实验三 杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用

实验三 杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用 一、试验原理和目的 在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。 有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。 该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。生成 物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代AChE的活性。 本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。 二、仪器、试剂和材料 1. 仪器 721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。 2. 供试昆虫 5或6龄的粘虫或家蝇成虫。 3. 试剂 (1) 1.5%溶液生理盐水:称取kcl 1.5g，加入98.5ml蒸馏水，置于100ml的容量瓶中。 (2) 2.0×10M谷胱甘肽(还原型)生理盐水溶液:称取谷胱甘肽(还原型)0.030733g，以1.5%的1.5%溶液生理盐水定容于50ml的容量中。 -3 (3) 0.2M PH7.6磷酸缓冲液:取0.2M Na2HPO4溶液435ml和0.2M NaH2PO4 65ml混匀后装在500ml的容量瓶中。即称取15.579g Na2HPO4?12H2O和1.01407g NaH2PO4?2H2O，加入蒸馏水定容至500ml。 (4) DTNB-磷酸盐-乙醇液:称取12.4mgDTNB溶于95%乙醇(120ml)中，加入80ml蒸馏水，再用缓冲液定容至250ml。 (5) 0.8х10硫代乙酰胆碱(Asch)生理盐水溶液:取Asch0.011567g， 用1.5%溶液生理盐水定容至50ml。 (6) 配制适当浓度的辛硫磷和灭多威丙酮溶液。 (7) 考马斯亮蓝G,250法测定蛋白含量用试剂。 A 牛血清白蛋白溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000μg,mL的原液。 B 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90,乙醇中，加入85,(W,V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 C 乙醇 D 磷酸(85,) (8)供试农药:灭多威原药(1.0mg/mL)、辛硫磷原药(1.0 mg/mL) -3 三、操作步骤 1. 试虫处理方法 用待测之杀虫剂丙酮溶液以饲喂法或点滴法处理试虫，待表现出明显中毒症状时，置于冰箱冷冻贮存待用。正常组只用等量丙酮处理虫体，于处理组表现症状的同时，也移于冰箱冷冻室贮存待用。 2. 酶液制备方法 取处理和正常试虫各10头，剪取试虫头壳(带少量胸部)，加入0.2M PH7.6的磷酸缓冲液于冰浴中匀浆(先放入头壳，加入1.0mlPbs，匀浆，至无碎片且为浑浊溶液为止，倒入离心管中，分三次共加3.0mlPbs)，定容匀浆液至4ml，在冰箱中于4000rpm离心15min，取上清液冷贮供试。 3. 酶活性测定方法 (1)标准曲线制作 取6支试管，分别加入0.0、0.05、0.1、0.15、0.2和0.25ml10M还原型谷胱甘肽溶液，用0.2MpH磷酸缓冲液补足到0.4ml，加入二硫双硝基苯甲酸(DTNB)-磷酸-乙醇液3.6ml,在412nm处测定OD值。以谷胱甘肽浓度为横坐标，OD值为纵坐标做图，的标准曲线，求回归方程。 (2)酶活性测定 取处理、对照酶源各0.2ml，加入0.2mlPH7.6的Pbs(磷酸缓冲液);再加入0.8mmAsch0.06ml;-3 30?温浴20min;加入DTNB-磷酸盐-乙醇液，显色并终止反应;于412nm下比色,测光密度(OD)。 4. 蛋白含量测定方法 参照实验三蛋白质含量测定(考马斯G,250法)测定酶液中蛋白含量。 四、结果处理 将测定的各酶液的OD412带入标准曲线，计算出被水解的底物含量(μmol)。然后将测定的各酶液的OD595带入标准曲线，计算出蛋白含量(mg)。以底物含量除以蛋白含量即为各酶液的活力，单位为μmol底物/ mg蛋白?20min。按照下式计算各处理酶活力抑制率。 酶抑制率(%)= (对照酶活力,处理酶活力)/对照酶活力×100 计算出酶抑制率后，分析各供试药剂对乙酰胆碱酯酶的影响，结合供试药剂的作用机理理论，分析药剂作用症状、酶活力及作用机理之间的关 系。 蛋白含量的测定 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0,1 000μg,mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 1. 0~1 000μg,mL标准曲线的制作 取6支10mL具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。 表1 标准曲线制作 管 号 1 000μg,mL标准蛋白液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 蛋白质含量(μg) 2. 0~100μg,mL标准曲线的制作。 1 0 1.00 5 0 2 0.2 0.8 5 200 3 0.4 0.6 5 400 4 0.6 0.4 5 600 5 0.8 0.2 5 800 6 1.0 0 5 1 000 表2 低浓度标准曲线制作 管 号 1 000μg,mL标准蛋白液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 蛋白质含量(μg) OD595nm 1 0 1.00 5 0 2 0.02 0.98 5 20 3 0.04 0.96 5 40 4 0.06 0.94 5 60 5 0.08 0.92 5 80 6 0.10 0.90 5 100