原发性无精子症患者Y染色体AZF微缺失_17905

原发性无精子症患者Y染色体AZF微缺失_17905 原发性无精子症患者Y染色体AZF微缺失 [标签:来源] 作者:陈治全 由家惠 张海涛 【关键词】 原发性无精子症 Y染色体 AZF微缺失 原发性无精子症是指男性不育症患者仅有精子异常，即精液检查发现无精子，其余包括细胞遗传学、生殖内分泌激素水平等情况均正常，即患者出现精子异常的原因不明。从分子水平探讨生精障碍的机制，尤其是关于Y染色体长臂AZF微缺失的研究[1]，对男性原发性无精子症的诊断及治疗具有非常重要的意义，本文对24例原发性无精子症患者Y染色体AZF微缺失筛查，如下。 对象与方法 1.对象:2005年6月,2006年12月到本院不育治疗中心就诊的男性不育患者，年龄23,42岁，无泌尿生殖道感染，无特殊病史及家族史，连续3次精液检查未发现精子，生殖内分泌激素检测在正常范围内，并排除染色体数目与结构异常者纳入观察组，共24例;对照组40例样本均来自于精液正常男性。 2.AZF区域缺失检测方法:(1)基因组DNA提取。抽取研究对象外周血2.0 ml,EDTA抗凝，按常规()提取DNA。溶解后的DNA用紫外分光光度计测吸光度(260 nm)并计算DNA浓度。(2)引物。采用上海透景生命科技有限公司提供的Y6PCR检测试剂盒(Lot No 20070101)，按照试剂盒的每个样品均需做A组和B组两个多重PCR反应，A组包括Sy254(AZFc区)、sY127(AZFb)、sY86(AZFa)3个位点,B组包括Sy255(AZFc区)、sY134(AZFb)、sY84(AZFa)3个位点。另外，每组设置一对扩增SRY基因(位于Y染色体短臂上的性别决定基因)的引物作为内对照。(3)PCR扩增及电泳分析。每个标本检测需做A组和B组两个多重PCR反应，PCR反应体系组成为PCR预混液A或B10μl(含TaqDNA聚合酶)、引物混合液A或B9 μl、模板DNA1 μl(100 ng/μl)。PE9600基因扩增仪进行基因扩增，扩增温度及循环参数为95 ?预变性3 min，95 ? 30 s、59 ? 30 s、72 ? 30 s共35个循环，72 ?延伸10 min。选择正常男性DNA样品为阳性对照，正常女性DNA样品为阴性对照，灭菌蒸馏水为空白对照。PCR反应结束后取8 μl扩增物加入1.5 μl 6×上样缓冲液混匀后加样，Marker为100 bpDNA分子量标记，经3.0 %的琼脂糖凝胶电泳40 min后，KODAK1D凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。 3.实验结果判定标准:所有男性标本都应扩增出SRY内对照条带，若待测样品中无此条带，提示实验失败;若待测样品与正常对照相比，出现一个或多个STS条带丢失，即可判断为其对应的STS缺失。 结果 24例观察组样本中，共检测出AZF微缺失3例，缺失率12.50 %(3/24);其中单纯AZFc缺失2例，AZFc+AZFb缺失1例，单纯AZFc缺失率为8.33 %(3/24)，AZFb缺失率为4.17 %(1/24)。对照组40例样本均未检出AZF基因微缺失。 讨论 Y染色体长臂许多基因是与精子发生相关的基因，某些基因片段的丢失可造成生精障碍[2],提示Y染色体对性发育和精子发生都是必不可少的。对男性不育患者进行染色体核型研究中发现，原发性无精子症患者Y染色体长臂远端(Yq11)在显微镜下可见染色体断裂、缺失现象，因此，提出Y染色体长臂存在着与精子发生相关的基因并将其命名为无精子因子(AZF)。AZF分为AZFa、AZFb、AZFc3个区域，研究认为AZFa缺失较罕见[3],约占Y染色体微缺失的1 %,5 %,AZFa区域整段缺失通常导致唯支持细胞综合征，如果分子诊断为整段AZFa区域缺失，若想从睾丸中获得精子进行ICSI已不大可能。AZFb区域的基因缺失现为减数分裂后的生精上皮细胞缺乏，提示在减数分裂前或减数分裂中精子发生停滞，精子生成受阻在精母细胞阶段，原发性无精子症或严重少精子症患者中均可检测到AZFb缺失。不育症患者中最常见的Yq11微缺失是AZFc缺失。AZFc缺失患者的临床表现呈多样性，既可表现为无精子，也可表现为精子计数正常但伴有精子形态异常或精子生成减少。AZFc缺失约占Y染色体微缺失的60 %。由于AZFc区域的基因缺失要比AZFa和AZFb区域缺失更为常见，因此，AZFc区可作为原发性无精子症和严重少精子症患者的主要筛查原因[4]。 在我国，随着近年来男性原发不育就诊率的不断提高以及辅助生育规模的不断扩大，开展AZF基因缺失的检测显得尤为重要。本文选择的观察对象排除了泌尿生殖道感染、染色体数目与结构异常以及生殖内分泌激素紊乱等已明确的影响精子生成的因素，24例样本中，共检测出AZF微缺失3例，缺失率为12.5 %;其中单纯AZFc区域缺失2例，缺失率为8.33 %;AZFb区域缺失1例，缺失率为4.17 %。对照组40例样本未检出AZF基因微缺失。Y染色体AZF微缺失研究中，STS位点的选择及其代表性存在争议，缺乏统一标准。Van Landuyt等[5]认为尽管Y染色体AZF基因缺失的检测包括很多STS位点，但总有某些“热点”(缺失几率较高的碱基序列)的缺失，故提出一个简便、快速的筛查原则，即使用4个覆盖AZF各区的STS缺失“热点”引物并加用SRY或ZFX/Y为阳性对照PCR就可基本满足以常规筛查为目的的临床需要，但研究选用哪些STS位点最合适，尚需对较大样本的筛查结果进行分析才能确定。 虽然大多数原发性无精子症的Y染色体大体上是完整的，AZF缺失的个体也并非一概不育，但Y染色体AZF微缺失检查已逐渐发展成为诊断遗传性男性不育的重要技术手段。由于AZF基因缺失的个体不能像正常人那样发育，必须通过辅助生育技术如ICSI受孕，从而使引起精子发生障碍的基因缺陷如AZF缺失人为地遗传给男性后代[6],因此在对生精障碍的患者进行ICSI治疗之前有必要进行AZF缺失筛查,对存在缺失的患者,应向其说明产生具有相同缺失的男性后代的危险性。 【参考文献】 1Simoni M. Moiecular diagnosis of Y chromosome microdeletions in Europe:stateoftheart quality control[J].Hum Reprod,2001,16(3):402409. 2Foresta C,Moro E,Rossi A,et al.Role of the AZFa candidate genes in male infertility[J].J Endocrinao Invest,2000,23(10):646651. 3Ferlin A,Bettella A,Tessari A,et al.Analysis of the DAZ gene family in cryptorchidism and idiopathic male infertility [J].Fertil Steril,2003,81(4):1013 1018. 4Oates RD,Silber S,Brown LG,et al,Clinical charaterization of 42 oligospermia or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chro,osome,and of 18 children conceived via ICSI[J].Hum Reprod,2002(7):28132824. 5Van Landuyt L,Lissens W,Stouffs K,et al.Validation of a simple Yqdeletion screening progamme in an ICSI candidate population[J].MolHum Reprod,2000(6):291297. 6Cram DS,Ma K,Bhasin S ,et al .Y chromosome analysis Of infertile men and their sons conceivedthrough intractoplasmic sperm injection:vertical transmission of deletions and rarity of the de novo deletions[J].Fertil Steril,200(74):909915.