新型去甲万古霉素纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究

新型去甲万古霉素纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究 南方医科大学2007级硕士学位论文 新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究 ―一 一 ?…l OUa Research new-typenorvancomycln―Ilbrmglue ―calcium bonesubstitute phosphate 课题来源: 院长基金项目 专 业 名 称 骨外科学 学位申请人 张 飞 指 导 教 师 李奇教授 答辩委员会主席 钟世镇院士 答辩委员会成员 徐达传 廖威明 蔡道章 查振刚 尹庆水 李松建 论文评阅人 徐达传 郑召民 白 波 201 0年6月5日广州 IIII I I III IIIII I illl Y1 硕士学位论文 新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙 人工骨研究 硕士研究生:张飞 导师:李奇 摘要 研究背景:近年严重车祸伤、工作及高坠伤等高能量创伤发生率大大增加。 其导致的严重开放性骨折脱位和软组织损伤发生率也相应增加，因伤者伤口污染 与细菌残留引起的感染是骨科面临的一大难题，研制一种既能有效的填充骨缺 损，又具有局部抗感染能力的生物材料。该生物材料应具有良好的生物相容性， 可在体内自然降解，早期利于骨长入，并且还应至少具有松质骨以上机械强度等 特点，本课题所研究的新型材料可能具备上述两种功能，是治疗感染性骨缺 损的 理想方法。 目的与意义:通过对新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特 点、急性细胞毒性、抗溃散抗冲涮性及其内去甲万古霉素的体外释放规律研究， 为探索研制既具有局部骨填充作用，又具有抗感染能力的新型生物材料提供相 关实验依据。 实验方法: 1(新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究 在人工骨固相粉末 B一磷酸三钙和磷酸二氢钙按3:1配比 中加入适量 去甲万古霉素 norvancomycin下称NV 粉末，充分研磨混合，按固液比为lg: 0(4ml加入500mol,L柠檬酸溶液，充分混均，同时以双腔推液器将预先配制 好的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液以相同体积推至上述人工骨膏体中，即制得 含Nv质量分数为4,的新型复合磷酸钙人工骨 对照组材料仅以B一磷酸三钙 和磷酸二氢钙混合粉末1g:0(4ml与柠檬酸溶液混均 。分别将适量上述两种 人工骨膏体充分混匀，填入内经6mm、高12mm的模具中，用水泥稠度凝结测定 中文摘要 仪进行凝结时间的测试，以单针进入至1,2材料试样高度为限作为初凝时间， 并以进入试样深度兰0(5mm为终凝时间。另取上述两组人工骨膏体填入内经为 6mm，高18ram的钢模中，成形后即脱模并置于恒温恒湿箱中充分水化4周， 抛光试样两端后以电子式万能材料试验机测试其抗压强度，以上固化时间、固 化强度测试每组材料均重复6次。另取少许样本做X一线衍射检测其固化产物及 扫描电镜观察，同时以排水法测试两组材料的的孔隙率。 测得数据均经SPSSl3(0软件包处理，并做两独立样本t检验其是否有差异。 2(去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性细胞毒性和抗冲涮性能研究 ?急性细胞毒性试验:取适量按以上实验方法制得的两组人工骨材料试件， 经钴-60 Y射线照射灭菌后按309,L投于一定量DMEM,F12基础培养液内浸提 72h，去除试件并滤除浸提液内沉渣部分，按预定比例往浸提液内加入一定量胎 牛血清，分别配成含10,胎牛血清的全培养液备用。另以普通正常DMEM,F12基 础培养基配成10,胎牛血清的全培养液进行对比，每组设三个重复组。 经颈椎脱臼法处死SD大鼠后在无菌条件下取其双侧股、胫骨骨髓液，并分 别以上述制成的三组全细胞培养液冲洗骨髓腔，以全骨髓培养法培养贴壁细胞 主要为骨髓间充质干细胞 ，光学显微镜下观察待细胞融合至约85,一90,时 以细胞计数板计数各组培养瓶内细胞数量级，并观察各时期细胞的形态变化， 以此作为材料对细胞的急性毒性的初步评价指标。 ?材料的抗溃散性及抗冲涮性研究:用传统的浸泡法及模拟术中松质骨持续 渗血两种方法测试材料的抗溃散性及抗冲涮性，后者作为一种改良测试材料的抗 冲涮性方法，是骨水泥浆体注射后给予一定的动态冲涮力，并以达到终凝后剩余 质量 m1 与初始质量 m2 的比值作为衡量其抗冲涮性能的指标，每组材料重 复3次取均值。同时观察材料的表面形态和粗糙程度。 3(去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨中抗菌素的体外释放特点研究 将标准NV溶液配成200mg,L，lOOmg,L，50mg,L，25mg,L，12(5mg ,L，6(25mg,L 浓度梯度，以紫外分光光度计在室内温度条件下对200-800hm波长范围进行扫 II 一洁净试管中，重新注入等量生理盐水继续浸提，依次类推直至浸提液内抗菌 素浓度接近零，实验结束。 根据上述得出的标准回归方程，计算出两组材料试件中抗菌素释放量与时 间的关系。测量随时间 d 变化，两组材料浸提液0D值、去甲万古霉素药液 浓度x mg,L 及抗菌素累计释放量占总药量百分比P , 变化情况，用SPSSl3(0 软件包作浸提天数 d 对每日浸提液0D值的分群金字塔图。 实验结果: 1(新型复合材料的理学特点: 新型NV-FG-CPC材料的初凝、终凝时间均较单纯CPC组明显短缩，分别缩 短1(08min和3(28min。随着FG及NV的掺入，新型人工骨的抗压强度明显下降， 高4个百分点，新型材料的主要固化产物仍为磷酸钙，扫描电镜观察可见FG将 u CPC晶体连接成片，且可见散在分布的，与背景颗粒不甚一致，大小约为3―6 m的抗菌素颗粒。 2(材料的急性细胞毒性，抗溃散及抗冲涮性结果: 各组培养瓶内原代细胞生长良好，培养约第14d三瓶细胞达到85,一90,融 合率，此时各组培养瓶内细胞形态较一致，状态良好，大部分呈长梭形或短梭 形，且三组细胞数目数量级均达106,L。单纯CPC组于生理盐水溶液内24h后即可 见周围被云雾状带包绕，而N1『一FG―CPC组周围未见此现象发生，仅见少量脱落的 水泥小粒。3次重复实验NV-FG-CPC组见玻管内仍剩余大量骨水泥块，初始质量 水泥表面较光滑，周围未见明显水泥小粒。而CPC组玻管内剩余的骨水泥量明显 III 中文摘要 减少，冲涮面骨水泥粗糙不平，且见容器内大量被冲散的骨水泥小粒，以同样 o,,0。利用改良抗冲涮实验测得 方法算得其m2 O(8409，ml O(5679，ml,m2 67(5 新型材料在动态状状下具有较更强的抗冲涮能力，结果与传统方法测得其抗溃 散性一致。 3(新型材料中去甲万古霉素的体外释放规律: 标准NV溶液在室内25?条件下于226nm波长处出现最大吸收峰，生理盐水 值随其浓度变化趋势可以上述方程表示 。 新型材料中去甲万霉素跟传统载药体系类似，先产生一次暴发性释放过程， 释放抗菌素的高峰期，时间约达8d，而CPC体系内药液浓度呈持续下降趋势。新 型材料组中去甲万古霉素可维持释放时间至少达6周以上，而对照组大约在第4 周时药液浓度急剧降至最低抗菌浓度以下， 两组材料内去甲万古霉素总释放量 分别在第30d、第15d达到总含量的90,以上。 主要结论: 1(新研制的去甲万霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨具有良好的理学特性，其自 固化时间及固化后的抗压强度均达人工骨的临床应用要求，具有较强的可操 作性。新型材料固化后的主要产物仍为磷酸钙，且随着纤维蛋白胶的加入孔 隙率有所提高，新型复合材料在电镜下可见抗菌素颗粒，表明去甲万古霉素 颗粒成功复合到材料中。 2(在传统型磷酸钙人工骨中同时复合去甲万古霉素、纤维蛋白胶后并未产生新 的有毒物质，材料的急性细胞毒性实验显示其生物安全性良好，同时具备较 强的抗冲涮性能。 3(新研发的磷酸钙缓释系统中随着纤维蛋白胶的掺入，其持续释放时间明显延 长，至少可达6周以上，较传统CPC组明显延长，且去甲万古霉素在浸提液中 可维持足够的抑菌浓度。 IV 硕士学位论文 关键词:去甲万古霉素纤维蛋白胶磷酸钙生物材料 V isa issuein contaminationandbacteriaresidue Infectioncausedwound big by clinical is forUSto akindof materialwhich orthopedics(Iturgent develop biological area( not finbonedefect alsoCanresistinfectionforacertain can only effectively,but have andcanbe Thiskindof materialshould biocompatibility biological good inthe the shouldbebeneficialtobone body(Atearlystage，it degradednaturally thancancellousbone(This havethemechanicalbeaer should strength growth(It amaterialwiththeabove is aimsto characteristics， which dissertationdevelop solvethe to problem( expected aimsto and dissertation experimental significance:This provide Purpose not Canbefilledinto evidenceto anew material，whichonly bone， biological develop ofanew function(Itstudiesthe characteristics butalsohasanti(infective physical calcium bone named substitute， artificialbone norvancomycin-fibringlue phosphate andanti-rinseandtheextraneous acutecellular ability toxicitiy，anti―collapsibility lawof inthenewmaterial( releasingnovrancaomycin Methods: Experimental ABSTRACT of on characteristicsofthenewbonesubstitute 1，Research physical Norvancomycin--fibringlue??-calciumphosphate wasobtainedthe Thenew bonesubstitute composite by followingsteps(Add as certainamountof referred theartificialbone NV into norvancomycin hereinafter solid wasmadearatioof3to1 between by 13-tricalcium phasepowder,which calciumandmonocalcium these phosphate phosphate。Thenfullygrind elements(By mmol,Lcitric intothe a ratioof1 500 acidsolution solid―liquid g:0(4ml，added mixtureand mixedit(Atthesame double accumulators， fully time，by cavitypushing both solutionandthrombinsolutionintotheartificialbone pushedfibrinogen paste， whichwereofthesame control ofmaterialswere volume( Incontrast，the groups and ataratioof made monocalcium bymixingonly13-calciumphosphate phosphateo l andthen themixtrue、vithcitricacidsolution(1 g:0(4ml againmixing Took amountoftheabovetwokindsofartificialbone appropriate pasteseparately and mixedthem(Thenthemixtureintoa of6mminternaldiameter fully put tooling and12mm the timeofthem cement setting byusing height(Tested separately initial timewastestedwhenthe condensationtester(The consistency setting enteredthe at1,2 ofthe materialandthefinal single-needlepositionheight sample timewastestedwhenthe enteredintothematerial兰 O(5mm( setting single-needle certainamountoftheabovetwokindsofartificialbone and Stilltookanother paste astandardsteel of6mminternaldiameterand18mm them into put separately tooling themtook the and themintoaconstant height(After shape，removedtoolingput chamberfor4weeksforthe of humidity fullyhydration(After temperature purpose testonthetwoendsofthe the materials，did polishing sample comprehensive test electronicuniversalmaterial the machine(Next，did strengthby testing curing timeand testsoneach ofmaterialsforsixtimes(In strength addition, curing group tookafew materialstodo diffractiontestand electron sample X-ray scanning 硕士学位论文 test(Atthesame the ofthetwomaterials time，testedporosity by microscope drainage method(Allthedata were SPSS13(0 findout fromtests analyzedby to whetherthere two of weredifferencesbetweentheabove materails t-test( groups bydoing ontheacutecellular andanti―rinseofthe 2，Research toxicity，anti-collapsibility materials test:Took the ?acutecellular amountof twokindsof toxicity appropriate artificial abovemethods(After bone madethe sterilizationwith samplesby 60Co??Y onthe3 certainamountofDMEM, F12basalculturemedium rays，based 09,L，put intothe andextractedthematerialsfor72hours(Removedthe from samples samples thesolutionandfilteredthe certainamountfetal serum dregs(Added of bovine to ratiointothe the extractionsolutionandmadefullculture accordingpredetermined serum medium 10,fetalbovine foruse(Forthe of containing ready purpose anotherfullculturemedium 10,fetalbovineserum comparison，made containing by normalDMEM,F12(Each setthree test using sample repeatedgroups( bilateralfemoralandtibialbonemarrowfluidoftheSD Gotthe ratundersterile killed Was cervicaldislocation(Thenwashedthemarrow condition，which by cavity three offullcellulaculturemediumwhichweremade separatelybyusing groups by theabove adhere were stem methods(Next，culturedcells mainlyMesenchymalcells fullmarrowmethod(Whenthecellswere by fusedto 85, -90,， approximately cellsnumberrateineach countedthe culturemediumbasedoncells countingplate andobserved ofthecellsatdifferent with morphology growthstages optical outcomeswereconsideredasthe evaluationofacute microscope(The preliminary effectofmaterialsoncells( toxicity onthe material: Testedthe ?Research andanti-rinseofthe anti-collapsibility and anti??-rinseofthematerial thetraditionalmethodof anti??-collapsibility bYusing immersionandthemethodof the cancellous simulating situation，which operation ABSTRACT bonewas an testthe laterWas methodto improved continuouslybleeding(The testing to a anti―rinsecharacteristicsof was certain materials，whichgive dynamicpressure whenthebonecement was measuredtheanti―rinsearatio paste injected(It by between final andinitial remaining coagulation weight m1 after weight rn2 (Each materialsWas andmeanwhilethe and of testedthreetimes surface group morphology wereobserved( roughness 3(Researchontheextraneouscharacteristicsofantibioticsinvitroofthe releasing new bonesubstitute norvancomycin??-fibrinphosphate glue--calcium MadethestandardNVsolutionintoaseriesconcentrationof gradient200mg, L， the room lOOmg,L，50mg,L，25mg,L，12(5mg,L，6(25mg,L(Undertemperature， to scannedthewaves from200nm800nmultraviolet ranging by andtookthe ofthe asdetection anddid wavelengthhighestpeal wave wavelength ODvaluein solutionofaseriesconcentration experiments(TestedNorvancomycin thedatawere SPSS13(0tocalculateitsstandard gradient(All analyzedby regression amountofthetwo ofmaterialstoextract equation(Tookappropriate groups inO(9, normalsaline(Thenextractedthefullextractionsolution continuously by forODvaluetest(TheinitiallOd sentto value 24 clean was OD test syringes every hours extraction(then5d timewassenttoODvaluetest(Removedthe during every material and itintoaclean itwithnormalsalineofthe sampleput tube(Re-injected sameamountforextraction the severaltimesuntilthe again(Repeatedprocess oftheextractionsolution tozero(then antibioticconcentration Was the approximate Wasover( experiment tothestandard derivedfromabove According regressionequation tests， analyzed antibiotic and ofthetwo the between time of relationship releasingquantity groups theOD materials(As valueofthetwo of time d changes，measuredgroupsmaterials， concentration the ofthe x mg,L ofvancomycinliquid，andchangespercentageP , 1 than control FGandNVareintroduced final time the respectively(As setting group bonedecrease 4 into ofthenewartificial it，compressivestrength significantly(After ale6(434-1(09 weeksof oftheNV-FG―CPC strength group hydration，compressive CPC 14(72 test Mpa,whilegroup 4-3(38Mpa statisticalt 5(710，P O(01 (The oneis4 thanthelatter(Themain oftheformer pointhigher product porosity percent is calcium electron ofthenewmaterialafter still microscopy,it setting phosphate(By isobservedthatFGconnectedtheCPC addition， antibiotic crystalstogether(In in beseenscatteredonthe and ale size，can they 3-6?n background particles，about fromthe different backgroundparticles quite acutecellular andanti―rinseofthenewmaterial of 2，Outcome toxicity in culturecells wellineachbottleofculture(After14 cells Primary grew days，the ineachbottlewere ofculturecametobeof85―90,fusionrate(Cells thethreebottles ofsimilar were orshort shape，whichmostlyelongatedspindle―shapedspindle―shaped( werein conditionandtheordersof ofallthethree Allthecells good magnitude Was 106,L(After24 insalinesolution reached hours，theCPC groups purely group havethis surrounded NV-FG―CPCdidn’t fog r byfog―likethings，while group buttherewere smallamountofcement fell off(Repeated phenomenon only particles threetimesanditisseenthatthe tubeoftheNV-FG―CPC the group experiments glass numberof whichthe initial stillremaineda bonecement large blocks，of average andthe final were and and weight averagesettingweight0(90390(759respectively V ABSTRACT residuem1, m2was83(1,(Therinsedsurfaceofbonecementwassmoothandthere wasnot cement aroundit(In bonecementremainedinthe any particles contrast，the rinsed bone tubeofCPC decreased surfaceofthe glass group significantly(The cementWas andtherewerebonecement whichwererinsedto rough particles spread inthe thesame werem2 method，outcomes container(Bycalculating O(8409，ml andml,m267(5,(The anti??rinse showsthatthenew 0(5679 improved experiment materialhasamoreanti―rinse ina condition(Theoutcomeisthe abilitydynamic samewiththeoutcomeof obtainedtraditionalmethod( by testing anti―collapsibility extraneouslaw invitroofthenewmaterials: 3，The ofnorvancomycin releasing Underroomconditionof NVsolutionhasaimum 25。C，standard absorption ata of226nm(The betweenODvalueand peak wavelength relationship concentrationofthestandardNVsolutionCanbedescribedaS"OD x mg,L1 O(013x+0(173 R2 0(971，adjustingRE 0(964，F 133(58，P 0(00 ( Thecharacteristicsof inthenewmaterialaresimilartotraditional norvancomycin material(Bothhaveanoutbreakof at lastfor4 for first，which releasingprocess day the thenewmaterialand6 for traditionalmaterial the days respectively(Then NV-FG-CPC anintervalof2 a of system，after days，haspeak lastsforabout concentrationof antibiotics，which 8days(Bycomparison，the liquid material releaSe CPC decreased time group continuously(NewgroupNorvancomycin be 6 the canmaintainedforatleast ismuch than control weeks，which longer group( Atthe4th concentrationofthecontrol tobe week，liquid droppedsharply group belowthelowestconcentrationof total much antibiotic(The requirement releaSing inthenew amountof materialreaches90, overthetotalamountat norvancomycin the30th whilethecontrolatthe15th days group day conclusions: MajOr new bonesubstitutehas DThe norvancomycin-??fibringlue????calciumphosphate good Vl toit(Its time is withfibrin added significantlygluebeing releasing systemprolonged at ismuch thantraditionalCPC Callbe least6 addition， weeks，whichlonger group(In solutioncanmaintainan intheextraction adequateinhibitory norvancomycin concentration KEYWORDS phosphate;Bio―materials Norvancomycin;Fibringlue;Calcium Vll 第一章新型去甲万古霉素(纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究………((4 1 材料与方 法…………………………………………………………………(4 2 结果…………………………………………………………………………………………………((5 3 讨论…………………………………………………………………………………………………((6 4 结 论…………………………………………………………………………………………………一8 5 附图…………………………………………………………………………(8 第二章去甲万古霉素(纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性毒性和抗冲涮性能研究 1 ……………………………………………………………………………………………………………………(1 l材料与方 法……………………………………………………………………1l 2结果……………………………………………………………………………………………………(13 3讨论……………………………………………………………………………………………………(14 5 4结论……………………………………………………………………………………………………(1 6 5附图……………………………………………………………………………((1 第三章去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙缓释系统中抗菌素的体外释放规律研 究…………………………………………………………………………………………………………………19 9 l材料与方 法……………………………………………………………………1 2结果……………………………………………………………………………………………………(20 3讨 念……………………………………………………………………………………………………(21 4结论……………………………………………………………………………………………………(23 5附图……………………………………………………………………………24 论文小 结……………………………………………………………………………(25 缩略词 表……………………………………………………………………………(31 文献综 述……………………………………………………………………………(32 攻读学位论文期间成 果……………………………………………………………(4l 致 谢…………………………………………………………………………………………………………(42 学位论文原创性声 明………………………………………………………………(43 统计学证 明…………………………………………………………………………(44 缺损修复材料，因其不存在免疫排拆反应，填充后骨愈合快，但同时亦给患者 增加了新的创伤，尤其是对较大面积的缺损此法明显受到限制。同种异体脱钙 骨在临床工作中应用也广泛，但同样面临着尸体来源受限，存在着免疫排拆， 晚期感染，移植骨愈合缓慢及交叉感染等一系列问题n1，另一方面同种异体骨还 要接受医学伦理学的考验，并且价格昂贵，给病人带来巨大经济负担。因此寻 找一种具有骨缺损填充作用的医用生物材料显得尤其迫切。 纤维蛋白胶 fibringlue下称FG 由纤维蛋白原，凝血酶及其它生物因 子组成，FG的凝固时间跟温度有关，而跟纤维蛋白原浓度关系不大，具有止血， 趋化及促有丝分裂的特性阳??引。20世纪初期Bergel因发现其具有止血作 用并首次 应用于临床，20世纪40年 ?Cronkile将其应用于游离皮瓣移植术，拟用作粘合 剂固定皮瓣，利于手术操作与提高手术成功率，但可能因所用FG纯度低未取得 预期效果，70年代Matras采用冷沉淀技术获得高浓度FG以后，有人将其用于周 围神经吻合术并取得成功，至此FG作为一种医用生物材料登上了历史舞台，1985 年Kram等人“3利用FG修复气管获得良好疗效，国内外学者对其产生了极大兴趣， Osada等人口1对人鼠FG复合绦沦移植片中西索米星的释放，扩散特性进行了研 等人踟的研究结果表明，FG可增加心肌细胞血流量，提高细胞移植存活率，并 减少梗死面积，同年Knesern哪对磷酸钙骨水泥中复合FG进行了研究，并评估了 其作为可注射性生物骨替代物的可能性，2006年Kishimoto等…1用B一磷酸三钙， FG及自体骨片复合物修复颅骨缺损结果显示，上述复合物可以在不使用其它支 前言 撑物下完全修复颅骨。2007年LeNihouannen等人口1证明磷酸钙,纤维蛋白胶复 合材料可用作因各种原因引起的骨缺损的填充QiXR，YanY，等人n23士用FG介 导的血管舒张剂递药系统治疗动脉移植术后引起的血管痉挛取得良好疗效，说 料中体内外软骨形成特点。胡运生等n4。，丁超等人n习亦分别对纤维蛋白 胶一磷 酸钙人工骨的理性特点进行了研究，二者在材料的抗压强度及凝结时间上得出 了不同结果，前者材料的抗压强度较普通CPC人工骨提高了55(6,，初凝时间 有所延长而终凝时间无改变，后者新型材料抗压强度较CPC(囊J CPC组并HCPC,FG 0(003 ，初凝及终凝时间均延长，其它女HXRD，SED，孔隙率等变化结果基本 一致，二者均认为材料符合临床应用要求。上述资料表明，FG具有有诸多方面 的生物活性，在骨科，神经外科，心胸外科及肿瘤科都有广泛的应用前景。 另外，张劲丰等n61与张俊、屠重棋n力先后分别对创伤骨科感染病人的伤 口分泌物或脓液、渗出物、引流物、穿刺液和病灶坏死组织的细菌进行培养后 显示，均显示金黄色葡萄球在所有感染菌中位居榜首，约占20,，该菌目前尚 未出现对万古霉素耐药的菌珠，而去甲万古霉菌素作用与之相似，但价格便宜， 于是苗军等人n砌将之加入蛰JcPC人工骨中，认为在一定抗生素质量分数内仍符 合临床骨填充材料所要求的基本机械强度。有报道称喹诺酮类抗生素对骨的再 生有抑制作用n引。抗生素浓度对成骨样细胞的生长的研究表明，局部高浓度抗 生素对成骨样细胞的增殖有影响，庆大霉素局部浓度达到一定程度时，碱性磷 酸酶活性明显下降，3H2胸苷合成降低，总DNA含量下降啪1。 受上以上资料启发，在FG,CPC人工骨中加入适量去甲万古霉素，使之不仅 具有骨填充作用，而且还具有局部抗感染功能，并检索了中文期刊全文数据库， Previews，Science Pubmed，BIOSIS Direct等国内外知名数据库关于FG,CPC 人工骨方面的文献，对筛选出的与本课题最相关文章共79篇 中文19篇，英文 60篇 文献进行阅读，结果发现目前尚无对本课题的研究。本课题创新之处在 2 硕士学位论丈 于，探讨性的将FG及去甲万古霉素同时复合到CPC人工骨中，使其不仅具 有骨 填充功能，还可能具有局部抗感染功能，有望应用于感染性骨缺损的治疗。 第一章新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究 第一章新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的 理学特性研究 1材料与方法 1(1主要材料及试剂 13一磷酸三钙 北京恩赛科技有限公司 磷酸二氢钙 上海国药 纤维蛋白胶 广州倍秀生物技术有限公司 去甲万古霉素粉末 华北制药集团赠 500mmol,L柠檬酸溶液 国产 AR级 自配 1(2主要实验仪器设备 水泥稠度凝结测定仪 上海 Instron5567 电子式万能材料试验机 美国 X一线衍射仪 D,―IIIA 日本 扫描电子显微镜 S-3000N 日本 1(3方法 ?新型材料的制备在人工骨固相粉末 B一磷酸三钙和磷酸二氢钙按3: l 配比 中加入适量NV粉末，充分研磨混合，按固液比为1g:0(4ml加入500 mmol,L柠檬酸溶液，充分混均，以双腔推液器将预先配制好的纤维蛋白原溶液 和凝血酶溶液以相同体积同时推至上述人工骨膏体中 人工骨与FG按凝固化后 体积比为2:1的比例均匀混合，5gCPC固相粉末与2lllL固化液混合后将产 生2cm3大小的晶体;0(5mL纤维蛋白原溶液和0(5IIIL的凝血酶溶液凝固后体 积为1am3 。此即制得含NV质量分数4,的新型复合人工骨 对照组材料仅以 B一磷酸三钙和磷酸二氢钙混合粉末19:0(4ml与柠檬酸溶液混均 。 ?凝结时间的测定分别将适量上述两种人工骨膏体充分混匀，填入内经 6mm高12mm的模具中，用水泥稠度凝结测定仪进行凝结时间的测试，以单针进入 4 时间， ?固化强度的测定按前述方法制得的两组人工骨膏体填入内经为6mm，高 18ram的标准钢模中，成形后即脱模，分别标记后置于恒温恒湿水化箱中充分水 化，用研磨抛光设备抛光抛平试样两端，游标卡尺精确测量其直经及高度，以 电了式万能材料试验机测试其抗压强度，加载速度为lmm,min，每组重复6次。 ?孔隙率测定排水法分别计算两组材料的的孔隙率，每组分别测量3次取 均值。 ?X一线衍射检测将两组材料试件充分水化4周后研磨成粉末，X一线 衍射仪 检测其固化产物，范围10。一70。，测试波长 1(5406，40kV，30mA，步宽0(02 。连续扫描。结果经Origin6(0软件处理。 ?新型材料扫描电镜观察单纯CPC组，NV―FG-CPC组材料完全干燥后形成 自然断裂样本，断裂面经真空镀膜仪表面喷金，扫描电镜不同放大倍数下观察 两组材料的结构特征，分别测量其材料的孔径，比较两者有无差别。 以上得出的固化时间、固化强度数据结果均经SPSSl3(0软件包处理，并做两样 t检验。 2结果 2(1固化时间与固化强度复合材料的初、终凝时间均较对照组明显短缩， 分别缩短1(08min和3(28min，统计学有显著差异 初、终凝t值分别为7(24、 14(51，P值均 0(01 。随着FG及抗生素的掺入，新型人工骨的抗压强度明显下 降，试件在37?恒温，100,湿度水化箱中固化4周后，实验组与对照组抗压强 2(2材料孔隙率经排水法测定单纯CPC组及NV-FG-CPC组试件孔隙率分别 为41(5,及45(3,。可见复合材料组中孔隙率比单纯CPC高出约4个百分点。 2(3X一线衍射分析检测固化产物衍射所得数据经Origin6(0软件处理， 通过与磷酸钙标准卡片对照发现，两组材料XRD主峰均在31。-32。附近 图 第一章新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究 1-5、1-6 ，同时加入适量FG与NV对人工骨的转化产物并无明显影响，说明 新型材料的主要固化产物仍为磷酸钙。 2(4扫描电镜观察结果单纯CPC由较规则的棒状和扁平片状晶体构成， 晶体连接较紧密，排布无明显规律其间充满不规则的微孔，微孔大小2,4um。 实验组材料见FG将CPC晶体连接成片，因此晶体的上述典型形状不甚明显，晶 u 体间的微孔大小约为3,5 m，且可见散在分布的，与背景颗粒不甚一致，大 u 小约为3―6m的抗菌素颗粒 图1-7、卜8箭头所示 。 2(5统计学分析 对两组材料的初凝时间、终凝时间及固化后的抗压强度均采用两独立样本的t 检验，结果见下表: X?S 两组材料初凝时间及终凝时间 min 比较 n 6 X?S 两组材料固化后的抗压强度 Mpa 比较 n 6 以上结果提示实验组与对照组材料的初凝时间、终凝时间及抗压强度均有显著 差异，实验组的固化时间较对照组缩短，抗压强显著降低。 3讨论 目前用于药物载体的生物材料可大体分为两大类，即可生物降解与不可降 解性材料，前者主要包括PLGA，胶原海绵，透明质酸盐及CPC人工骨，后者主 要是聚甲基丙烯酸甲脂 PMMA 与纳米羟基磷灰石乜?，其中CPC人工骨被公认 6 硕士学位论文 为具有良好的生物相容性，可降解性及良好的骨传导性，且较目前广泛应用于 关节外科固定假体的PMMA还有一明显特点，就是自固化过程不产热等优点，这 一特点使我们在临床应用时不仅无需担心产热过多引起周围组织的坏死乜铂，还 可以根据不同要求随意选择，而不必担心因材料放热破坏抗生素。Sasaki等?1 将万古霉素复合到CPC人工骨中并用于治疗骨髓炎及假体置入术后感染，体外 研究其抗生素释放时间至少达13d，说明复合到CPC人工骨中的抗生素没有被破 坏，而仍具有较强的生物活性。因此选择CPC人工骨作为抗生素载体无疑是一 种可行的方法，但单纯CPC低孔隙率，降解缓慢等缺点限制了其在临床的应用， FG系一种生物蛋白制剂，提取自动物血清，由纤维蛋白原，凝血酶及其它生物 活性因子组成，具有止血，趋化及促细胞有丝分裂等特性口1。以一定比例 将其加 至CPC人工骨中可提高其孔隙率n习。本课题将Nv加至具有较高孔隙率的FG-CPC 人工骨中，不仅赋予了其抗感染能力，同时证实了随着FG及Nv的掺入，材料 的孔隙率仍高于CPC组，这可能是FG在材料中形成了纤维网状结构增加了材料 的稀松度所致，随着FG在体内的快速降解，有望加快骨细胞长入材料孔隙内， 提高缺损部位的骨愈合速度。 固化时间是衡量医用人工骨理学特点的重要参数，本新型材料初凝及终凝 时间均较单纯CPC有所缩短，这可能是随着FG及抗生素的加入，降低了反应体 系的磷酸盐容积比及pH值，使固化早期磷酸盐沉积加速所致，但根据Khairoun min?TI 8 min， 等人乜蚰的临床固化时间标准:3 min:TI―TC?1min;TF?15 该材料的固化时间仍符合临床应用要求，具有较强的可操作性。此外，两种物 质的加入并没有改变其最终转化产物，固化强度亦满足骨松质填充的要求。 由于NV-FG-CPC人工骨是一种全新的生物材料，目前上述研究结果初步证实了 其作为临床应用的可能性，本实验的为研制各种具有多功能的生物材料提 供了思路。当然该复合材料在具体应用时的抗冲涮能力，在载有各种生物活性 的FG的磷酸钙人工骨后抗生素有何释放规律及材料本身的生物相容性和安全性 还有待于进一步深入研究。 7 第一章新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究 4结论 新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨自固化时间及固化后抗压强 度均符合临床人工骨应用要求，将FG、Nv同时复合到磷酸钙人工骨后固化产物 仍以磷酸钙为主，材料孔隙率亦有所提高，扫描电镜结果提示此法成功将去甲 万古霉素颗粒复合到磷酸钙人工中。 5附图 图1-1实验材料:且一磷酸二三钙 图卜2 实验材料:纤维蛋白胶 material: material: Fig(1-1Experimental Fig(1-2Experimental Fibrin 13-tricalciumphosphate glue 图1-3实验用钢模 图1-4新型材 料样件 steel ofthenewmaterial Fig(1-3Experimental Fig(1-4Samples SouthChina of providedby UniversityTechnology 0n 1K 图卜8对照组材料的扫描电镜图 ×1K 图卜7实验组材料的扫描电镜图 x The Thecontrol Fig(1―7 experimentalgroup: Fig(1-8 group: electron electron micrographs ×1K scanning micrographs ×1K 9 第一章新型去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究 图1-9水泥稠度凝结测定仪 ofcement Tester Fig(1-9Consistencysetting 10 性毒 4周龄健康SD大鼠 南方医大实验动物中心 SCXK粤 2006―0015 DMEM,F12基础培养基 吉诺 胎牛血清 HyClone 0(25,胰酶溶液一EDTAGenom D-hanks液、PBS液广州威佳生物技术有限公司 75,酒精 广州珠江医院 0(9,生理盐水 广州珠江医院 1(2主要实验仪器设备 电子分析天平 ERl20A 美国 C02培养箱 ShelLab公司 美国 恒温水浴箱 GRANT 美国 荧光显微镜 Leica公司 德国 台式高速离心机 TDL-50B 上海 低温冰箱 BCD-205W 上海 超净工作台 SW―CJ―IF 苏州 第二章去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性毒性和抗冲涮性能研究 一次性使用细胞培养瓶 Corning 玻璃管、离心管及移液管 广州威佳生物技术有限公司 1(3方法 ?去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙缓释系统及单纯磷酸钙骨水泥试件的 制备在骨水泥固相粉末 6一磷酸三钙和磷酸二氢钙按3:1配比 巾加入适量 去甲万古霉素粉末，充分研磨混合，按固液比为lg:0(4ml加入500mmol,L 柠檬酸溶液，充分混均，以双腔推液器将预先配制好的纤维蛋白原溶液和凝血 酶溶液以相同体积同时推至上述骨水泥浆体中 骨水泥与纤维蛋白胶按凝固 化 后体积比为2:1的比例均匀混合，5CPC固相粉末与2mL固化液混合后将 g 产生2cm3大小的晶体:0(5mL纤维蛋白原溶液和0(5mL的凝血酶溶液凝固后 体积为1cm3 。此即制得含去甲万古霉素质量分数4,的新型复合人工骨 对 照组材料仅以B一磷酸三钙和磷酸二氢钙混合粉末lg:0(4ml与柠檬酸溶液混 均 。将上述骨水泥填入内经为6mm，高18mm的标准钢模中制成材料试件备用。 ?单纯CPC组及NV-FG-CPC组材料全培养液制备按上述方法制备的两组试 件，经钴60射线照射法消毒后按309,L投于一定量DMEM,F12基础培养液内浸 提72h，去除试件，浸提液内加入一定量胎牛血清，分别配成含10,胎牛血清 的全培养液备用，另以普通正常DMEM,F12配成全培养液进行对比，每组设三个 重复组。 ?全骨髓培养法培养大鼠骨髓贴壁细胞经颈椎脱臼法处死SD大鼠后投于 75,洒精中浸泡30min消毒，超净台紫外线消毒30min后备用，在无菌条件下 截取大鼠双后肢股骨及胫骨 图2-2a ，充分剥除周围软组织后去除骺端，分别 以上述三组全培养液冲洗骨髓腔 图2-2b ，收集冲洗液于离心管中，此时更换 超净台，将上述细胞悬液接种于不同培养瓶内并标记，拟2h后第一次全量 换液 除去已壁的部分细胞，以后平均2―3d换液一次，记录并观察细胞形态及数量级。 ?材料对细胞的急性毒性评价对原代培养的骨髓贴壁细胞进行形态学观 察，待其细胞融合率约达85,一90,时以细胞计数板计数各组培养瓶内细胞数量 12 组材料的抗冲涮性 i抗溃散性能按上述方法制得的材料试样直接投于生理盐水中，24h，48h 后分别观察材料在溶液中的形态，注意观察材料周围的变化情况。 ii模拟骨松质持续渗血实验测试材料的抗冲涮性能在横截面为圆形 的玻 璃管内置入略大于其内经的相同形状的普通海绵，后者前后各留一定距离，将 玻管固定于支架上，内经6mm输液管连接于海绵一端，上接足够量生理盐水， 置于约70cm高处，使其形成约7kpa的压强，此即模拟术中松质骨缓慢持续渗 血装置，在液柱持续加压的同时分别以注射器注入一定质量初凝lmin后的两组 材料骨水泥浆体，仔细观察直至达到终凝，两组材料玻管内质量不再减少为止， 以达到终凝后剩余质量 m1 与初始质量 m2 的比值作为衡量其抗冲涮性能 的指标，并观察其表面形态，每组材料重复3次并取均值。 2结果 2(1原代细胞生长状况接种后三组培养瓶内见大量与背景细胞不甚一致、 折光性良好且体积稍大的圆形悬浮细胞，分布较均一，约2h后均开始见有少量 上述细胞贴壁生长，24h后贴细胞数目几乎不再增加，此时细胞形态大多为短梭 形或小圆形，三组培养瓶内细胞培养48h后细胞数目均迅速增加，主要呈长、短 梭形，少数为小圆形，并可见少量多边形、折光性好的细胞。培养第5d时三瓶 细胞形态更趋一致，以长梭形为主，少量呈短梭形，第7d时融合率均达55,左 右。大约在培养第14d 瓶细胞达N85,一90,融合率，此时各组培养瓶内细胞 106,ml、1(8×106,ml。三组细胞数量 级相同。 胞计数依次为2(1×106,ml、1(6X 2(2溃散抗冲涮性能测试结果单纯CPC组于生理盐水溶液内24h后即可 见材料周围被云雾状带包绕，48h后云雾带范围明显扩大 图2―7、2―8 ，而 NV―FG-CPC组周围未见此现象发生，仅见少量脱落的水泥小粒。3次重复实验 g_-章去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性毒性和抗冲涮性能研究 NV―FG―CPC组见玻管内仍剩余大量骨水泥块，初始质量及达到终凝后质量均值分 显水泥小粒 图2-10 。而CPC组玻管内剩余的骨水泥量明显减少，冲涮面骨 水泥粗糙不平，且见容器内大量被冲散的骨水泥小粒 图2-9 ，以同样方法算 ml,m2 67(5,。 得其m2 O(8409，ml 0(5679 3讨论 Buchholz等乜明首次提出把抗生素载入人工骨内的理念，拟将其用于预防和 治疗全髋关节成形术中可能伴随的深度感染。但抗生素与人工骨相结合构成的 真正意义上的载药系统被人们所认识，是自Klemm汹1应用抗生素骨水泥防治骨软 组织感染获得成功之后。随后Shirtliff 实载药人工骨系统在治疗骨髓炎方面局部用药要优于全身给药，且药物并发症 明显减少。自此载药人工骨系统作为一新型生物材料登上历史舞台。 目前广泛用于髋膝关节置换手术的PMMA强度高，具有良好的生物学性能， 但因其聚合过程释放大量热量，只能携带如万古霉素、庆大霉素及妥布霉素等 热稳定抗生素，这一缺点限制了其作为载药人工骨在临床的广泛应用。而磷酸 钙人工骨在其反应过程中产生极少量热量，放宽了其作为抗生素载体的适应范 围，人们选择其作为抗菌素载体的又一重要原因，是其药物的时间依赖控释特 点，因其内部由均匀基质构成，自身结晶度比较低可形成自然微管，药物可从 微孔内通过弥散机制释放四，因此磷酸钙人工骨具有作为载药人工骨系统的 天 然优势，但它固化后的强度较PMMA低，且随着抗生素质量比例的升高，其强度 呈进行性下降趋势，因此该系统载荷的抗生素量受一定限制，一般认为抗菌素 质量比例在5,左右时磷酸钙人工骨的固化强度不受明显影响啪3。具体到临床应 用领域，我们还关心其一旦与血液或人体的其它体液接触后是否会影响其固化 过程及固化强度，尤其是当现场合成即用的人工骨用于局部填充时，因其需直 接接触骨缺损部位的流动血液，很容易被冲散而难以固化导致手术失败。传统 测试材料抗溃散性的方法，因其主要是将材料试件投于静态液中n51，并于静态 14 硕士学位论文 条件下观察材料表面微粒的扩散情况，不能很好的模拟手术过程，本实验通过 动态模拟术中松质骨的持续渗血过程，证实随着FG的掺入，材料的抗冲涮性能 有明显提高，这可能与FG在材料中形成纤维胶状物增强了材料微粒间的连接有 关。 NV―FG-CPC系一种全新的载抗生素人工骨缓释系统，前期研究工作显示该系 统具有较大的孔隙率，其固化时间及固化后的抗压强度均符合临床应用要求， 显示出良好的应用前景。但任何新材料在进入临床应用之前，均必须按照医疗 估，而体内和体外试验是目前评价材料生物安全性的主要方法手段，如进行急 性毒性试验、溶血试验、皮内刺激试验及细胞毒性实验等b崩】。FG、Nv及CPC 磷酸钙人工骨本身均无毒性，但随着三者的有机结合组成新的系统其安全性仍 需进一步证实。本实验对新型材料的生物安全性仅进行了初步评价，急性细胞 毒性实验结果提示该体系对大鼠骨髓贴壁细胞无明显毒性，而且作为一种新型 载药系统，较普通磷酸钙人工骨具有更好的抗冲涮性能。当然进一步对复合材 料进行上述提及全面的系列评估仍十分必要，并且NV-FG-CPC系统中去甲万 古 霉素在该体系中的生物稳定性及释放规律如何，释放时间能否持续到一定的药 物疗程，尚需进行下一步的实验研究。 4结论 ?细胞生长状况各培养组内原代细胞生长良好，培养约第14d 瓶细胞达 到85,一90,融合率，此时各组培养瓶内细胞形态较一致，且三组细胞数量级均 达106,ml。说明随着去甲万古霉素及纤维蛋白胶的同时加入，并未产生新的有毒 物质，新型材料无急性细胞毒性作用。 ?抗溃散抗冲涮性能利用改良抗冲涮实验测得新型材料在动态状状下具 有较单纯CPC更强的抗冲涮能力，结果与传统方法测得其抗溃散性一致。 15 第二章去甲万古霉素一纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性毒性和抗冲涮性能研究 5附图 图2-1改良骨水泥抗冲涮模式图 图解:一表示水流方向性1生理盐水;2输液杆与输液器;3精输液针头;4固定器;5 海绵;6粗玻璃管;7大容器;8骨水泥浆体 bonecement rinsemodel Fig(2一lImproved Impact map directionofthe infusionrodandthe infusion Graphic:??一now water;1NS;2 infusion; 3 needle;4 thick bone cement fixator;5 largecontainers;8 sponges;6glass;7 paste a无菌下截取SD大鼠双侧后肢 b全培 养液冲洗骨髓腔