【doc】植物生长调节剂对多花黄精芽体外发生过程中性状的影响

【doc】植物生长调节剂对多花黄精芽体外发生过程中性状的影响 植物生长调节剂对多花黄精芽体外发生过 程中性状的影响 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第34卷第9期2003年9月?855? 植物生长调节剂对多花黄精芽体外发生过程中性状的影响 徐红梅,赵东利 (1.北京农学院编辑部,北京102206;2.大连大学医学院,辽宁大连116622) 摘要:目的研究不同植物生长调节剂组合对多花黄精芽体外发生过程中每块外植体上的平均芽数,叶片发生 频率,根的自然发生率及生根外植体上的平均根数,根茎发生率等性状的影响;探索通过组织培养快速繁殖该植物 的最佳途径.方法多花黄精的不定芽切块在MS+BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L的培养基上可被诱导产生颗 粒状愈伤组织,将该愈伤组织继代于不同植物生长调节剂组合的MS培养基上,2个月后观察并统计不同植物生长 调节剂组合对各性状的影响.结果TDZ1.5mg/L+2,4-D1.0mg/L对芽增值最有利,平均每块外植体上可长出 8.6个芽;BA1.O,2.0mg/L+NAA1.O,2.0mg/L促进叶片形成,95以上的外植体长出形态正常的叶片;在 BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L的培养基上,根的自然发生率最高,达到51.9,但不及单独生长素如NAA,IAA, IBA或2,4-D等以0.5,1.0mg/L对根的诱导作用,后者可使9O以上的再生芽生根,且根生长繁茂;BA2.0 mg/L+2,4-D1.O,2.0mg/L组合最适合根茎生长,直径大于0.5cm的根状茎超过100.结论多花黄精的体 外快速繁殖可通过如下途径实现:TDZ1.5mg/L+2,4-D1.0mg/L诱导不定芽扩增,BA1.O,2.0mg/L+NAA 1.O,2.0mg/L诱导健康叶片的发育,1/2MS+NAA,IAA,IBA或2,4-D0.5,1.0mg/L 诱导再生芽生根;BA 2.0mg/L+2,4-D1.O,2.0mg/L用于以繁殖药用器官为目的的根茎的生长. 关键词:多花黄精;组织培养;芽诱导;根状茎;植物生长调节剂 中圈分类号:R282.21文献标识码:A文章编号:0253—2670(2003)09—0855—04 Effectofplantgrowthregulatorsonseveralcharacteristicsduringinvitro budregenerationofPolygonatumcyrtonema XUHong—mei,ZHAODong—li (1.EditorialOfficeofJournal,BeijingAgriculturalCollege,Beijing102206,China; 2.MedicalCollegeofDalianUniversity,Dalian,116622,China) Abstract:ObjectTostudytheeffectsofplantgrowthregulators(PGR)withvariouscombinations onseveralcharacteristicsincludingnumbersofperexplant,productionfrequenciesofleaves,abiogenesis ofrootandrhizomeduringinvitrobudregenerationprocessofPolygonatumcyrtonemaHuasoastosearch fortheoptimuminvitroregenerationprocessforP.cyrtonema.MethodsGranularcalliwereinducedon MS+BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/LbybudexplantcuttingsofP.cyrtonema.Thecalliwereinoculated intoMSmediawithvariouscombinedPGR.Thecharacteristicsdescribedabovewereobservedandtheef— fectsofvariouscombinedPGRweneobtainedbystatisticsintwomonths.ResultsAmongvariouscom- binedPGR,TDZ1.5mg/L+2,4-D1.0mg/Lshowedthebesteffectfortheproliferationofbuds,BA 1.O一2.0mg/L+NAA1.0— 2.0mg/Lforimprovingofleavedevelopment,BA2.0mg/L+NAA1.0 mg/LforrootproductionandBA2.0mg/L+2,4一D1.O一 2.0mg/Lforrhizomegrowth.Thenumberof budsperexplantwasupto8.6inaverage,andtheproductionratesofleaves,root,andrhizomeo ver0.5 cmindiameterwereupto95,51.9%andexceeding100%,respectively.However,themediumcon— tainingonlyauxinsuchasNAA,IAA,IBAor2,4-Dwith0.5— 1.omg/Lismuchbetterforrootindue— tionofnewbudsthantheoriginalmediawithBA2.0mg/L+NAA1.0mg/Lonwhichtheexplantscan naturallyroot.ConclusionTheinvitroregenerationprocessofP.cyrtonemacanbeachievedbythefol— lowingsteps:Firstly,proliferationofbudscanberealizedonmediumwithTDZ1.5mg/L+2,4-D1.0 mg/L.Then.normalleavescanbedevelopedafterthenewbudshavebeentransferredtomediumwithBA 1.O一2.0mg/L+NAA1.O一 2.0mg/L.Finally,vigorousrootscanbeformedfromregeneratedbudson 收藕日期:2002—11—09 作者?介:徐红梅(1968一),女,硕士,讲师.Tel:(010)80799078E— mail:bnxb@chinajourna1.net.ca ?856?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第34卷第9期2003年9月 1/2MSmediumwith+NAA,IAA,IBAor2,4-D0.5--1.0mg/L.MediumwithBA2.0mg/L+2,4一D 1.O一 2.0mg/LcanbespeciallyappliedtOimprovingthegrowthofrhizomes,themedicinalpartofP.cr_ tonema. Keywords:Po&gonatumcyrtonemaHua;tissueculture;budinduction;rhizome;plantgrowthregu— lators(PGR) 多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua系百合 科黄精属药用植物,其根茎作中药黄精用,含多糖, 氨基酸,葸醌类化合物等成分,具有抗菌,降压,抗衰 老及治疗风湿痛等作用[1].在我国南方的一些地区 有栽培.其繁殖方式主要依靠根茎的无性生殖,繁殖 系数低,无法提供大量种源,因而扩大面积种植受到 限制.另外长期依靠无性生殖易造成种质性状退化. 目前,改良植物种质性状的方法主要有有性杂交及 基因工程手段.而实现这一目的同样需要有大量的 种源供应.实践证明,组织培养是一种十分有效的快 速繁殖手段,其应用技术也较为成熟.应用该方法, 可在短期内得到大量的种苗.而且,在组织培养过程 中,可能产生多倍体的变异,由此也为创造优良新品 种开辟了一条途径.目前,已建立了众多经济植物的 商品化大规模栽培基地,均依靠组织培养实现了快 速繁殖.关于多花黄精的组织培养,未见类似报道. 用2,4一D及BA两种植物生长调节剂即可实现其芽 的体外再生,IAA,IBA,NAA及2,4一D中任一生长 调节剂均可诱导新芽生根.在诱导其再生过程中,发 现外植体在MS+BA0.5mg/L+2,4一D1.0mg/L 的培养基上不仅能产生芽,也能形成根状茎结构,并 可自然生根,为此,进一步研究了多种激素组合对其 再生芽,根状茎及根的形成的影响. 1材料与方法 1.1材料:将多花黄精根茎萌发形成的不定芽横切 成约2mm厚的小片接种于MS+BA1.0mg/L+ 2,4一D0.5mg/L的培养基上,(26?1)?,每天光 照16h,光强24lx条件下培养约2个月,在外植体 切口及周缘产生较多的颗粒状愈伤组织,本实验以 该愈伤组织为外植体,将其分成直径约3mm的小 团,接种于不同植物生长调节剂组合(BA,TDZ,2, 4一D及NAA)的MS培养基(1)上,MS培养基中 另含3蔗糖,0.6的琼脂. 1.2方法:培养基pH值调至5.8,15Pa(121?) 灭菌15min(电热手提高压蒸汽消毒器,YXQ.SG 41.280,上海医用核子仪器厂).每瓶接种15块左右 外植体,每处理接种3瓶.在(26?1)?,每天光照 16h,光强24lx条件下培养.2个月后统计每组处 理的如下性状:每块外植体上芽长超过0.5mm的 平均芽数,长出叶片的外植体的百分率,外植体自然 生根率,生根外植体的平均根数,直径大于0.5cm 根茎发生频率(直径大于0.5cm的根茎数/外植体 数×100). 2结果与分析 表1不同植物生长调节剂组合对多花黄精芽增殖,叶片发生,生根及根茎形成的影响(士s) Table1EffectsofvariouscombinedPGRonbadproliferation,formation ofleaves.rootandrhizomeofP.cyrtonema(士s) 每处理3个重复,每个重复含有15块左右外植体;每一纵栏中的数据标以相同字母者表示差异不显着(P<O.O5);*高度超过0?5mm的 芽列入统计范围;?直径大于0.5am的根茎列入统计范围. Threerepeatedexperimentswithabout15explantsperreplica;meansfollowedbysameletter ineachcolumnarenotsignificantlydiffer— ence(P<O.05)accordingtoDuncan'sMultipleRangeTest;*theheightofbudover0.5mmi slistedabove;?thediameterofrhizomeover 0.5amislistedabove 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第34卷第9期2003年9月?857? 2.1不同植物生长调节剂组合对多花黄精芽发生 过程中几种性状的影响:本实验采用的任一培养基 均可诱导芽的再生.颗粒状愈伤组织接种于表1所 列培养基中后,逐渐增殖,形成颗粒团,大约40d 后,可见到颗粒表面产生不定芽突起(图1—1),之后 叶片会逐步在芽的两侧发育形成(图1—2),偶尔也 会有叶片直接从颗粒表面产生.同时,颗粒状结构本 身也逐步长大,并且变得形状不规则,继而发育成根 状茎结构(图1—2).除了TDZ与2,4一D组合的培养 基外,均可看到少量根在外植体的表面或再生芽的 基部周围自然发生(图1—2).即本实验采用的其他 培养基均可同时诱导芽,根茎及根的发生. 可能为根茎类植物的原因,多花黄精的再生芽 的发育要慢于其他的一些草本类植物,故在培养2 个月后进行各性状的统计. 根据表1结果显示,TDZ1.5mg/L+2,4一D 1.0mg/L的培养基最适合芽的增殖,每个外植体上 的平均芽数达到8.6个,显着高于其他类激素组合, 而BA与2,4一D的组合则远不如此,最高也只有5.2 个芽/外植体.显然,TDZ对芽数的增殖起主要作 用.在BA1.0,2.0mg/L+NAA1.0,2.0mg/L 及TDZ1.5mg/L与2,4一D1.0mg/L或NAA1.0 mg/L组合的培养基上,84以上的芽产生了叶片, 且4个处理之间无统计学上的差异,因此单从叶片 发生频率来看,BA与NAA组合及TDZ与2,4一D 或NAA组合较适合于叶片的发育.对根的发生而 言,BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L的植物生长调 节剂组合是最佳的,51.9的外植体生了根,但根数 并不理想,平均为2.0条,不及NAA,IBA等生长素 的诱导效果,后者可使90以上的再生芽生根,且 根生长繁茂,数量多(图1—3).BA2.0mg/L+2,4一 D1.0,2.0mg/L的组合对根茎再生及生长是最佳 的,再生出的直径大于0.5cm的根状茎数量超过了 接种的外植体数,这对于以根茎为药用部位的中药 材来说,无疑为实现工厂化试管内直接繁殖其药用 器官创造了一条途径. 2.2不同植物生长调节剂组合对芽形态发育的影 (表1),如果允许芽进一 响:在含TDZ的培养基上 步发育长大,则会看到变态叶的形成,叶片较厚,不 规则弯曲(图1—4),而以BA为细胞分裂素的培养基 上,叶片形态是正常的(图1—2,3),因而,尽管在叶 片发生频率上,TDZ加NAA或2,4一D的组合与 BA加NAA的组合没有统计学上的显着性差异,但 这里,显然前者不适合用于诱导叶片正常生长. 1一颗粒状愈伤组织增殖后形成的颗粒团,部分颗粒的表面已经 分化出不定芽(箭头).来自于TDZ1.5mg/L+2,4一D1.0mg/ L培养40d的材料.Bar=0.36cm;2-芽进一步发育产生叶片 (大箭头),颗粒状组织本身发育形成根状茎结构(短箭头),根可 直接在根状茎结构表面发生(小箭头).在BA2.0g/L+NAA 1.0mg/L的培养基上培养60d的材料.Bar=0.39cm;3-在BA 1.0mg/L+NAA2.0mg/L的培养基上培养60d后,形成了叶 片及根茎(箭头),将该发育完好的小植株转移刭含有生长素 (NAA1.0mg/L)的1/2MS培养基上培养30d后,长出多条 根.Bar=2.25cm;4-在TDZ1.5mg/L+NAA1.0mg/L的培 养基上培养50d后,芽进一步发育产生变态叶(箭头).Bar= 0.47cm 1-granularclusterwasproducedfromtheoriginalgranularcal— lusasitsproliferationonfreshmedium,andbudsweredifferen— tiatedfromthesurfaceofsomegranules(arrows)after40days incultureonmediumwithTDZ1.5mg/L+2,4-D1.0mg/L. Bar一0.36cm2-youngleavesdevelopedfromnewbud(bigar— row),andrhizome—likestructureformedfromexplantsasfor theseexplants'furthergrowth(shortarrow)onmediumsup— plementedwithBA2.0g/L+NAA1.0mg/L,andafewroot naturallyproducedonthesurfaceoftherhizome(smallarrow) after60daysinculture.Bar一0.39cm3-plantletwithwell— developedleavesandrhizome(arrow),frommediumwithBA 1.0mg/L+NAA2.0mg/Lafter60daysinculture,rootedon 1[2MSmediumcontainingNAA1.0mg/Laftertransferred30 days.Bar一2.25cm4-teramorphousleavesdevelopedfrom budsmaintainedonmediumwithTDZ1.5mg/L+NAA1.0 mg/Lafter50daysinculture(arrow).Bar=0.47cm 圈1来源于多花黄精不定芽外檀体的再生苗形成过程 Fig.1Plantletsregenerationfromadventitious budsexplantsofP.cyrtonemainvitro 3讨论 本实验结果表明诱导各器官发生的最佳培养基 组合是不同的,说明不同器官的发生对同一植物生 长调节剂的反应是不同的.这也正如郝玉蓉等在研 究百合科另一药用植物伊贝母及孙敬三等研究浙贝 母的组织培养中得到的结果一样,即器官发生与植 物生长调节剂的种类及浓度都有关系,适合于芽分 '858'中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第34卷第9期2003年9月 化及增殖的植物生长调节剂组合,在诱导根形成时, 往往需要改变其种类或浓度,才能得到最佳效果. 多花黄精的再生过程中,首先在外植体上形成 一 些球形颗粒,之后在这些球形颗粒上再分化出芽, 属于器官发生途径.该过程在番红花,百合,伊贝母 及浙贝母等球茎类的植物中也存在D].这一类植 物在用鳞茎瓣作为外植体时,再生芽既可直接在外 植体的边缘或中央形成,也可由外植体脱分化形成 的愈伤组织进一步分化而来,在后一条件下,先在愈 伤组织上形成小颗粒,而后再由这些小颗粒分化出 芽.另外,在这一类植物中还存在体胚发生途径,如 王仑山等用伊贝母的鳞瓣作为外植体,在MS+ NAAI.0mg/L+KtO.5mg/L及NAA1.0 mg/L+BA2.0mg/L的培养基上诱导产生了体 胚;徐元红等同样以伊贝母的鳞瓣为外植体在 MS+2,4一D1.0mg/L+Kt0.1mg/L的培养基上 诱导产生了愈伤组织,之后转移到MS+2,4一D0.5 mg/L+BA0.2mg/L的培养基上诱导产生了体 胚;有时器官发生途径和体胚发生途径可以同时共 存.如刘明志等以百合鳞片为外植体,在MS+2,4一 D的培养基上诱导产生了体胚,而在MS培养基中 添加BA时可直接形成芽(属器官发生途径),若同 时既添加BA,又添加2,4一D,则既可产生不定芽又 能同时形成体胚.依靠组织培养快速繁殖,可使繁殖 系数成千上万倍地提高,对于繁殖一些经济类植物 来说,无疑带来了巨大的优势. TDZ是具有很强细胞分裂素活性的人工合成 激素,经多种植物组织培养实验表明,对愈伤组织发 生,离体芽增殖及再生有显着的促进作用,但对植物 生根有抑制作用[8].本实验表明,TDZ对多花黄精 芽的增殖优于BA的效果,但对芽的进一步生长不 利,导致畸形叶片的产生,同时也抑制芽生根.因而 可将TDZ1.5mg/L+2,4-D1.0mg/L的培养基 专用于芽或其前体——颗粒愈伤组织的增殖,在芽 未分化形成之前,即将其分割继代,通常以30d为 一 个周期,这样可保证用于芽诱导的充足的外植体 供应.若欲诱导小植株再生,则可待芽从颗粒表面分 化出来后,及时将带芽的颗粒组织剥离下来转移到 BA1.0,2.0mg/L+NAA1.0,2.0mg/L的培养 基上,继续培养,诱导叶片的健康发育. 尽管在部分原始培养基上,外植体可直接生根, 但由于根数较少,不利于后期再生苗的驯化培养,因 而有必要将再生芽转移到含生长素的根诱导培养基 上加速根的发生,1/2MS+NAA,IAA,IBA或2, 4一D0.5,1.0mg/L均适合根的诱导. 综上所述,多花黄精组织培养快速繁殖途径可 为如下步骤: (1)原植物根茎不定芽切片在BA1.0mg/L+ 2,4一D0.5mg/L培养基上可被诱导形成颗粒状愈 伤组织;(2)该颗粒状愈伤组织转移到TDZ1.5 mg/L+2,4一D1.0mg/L的培养基上可被诱导芽的 分化和自身的增殖;(3)将芽及其连带组织剥离转移 到BA1.0,2.0mg/L+NAA1.0,2.0mg/L的 培养基上,诱导叶片发生;(4)将形成叶片的小植株 转移到1/2MS+NAA,IAA,IBA或2,4一D0.5, 1.0mg/L的培养基上诱导生根.通过上述4个步 骤,可获得来源于多花黄精不定芽外植体的试管苗. 若以繁殖药用器官——根茎为目的,可将上述 1)中形成的颗粒愈伤组织转移到BA2.0mg/L+ ( 2,4一D1.0,2.0mg/L的培养基上诱导根茎增殖与 生长. 在植物的愈伤组织或再生器官中往往含有天然 植物中的有效成分,因而依靠该方法来生产一些药 用成分,色素,香料等植物次生代谢物似乎已经成为 一 种趋势.由于该方法还具有不受原植物产量,产地 及气候等因素影响的优点,因而可做到人工控制.目 前已经在部分植物中实现了工厂化大规模生产,如 人参皂苷,紫草宁,青蒿素的生产等[g].随着该技术 的日益成熟,有望在更多的植物中实现其有效成分 的工厂化生产,从而完全摆脱天然植物的限制,也使 生态环境得以保护. 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