蛋白质分离纯化技术研究进展

蛋白质分离纯化技术研究进展 许梓博 (广东食品药品职业学院，广州，510520) 【摘要】蛋白质是维持人类健康方面的一种重要物质，它与人类生活密切相关，是生命物质基础之一，存在于自然界中复杂的混合体系中。蛋白质在细胞中的含量极低，将其从复杂体系中分离出来并保持其活性，难度较大，因此，对其质量和纯度要求也越来越高。蛋白质的分离纯化受到生命科学等领域广泛关注。文章分析了层析技术、膜分离、高效液相色谱、双水相萃取法、反胶团萃取、超滤、毛细管电泳和分子印迹技术等技术的基本原理及分离模式，并对其应用于蛋白质分离纯化的研究进展进行了综述。 【关键词】蛋白质;分离纯化;层析;色谱，进展 The Study Development in Separation and Purification of Protein Xu Zi―bo (Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou，510520) 蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中( 包括催化代谢反应、物质运转、兴奋的传导、生长发育的控制等) 起着重要的作用，蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中不可缺少的环节。近20年来,生物技术迅速发展。运用基因、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已能、制造、生产人们急需的多种蛋白质。 蛋白质的生产过程和其它生物产品的生产过程一样，一般也分为上、中、下游过程。对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物是下游过程。目前,生产蛋白质的上、中游技术如基因突变、基因重组与表达等技术发展很快，下游蛋白质分离纯化技术也随着有了新的发展。 蛋白质常存在于复杂的混合体系中，且稳定性较差，对温度、pH、机械剪切力等非常敏感、易于变性。随着生物技术的发展和对各种蛋白质结构和功能研究的深入，对蛋白质分离检测研究也有了迅速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段，主要包括膜分离、高效液相色谱，毛细管电泳、分子印迹技术及联用技术。 1 蛋白质分离纯化的特点和需要解决的问 1.1 蛋白质分离纯化的特点 1)大多数蛋白质产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。 2)蛋白质产品在物料中含量很低，且物料组成非常复杂。例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质，物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等，目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体，为获取蛋白质，还需进行细胞破碎，结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。 3)含蛋白质产品的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。 4)很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用，因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的，产品无菌、无致热源等。 1.2 实现蛋白质产品的分离纯化应解决的问题 1)设计蛋白质产品分离纯化的最佳,用最少的分离步骤获得最大的产率,同时确保蛋白质产品的纯度。 2)发展蛋白质纯度的快速分析检测技术。在下游的各道工序,准确、快速地对蛋白质产品进行纯度分析和活性检测,以保证产品的质量。 3)搞好上、中、下游技术的配合，便于蛋白质产品的分离纯化。大多数蛋白质产品的分离纯化，需消耗大量的人力、物力，因此应尽可能改进上、中游技术，减少下游过程负荷。例如，利用金黄色葡萄球菌发酵生产A蛋白。通常，A蛋白结合于菌体胞壁上，需要进行细胞破碎，然后将A蛋白从胞壁上剪切下来，过程繁琐，难度大。若运用生物技术培养出A [1]蛋白分泌型菌来生产，A蛋白的分离纯化就容易得多。 2 分离纯化技术 2.1反胶团萃取蛋白质特点和基本原理 反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成聚集体。其中，表面活性剂分子亲水基向内、非极性疏水基朝外，形成球状极性核，核内溶解一定数量水后，形成宏观上透明、均一热力学稳定的微乳状液，微观上恰似钠米级大小微型“水池”。这些“水池”可溶解某些蛋白质，使其与周围有机溶剂隔离，从而避免蛋白质失活。通过改变操作条件，又可使溶解“水池”中蛋白质转移到水相中，这样就实现不同性质蛋白质间分离或浓绪”。 胶团是表面活性剂分子在极性溶剂中形成一种亲水基团朝外，而疏水基团朝内的具有非极性内核多分子聚集体。与此相反，反胶团是表面活性剂分子在非极性溶剂，如在某些有机溶剂中形成一种亲水基团朝内，而疏水基团朝外的具有极性内核多分子聚集! 反胶团内核可不断溶解某些极性物质，且还可溶解一些原来不能溶解物质，因此具有二次增溶作用。反胶团核内溶解一定量水后，形成宏观上透明热稳定体系，微观上纳米级大小 [2]微型“水池”，可进一步溶解核酸、氨基酸、蛋白质等生物活性物质。 2.2层析技术 层析技术又称为色谱技术，是目前生化分离分析中最常用的技术之一，在生物工程下游处理中占有主要的地位。传统的色谱柱具有分离效率高、柱容量大的特点，但也存在着以下缺点: 一是流速慢，生产效率低，蛋白质在长时间分离过程中易变性失活; 二是压降大，对分离系统要求高; 三是不易放大，在放大规模时，需要逐级摸索分离条件，这是大规模分离纯化时突出的困难之一，因此迫切需要发展新的色谱技术。 层析分离是基于固定相对流动相中各组份阻滞能力的大小，各种层析方法,其阻滞机理不同。根据固定相对物料组份阻滞机理的不同，层析可分为分子筛层析、羟基磷灰石层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相作用层析、亲和层析等。 分子筛层析又称凝胶过滤层析或尺寸排阻层析，它是利用各组份分子体积大小与形状的不同将组份分开。分子筛层析的分离精度不高，常用于分子大小相差悬殊的蛋白质的分离纯化或蛋白质溶液的脱盐。 羟基磷灰石层析基于羟基磷灰石对一些蛋白质的吸附作用进行分离。虽然羟基磷灰石层析应用有限，但其分离成本低，在对某些蛋白质如血浆铜蓝蛋白的分离有独到之处。 离子交换层析是早期蛋白质层析方法之一，目前仍被普遍使用。离子交换剂是由不溶性的高分子母体上引入可解离的基团制成的，按引入基团的交换电性不同分成阳离子交换剂和阴离子交换剂; 按母体的不同可分为离子交换树脂"离子交换纤维素和离子交换凝胶，交换 树脂主要用于分子量较小的物质的分离，只有某些大孔径的树脂才可用于酶的分离，交换纤维素和交换凝胶都是目前蛋白质分离研究中广泛应用的交换剂，两者交换容量大，在应用时应当注意离子交换纤维素在剂型上也有所差别，微粒型一般有优于纤维素型;同时交换凝胶具有离子交换和分子筛的双重作用，交换容量相应更大些。 离子交换的分离机理大致如下: 由于不同的蛋白质在同一 2; 下会带上不同性质( 正负) 或带上不同电量的电荷，试验中可通过选择合适的 2; 条件，使目标蛋白和杂质带上不同性质的电荷而与离子交换剂进行相互作用，从而或保留或流出柱体; 对于与目标蛋白带电性质相同但电量不同的物质可采用不同浓度的盐溶液洗脱进一步分离。 疏水作用层析、反相作用层析利用组份间疏水性的差异分离各组份。用于疏水作用层析、反相作用层析的固定相表面都带有疏水作用基团。不同的是，疏水作用层析固定相表面的疏水基团疏水性弱，一定盐浓度的蛋白溶液流过固定相时，蛋白质被吸附，然后以低盐水溶液作为洗脱剂进行洗脱。而反相作用层析固定相表面的基团疏水性强，蛋白质水溶液流过固定相时，蛋白质被吸附，然后用有机溶剂洗脱。 疏水作用层析多用于大分子蛋白质的分离纯化。反相作用层析分离蛋白质时，蛋白质容易变性失活。一般于小分子蛋白质、多肽和氨基酸的分析、分离。 亲和层析是60年代发展起来的一种高效、速蛋白质分离纯化技术。通常的层析方法都是利用蛋白质理化性质的差异来进行分离的，这种差异往往并不是很大，所以，分离精度不高。亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析则利用蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性，来选择分离目标蛋白质。亲和层析容量大，分离效率高,且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。 随着染料配基、人工定向合成配基的应用和配基偶联技术的发展亲和层析技术更加适用化。特别是由于任何蛋白质都具有抗原性，通过杂交瘤技术均可制备相应的特异性单抗，以单抗为亲和配基，去分离对应的目标蛋白质，可以实现各种天然、重组蛋白质的高效、快速分离纯化。 近年来，随着人们对蛋白质分子结构的深入研究和其它学科的发展，又出现了一些新的蛋白质层析方法,如金属螯合层析、层析聚焦等。这些层析技术在蛋白质分离纯化上都发挥 [1,3,6,7]着重要作用。 2.3液膜 液膜究竟是怎么一回事?简而言之，就是很薄的一层液体膜。它有三种类型: 1.液滴型， 2.隔膜型; 3.乳化型。其中有关液滴型的报道较少，隔膜型液膜的制作方法是将微孔膜浸在有机溶剂中，待有机溶剂充满孔隙即形成液膜,然后置于待分离的两种溶液之间，即可对溶质进行浓缩分离。乳化型液膜,也是目前报道得较多的,是比较有实用价值的一种液膜。该类液膜是一种乳状液，有油包水型和水包油型两种。根据不同的处理对象，采用不同的膜。如处理对象为水溶液，则用油包水型，处理对象为有机溶剂，则用水包油型。 液膜分离的机理有下面几种: 1.选择性渗透; 2.在被膜包封的那个相内发生化学反应; [4]3.膜相萃取，膜内相反萃取。 2.4 大孔吸附树脂分离纯化 大孔吸附树脂是一种不含离子集团的网状结构高分子聚合物吸附剂, 具有吸附性强、解吸附容易、机械强度好、可反复使用、流体阻力小等优点, 其分离性能与树脂本身性质、溶剂因素和被分离的化合物性质等有关。其原理是采用特殊的吸附剂, 利用其吸附性和筛选性相结合, 从中药复方煎液中有选择的吸附其中有效成分,去除无效成分。特别适用于从水溶 [5]液中分离低极性或非极性化合物。 2.5膜分离技术 膜分离技术是20世纪60年代后迅速崛起的一项新兴的高效分离技术，它采用半透膜作为选择障碍层，以膜两侧的能量差为推动力，根据各组分透过膜的迁移率不同，而允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，从而实现混合物中各组分的分离。该技术具有操作条件温和、不存在相转移、分离效率高、不必添加化学试剂、不损坏热敏性物质、可极大的减少 [8]纯化工序实现连续和自动化操作、使用范围广等优点。 2.6毛细管电泳 毛细管电泳(CE)是利用小毛细管代替传统的大电泳槽, 使电泳效率提高了几十倍。(CE)根据应用原理的不同可分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管凝胶电泳(CGE)和胶束电动毛细管层析(MECC)几种。CE的制备总量低, 适用于微量制备; 对扩散系数较小的生物大分子而言, CE的分辨率高, 因此CE被用作收集非常纯的单一馏分的微量制备手段此技术从 20 世纪 80 年代以来发展迅速, 是生物化学分析中分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。应用CE分离多肽类物质具有柱效高、分析时间短、样品量和 [9,11]试剂少等优点，CE在纯化蛋白方面得到了很好的应用。 2.7 高效液相色谱 高效液相色谱的出现不仅仅是药物研发领域的革命，同时也为多肽类物质的分离提供了更有利的方法。其原理是基于多肽的疏水性，在不同的介质条件下，使不同的多肽得以分离，具有快速、高效和高回收等特点，在分离和制备蛋白及多肽上有独特的优越性。利用反高效液相色谱分离多肽时，首先要确定不同结构多肽在柱上的保留情况，利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。在适宜的色谱条件下应用高效液相色谱可以在短时间内完成对蛋白、多肽的分离，更重要的是高效液相色谱能在制备的规模上生产具有生物活性的多肽。在多肽的分离、纯化和鉴定中应用最多的是反相高效液相色谱，约95%是 C18反相硅 [9,11]胶高效液相色谱。 2.8双水相萃取技术 双水相萃取技术是由2种聚合物或聚合物与无机盐在水中在适当的浓度等条件下形成互不相溶的两相体系，利用待分离物在两水相中分配系数的不同而实现提取分离的方法。目前最常用的双水相体系有聚乙二醇(PEG) /葡聚糖体系、PEG /无机盐体系、表面活性剂/表面活性剂体系、普通有机溶剂/无机盐体系、双水相胶束体系、温敏性双水相体系、热分离双水相体系、离子液体/无机盐体系等。与传统的分离技术相比，具有操作条件温和、处理量大、易连续操作等优点，同时克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在粗提过程中保持了生物物质的活性及构象等优势，该技术现已成功地应用于分离蛋白质、抗生素微 [8,10]生物离子、电泳分离氨基酸等。 2.9分子印迹技术 分子印迹技术利用具有高度分子识别功能的聚合物材料为固定相，对目标分子进行分离、筛选、纯化的一种高选择性仿生技术,其技术核心是制备分子印迹聚合物。 分子印迹技术是利用受体-抗体作用机理，结合生物化学、结构化学、材料化学等学科发展起来的新兴交叉学科。通过以特定分子为模板，制备具有固定空穴大小和形状及特定排列功能基团的交联高聚物，可实现对模板分子的选择性识别。分子识别在生物活性方面发挥着重要作用，大多数生物分离技术都依赖于分子识别作用。最近几年该技术应用研究十分活跃，涉及的范围很广，如氨基酸、糖类、金属离子、药物分子、除草剂等分析检测、分离与纯化。 [12]朱庆枝利用分子印迹技术，制备了卵清白蛋白(EA)的人工抗体，研究了其对抗原的 特异性吸附能力，在此基础上，模拟竞争型免疫反应，并立了卵清白蛋白的仿生荧光免疫分 [13]析方法。Joshi等将合成的键联印迹分子的单体溶于苯中再溶胀至甲基丙烯酸缩水甘油酯大孔微球内将苯缓慢蒸发除去后聚合水解除去印迹分子得到的聚合物材料可对结构相似大小或形状不同的物质进行分离。近年来，新发展的抗原决定基法是基于使用多肽或蛋白质序列中裸露的一个特异短肽(抗原决定部位)片段作为模板分子，利用它所合成的MIP也能有效 [8,11]识别整个多肽和蛋白。 3 结论 在实际工作中，很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化，往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好到目前为止，还没有单一的方法能够分离、纯化出高纯度的蛋白质，应依据蛋白质物理、化学以及生物学特性的不同，采用多种分离方法，以便在分离、纯化的同时，更好地保持蛋白质的生物学性质。因此，蛋白质的分离、纯化仍然是一项艰巨而繁重的任务。 目前，除上述技术外，如移动界面电泳、各种形式的区带电泳、特别是圆盘凝胶电泳及等电聚焦点用等均具有很高的分辨率，可用于蛋白质的分离纯化。 参考文献 [1]鲍时翔,姚汝华. 蛋白质分离纯化与层析技术进展[J]. 华南理工大学学报(自然科学版),1996,12:100-105. 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