析扫描用玻璃微 探针由P-2000/G型程控水平激光微电极拉制仪拉 制而成,拉制得到的玻璃微探针尖端内壁半 Fig 1-1Themo Scientific Forma CO incubator 2 径r为50 nm,向玻璃微探针内充灌电极内 液后通过商用膜片钳电阻测量软件测得该探针电阻为 150 MΩ 。Fig 1-2 P-2000 laser puller, SUTTER INSTRUMENT 本实验中所使用的玻璃微探针为硼硅酸盐微电极玻璃毛细管 外径:1.00 mm,内 径:0.59 mm,长度:90 mm,武汉滨川科学仪器有限公司,经 P-2000/G 型程控水平激军事医学科学院博士论文 20 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 光微电极拉制仪(Sutter Instrument,美国)拉制而成;拉制前需将微电极玻璃毛细管的 两端用火焰上烤一下,去除玻璃毛胚的毛刺,以避免玻璃微探针在安装过程中对 Ag/AgCl 电极的刮损。 将拉制好的玻璃微探针用导电胶带粘到载物铜台上,在 LEO1530VP 扫描电镜下直 接观测玻璃微探针的形状及尖端内、外径和内壁半角等性状。在获得高分辨率的玻璃微 探针针尖的侧视和俯视扫描电镜照片后,利用扫描电镜分析软件可测量出玻璃微探针针 尖的内半径ri、外半径ro及内壁半角θ,再通过玻璃微探针电阻计算公式: Rpipette1/πξritanθ(1)估算出该玻璃微探针在充灌电极内液后的电阻值。公式中:Rpipette 代表玻璃微探 针电阻,ξ 代表玻璃微探针内液的电导率,ri 代表玻璃微探针针尖的内半径,θ 代表玻璃 微探针针尖的内壁半角。如图 1-3,扫描电镜下得到的玻璃微探针成像显示探针针尖形 状对称,且探针尖端内半径为 27 nm,外半径为 60 nm。该玻璃微探针的内壁半角 θ2.7?, 采用玻璃微探针电阻计算公式估算,得到该玻璃微探针的电阻约为 130 MΩ。 A B AVertical view of pipette tip B. Side view of pipette tip Fig 1-3 Image of pipette by SEM 固定上述玻璃微探针的拉制参数,连续拉制多根具有相近针尖形状的玻璃微 探针用 于膜片钳电阻测量实验。将充灌电极内液 0.15 M KCI 的玻璃微探针由 SICM 操控玻 璃微探针浸入 PBS 缓冲溶液,通过商用膜片钳技术 美国 Axon Multiclamp 700B 及 Clamp 10.2 软件 测得探针电阻值为 137.6?24.7 MΩ n16,且数值稳定。试验中使用该玻璃微探针的拉制参数,探针电阻为 100-140 MΩ,尖端内半径 r 为 27-40 nm,该微探针充灌 L15培养基后通过商用膜片钳电阻测量软件测得的 b. 探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的仪器组成 军事医学科学院博士论文 21 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 根据 Novak[15]等的研究成果,本实验室在现有 SICM(ICnano SICM,Ionscope Ltd, 英国)基础上改进构建了新型的 HPICM,主要包括扫描头(Head SH01,Ionscope Ltd, 英国)及扫描控制软件的升级(如图 1-4)。扫描头置于 TiU倒置显微镜(Nikon,日本) 的载物台上,由一个 XY 向 100×100 ?m 的 PIHera纳米级平板压电陶瓷扫描台(Physik Instrumente,德国)和一个 Z向 25 ?m 的 LISA 高精度平板压电陶瓷(Physik Instrumente, 德国)组成。 通过采用 SBC6711DSP 主板的 ICnano SICM 控制组件 (Ionscope Ltd,英国) 操控带有探针的 Z 向平板压电 陶瓷的上下跳跃及载有生物样 品的纳米级平板压电陶瓷扫描 台的 XY 向移动,并以 20 kHz Fig1-4 Compose of HPICM system 的高速采样频率实时监测流入纳米尺度玻璃微探针的电流变化。利用 MultiClamp 700B 膜片钳放大器(Molecular Devices,美国)给 HPICM 的微探针提供+200 mV 的电压。 HPICM 不再采用传统 SICM 的连续负反馈扫描控制模式(见图 1-4),取而代之的是微 探针在生物样品表面以设定幅度 Z向上下跳跃的模式进行扫描。 c. 采用HPICM对filter细胞膜进行连续扫描成像 在本研究中,以 L15 培养基作为扫描活体细胞时的细胞浴液和电极内液,其中玻璃 微探针内充灌电极内液约 20 mm;在 filter上随机选取 50×50 ?m 区域内的活体细胞进行 扫描,视样品复杂程度的不同每幅扫描成像时间为 6-9 min;为更清晰的了解单个细胞 的形貌及其变化情况,在得到的 50×50 ?m 的成像范围内,利用扫描控制软件(Snicctrl) 中的 Zoom-in功能随机选取单个细胞进行 10×10 ?m或 15×15 ?m高分辨率的扫描成像, 每幅扫描成像时间为 4-6 min。用 HPICM 系统自带的图像处理软件 SICM Image Viewer (Ionscope Ltd,英国)对成像结果进行分析处理。本实验中的所有 HPICM 扫描成像的 分辨率均为 256×256,扫描实验均在室温(25?2 ?)条件下进行。 (3) 跨膜电阻测量 2 跨膜电位仪 EVOM 主要由 Endohm chambers 和 Edohm-24Snap 组成。首先将军事医学科学院博士论文 22 醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究 membrane filter insert 培养液换成 L 后 转移到 chamber,然后在 chamber和 filter 之间 15 也加入 L ,尽量使 chamber和 filter液面在同一水平,最后加上盖就可以测量了。膜片