尼群地平包合物的制备与性质.doc

尼群地平包合物的制备与性质.doc 尼群地平-β-环糊精包合物的制备与性质 * 李星，王建华 重庆大学生物工程学院，重庆 400044 摘要:目的 研究尼群地平-β-环糊精包合物最佳制备工艺，并研究其包合物性质。方法 采 用研磨法、饱和水溶液法、超声波法，通过正交实验，确定最佳制备方法及工艺。采用 显微观察、X-衍射法、紫外分光光度法来鉴定及研究包合物性质。结果 超声波法制备的 包合收率大于其余两法，其最佳包合工艺为超声功率为40KW;β-CD:尼群地平为4:1(摩 尔比);超声温度为20?;超声时间为70min。经鉴定形成了尼群地平-β-环糊精包合物。 结论 使用超声波法包合后，包合物比原料药的溶解性增强了10.5倍，光稳定性增强3.7倍。 其包合产物性质的改善，有助于其制剂生物利用度的提高。 关键词:尼群地平;超声波法;包合制备;正交分析 Study on Characterization of the Inclusion Complexes of Nitrendipine with β-Cyclodextrin LI Xing, WANG Jian-hua Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044 ABSTRACT: OBJECTIVE To select the optimum preparation process of the inclusion complex of nitrendipine-β-cyclodextrin and study the property of the complex. METHODS The nitrendipine-β-cyclodextrin inclusion complexes were prepared through solid method, saturation solution method and ultrasonic method and the function of inclusion complexes were studied on physical and chemical characterizations. RESULTS The ultrasonic method is the best one in three methods. The optimum entrapment conditions were as follows: The ultrasonic power was 40KW,the ratio ofβ-CD to nitrendipine was 4:1, temperature was 20?, reaction time was 70 min. The formation of compound nitrendipine -β-CD was confirmed and studied by microscope observation , X-Ray powder diffractometry and UV method. CONCLUSIONS Inclusion complex not only can enhance 3.7 times the stability to light, but also can gain 10.5 times the solubility of guest molecule. Its improvement could increase the value in body use. KEY WORD: nitrendipine; ultrasonic method; preparation of inclusion complex; orthogonal design 尼群地平(nitrendipine, NTD)为二氢吡啶类钙拮抗剂，主要抑制血管平滑肌和心肌的 跨膜钙离子内流，降低舒张压，持久扩张冠状血管，降低心肌耗氧量，可用于治疗各种类型 的高血压，也可用于充血性心力衰竭。但该药物在水中几乎不溶，口服生物利用度差，且其 [1]光稳定性差，因此一定程度上影响了其制剂的开发。β-环糊精(β-Cyclodextrin，β-CD ) 由7个葡萄糖分子通过糖苷键结合而呈环状中空圆筒型，筒型空腔内径为0.7,0.8nm，空 ---------------------------------- 基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金(2006)331;重庆市应用基础研究项目2006BB5017 作者简介:李星，(1982-)，女，硕士，研究方向:环糊精修饰与应用; TEL:65102507 E-mail: kinsin1@163.com 王建华，(1962-)男，安徽，博士，教授，研究方向:药物化学，通讯联系人。 腔有疏水性，可把许多大小合适的分子容纳在空腔中形成包合物。β-环糊精作为一种高效、低毒、安全有效的药用辅料，可以促进药物的溶解度和溶出度、提高药物的稳定性、改变药物状态便于制剂、掩盖药物的不良气味和降低刺激性、促进药物的吸收，还具透皮促进 [2][3]作用。因此，为提高改善尼群地平的生物利用度，丁燕飞和管清香等曾采用饱和水溶液法对其包合工艺和包合物性质进行了研究，但对其它包合方法并未做深入的比较和优选。为拓展不同包合工艺的研究和应用，本文采用物理研磨法、水饱和溶液法和超声波法等三种不同包合方法，系统研究了尼群地平与β-环糊精的包合作用，并对包合物进行了定性和定量化研究，为今后优化尼群地平制剂的制备工艺，改善尼群地平的水溶性，提供理论依据。 1 实验部分 1.1 药品试剂与仪器 药品试剂:尼群地平(石家庄中诺药业，批号:200512030);β-环糊精(中国医药集团上海化学试剂公司，批号:20021015);蒸馏水;其余试剂均为分析纯。 仪器:752S型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);KQ-50B型超声波清洗 器(昆山市超声仪器有限公司);PHILIPS TYPE 943001800101-PW-1800 X-ray 衍射仪;磁力 搅拌器(郑州市上街区仪器厂);光学显微镜(OLYMPUS TH4-200);日光灯光照箱;精密电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);水浴恒温器(重庆实验设备厂)。 1.2 包合物制备 1研磨法 精密称取β-CD5.0g，置研钵中，加入50mL水，另精密称尼群地平0.446g，? 用少量丙酮使之全部溶解，边研磨边缓缓加入用丙酮稀释的尼群地平溶液，研磨70min后取出，放冷至室温。然后置冰箱中冷藏12h，抽滤，用少量丙酮浸泡后.快速洗去未包合的尼群地平，滤渣于60?的烘箱中干燥，研细即得。 2水饱和溶液法 称取7.2gβ-CD置于三颈瓶中，加蒸馏水，在70?下制成饱和溶液，? 恒温。另取2.5gNTD溶于适量丙酮中，在不断搅拌下缓慢滴加到β-CD饱和溶液中，持续搅拌30min，然后，蒸发挥散丙酮，在搅拌下冷却到室温，敞口搅拌4h。置常温4?冰箱中冷藏12h，析晶，抽滤，用少量丙酮快速洗涤，在60?下干燥即得。 3超声波法 称取适量β-CD制成饱和溶液置于锥形瓶内，置于超声波器中的震荡，? 另取对应适量的NTD溶于少量的丙酮中，滴加入有β-CD饱和溶液的锥形瓶。超声制备一定时间后，挥发丙酮，冷却，置常温4?冰箱内冷藏12h，析晶，抽滤，用少量丙酮快速洗涤，在60?下干燥即得。 1.3 超声波包合最佳制备工艺的选择 选择超声功率(KW)、投料比(NTD与β-CD的摩尔比)、包合温度(?)、包合时间(min) 5等四种对实验结果影响较大的因素作为考察对象，每个因素各选取4个水平，(即)采用L(4)16正交表设计进行试验。见表1 表1 超声法制备包合物的因素水平表 Tab 1 Table of factors and levels of ultrasonic preparation Factor Level A B C D 超声功率/KW β-CD:NTD/mol 温 度/? 时 间/min 1 20 1:1 20 20 2 30 2:1 40 40 3 40 3:1 60 60 4 50 4:1 80 80 以所得包合物的收率、药物的包封率和溶出度为考察指标，确定最佳制备工艺。 1.4 含量测定 精密称取NTD和β-CD适量，分别溶于15%乙醇，制成一定浓度的溶液，在200~400nm波长范围进行扫描(图略)，结果显示，其在239nm处有最强吸收峰，β-CD在此波长处无吸收，故确定239nm波长为NTD的测定波长。以15,乙醇溶液作为溶剂，配置浓度分别为 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0µg/ml的NTD溶液，在波长239nm处测其吸光度。得曲线方 2 程A,0.0993C+0.0015(线性范围 2.0-8µg/mL, r=0.9969)。 1.5 显微镜及X-衍射仪鉴定分析 将NTD原料药及β-CD辅料、物理混合物、超声包合物样品的晶体，进行显微鉴定。并将以上四种样品粉末于模具中制成饼状，在X-衍射仪中分析，读出其强度I值，面间距d值和2θ值。根据所得衍射图数据，进行定性分析。 [3]根据K值法进行X-衍射的定量分析: ,W假如待测试样中含有n个相，要测定其中j相的含量，用其中的S相为内标物质。用和j ,，，W,W1,WW分别代表复合试样中待测相和S相的重量分数，待测相含量。 SjjS X-衍射定量分析原理是:物相衍射强度与其参加衍射的体积成正比，由此得到衍射强度公式，并推出多相试样中任一相衍射强度与其含量关系的普适公式。 Wj,ICK jjn 2,,W，，,jjmj,1j j1) 测定K值。将β-CD作为待测相，NTD作为内标相，制备待测相与内标相质量比S ,W为1:1的两相混合物样品，混合均匀后制成试样。对此情况，/W=1由普适式可得Sj jK=I/I。在混合试样的衍射峰中分别选择合适的待测相和内标物衍射峰各一个，精确测量SjSj它们的积分强度I和I。即可得到所需的K值。 jSS 2) 制备含β-CD及其包合物的复合试样。选用超声法制备的包合物，经丙酮洗涤，完全洗脱原料药，再掺入NTD，其含量不限，本复合试样中NTD与包合试样质量比为0.1;将其混合均匀后制成复合试样。 3) 测量复合试样。精确测量其中选定的待测物和内标物衍射峰积分强度I和I，所选jSj择的衍射峰及其测量条件应与测定K值时完全相同。 Sj4) 通过K值求得β-CD的含量。计算由待测相复合试样测得的I/I比值，利用预先SjS ,jW测定的K值，通过式(3-10)计算待测相复合试样中β-CD的含量，然后再由关系式Sj ,，，W,W1,W计算得到待测相的含量W。 jjjS 5) 计算复合试样中包合物相的含量，由于通过超声法制备的包合物，经丙酮洗涤后，只存在β-CD和包合物两相，所以包合物相的含量W=1,W。 Nj 1.6 精密度试验 以15,乙醇为溶剂，分别配制3.0µg/ml，6.0µg/ml，和9.0µg/ml三种高，中，低浓度的NTD溶液。三个浓度都在标准曲线线性范围内，用紫外分光光度计测定其吸光度，根据所得的标准曲线计算其实际浓度。同日内测定日内误差，连续3天测定日间误差。 1.7 加样回收率试验，包封率及包合物含主药(尼群地平)量的测定 精密称取NTD5mg，制成15,乙醇为溶剂的尼群地平溶液10ml。分别取0.3ml，0.6ml，0.9ml，置于50ml的容量瓶中。另取适量β-CD加入15,乙醇得饱和β-CD溶液，各取10ml置于3个容量瓶中，以15,乙醇定容，摇匀，在239nm处用紫外分光光度法测定，按标准曲线计算其实际浓度。 精密称取包合物4mg，加入15,乙醇，制成50ml的包合物溶液。吸取上述溶液5ml于50ml的容量瓶中，用15,乙醇稀释至刻度，摇匀。以15,乙醇为空白溶液，在239nm [4]处测定吸收度，代入标准曲线方程，计算包合物中药物含量和药物包封率。 样品收得率=(包合物的量/总投入物质量)×100, 包合物含药量,(样品中尼群地平的质量/包合物样品质量)×100, 尼群地平包封率,(样品中尼群地平的含量/尼群地平投入量)×100,。 1.8 溶解度及累计溶出度的测定 精密称取NTD15mg以及含有相同NTD量的包合物，分别加入10ml蒸馏水，室温(25?)放置，放置过程中,每天定时摇匀2次，至48小时，取上清液用0.45μ,微孔滤膜过滤，吸取续滤液8.5ml置10ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，于239nm波长处测其吸光度A，由标准曲线方程计算溶解度。 精密称取NTD10mg，相当含量的包合物及物理混合物，由于NTD在水中不溶，故选 [5]择以15%乙醇溶液900ml为溶出介质，采用转篮法，在温度(37?0.5)?，转速100r/min，分别在15、30、45、60min时吸取介质10ml(同时补加同温介质10ml)，经0.45μ,微孔滤膜过滤，取澄清滤液测其A值，计算累计溶出度。 1.9 光稳定性考察 分别取NTD及相当量的包合物，物理混合物，在照度为4500?500lx的强光照射30d后，测定样品中NTD含量并计算光照前后含量下降率。 含量下降率(%)=(光照前含量-光照后含量)/光照前含量×100, 2 结果 2.1 正交试验结果及分析 见表2。 表2 尼群地平-β-环糊精包合物制备正交实验结果表 Tab 2 The experimental results of orthogonal design of nitrendipine-β-CD preparation 实验号 超声功率 β-CD:NTD 温 度 超声时间 包封率(,) A B C D 1 1 1 1 1 18.61 2 1 2 2 2 17.10 3 1 3 3 3 13.34 4 1 4 4 4 25.81 5 2 1 2 3 37.48 6 2 2 1 4 27.44 7 2 3 4 1 22.46 8 2 4 3 2 35.72 9 3 1 3 4 25.99 10 3 2 4 3 49.23 11 3 3 1 2 20.20 12 3 4 2 1 6.68 13 4 1 4 2 13.95 14 4 2 3 1 5.65 15 4 3 2 4 14.62 16 4 4 1 3 58.50 K 74.86 96.03 124.75 53.4 1 G=?W 123.1 99.42 75.88 86.97 K22CT=G/16 K 102.1 70.62 80.7 158.55 32Q= ?K /4 nK 92.72 126.71 111.45 93.84 4 SS ,Q-CT R 48.24 56.09 48.87 105.15 Q 9944.76 10037.18 10063.48 11089.85 SS 302.5 394.92 421.22 1447.59 表3 包合物制备正交结果分析 Tab 3 Analysis of orthogonal results Dependent Variable: 包封率 Type III Sum of Mean Source Squares df Square F Sig. Corrected Model 2567.172(a) 12 213.931 1.026 .563 Intercept 9642.258 1 9642.258 46.227 .007 超声功率 302.501 3 100.834 .483 .717 投料比 394.918 3 131.639 .631 .643 超声温度 421.224 3 140.408 .673 .624 超声时间 1448.528 3 482.843 2.315 .254 Error 625.753 3 208.584 Total 12835.183 16 Corrected Total 3192.925 15 R Squared = 0.804 (Adjusted R Squared =0 .020) 表 4 单因素统计分析 Estimated marginal means Tab 4 Mean 超声功率 投料比 超声温度 超声时间 1 13.350 18.715 24.008 31.188 2 21.743 30.775 24.855 18.970 3 39.638 25.525 17.655 20.175 23.465 4 23.180 31.678 27.863 方差分析结果见表3、表4。结果表明，超声时间对主药包封率的影响最大，其次为主客分子的摩尔比和超声温度，而超声强度在所测范围内对包封率没有产生显著性影响，四个因素对包封率的影响顺序为D,B,C,A。由单因素统计分析表可以得出，因素A选取水平2;因素B应取水平4;因素C应取水平1;因素D应取水平3(因此，包合物制备的最佳工艺条件为ABCD(即超声功率为40KW;β-CD:尼群地平为4:1(摩尔比);超声温3413 度为20?;超声时间为70min。 2.2 包合方法比较 采用超声波法最佳工艺制备包合物，由紫外分光光度法测试，得到: 表5 三种包合物制备方法的比较 Tab 5 The comparison of three kinds of preparation methods 方 法 收得率/% 包合物含药率/% 包 封 率/% 饱和水溶液法 62.08 9.12 11.58 超声法 63.16 16.2 74.68 研磨法 69.88 7.65 4.6% 以包封率为指标，超声波法的包封率明显优于研磨法和饱和水溶液法;研磨法的收率较优，推测原因是研磨法中蒸馏水的用量较少，包合物和原料药在抽滤和洗涤的过程中损失的较少。由于包封率指标为方法考察上的主要标准，因此判断超声波法来制备较优，且超声法操作更加简便，可用于制剂生产。 2.3 包合物的物相鉴定 2.3.1 显微鉴定 分别取NTD、β-CD 、NTD与β-CD物理混合物、超声包合物，重结晶后，置于光学显微镜下，放大40倍观察。β-CD晶体为矩形状结晶体;NTD晶体呈长的薄片状;NTD与β-CD物理混合物其形态与各自原本形态无变化，可见纯物理混合不能形成满意的包合物;NTD-β-CD包合物形态与之前发生变化，呈不规则颗粒状结晶。(图略) [6] [7] 2.3.2 X-射线衍射鉴定与定量分析 X-射线衍射法扫描图特征峰数值，见X-衍射数据表6。 从上述图表所得结果可知，与NTD和β-CD的各自三大特征峰相比，物理混合物的三大特征峰，均来自NTD和β-CD的各自特征峰的累加，但是强度均有所降低，这是由于混合物中各个物质的量相对于纯物质都有所减少而导致。在包合物的三大特征峰中，第二特征峰U2来自于β-CD中的第一特征峰C1，表明包合物中仍有未形成包合的β-CD;由于超声作用使β-CD的微粒变小或量的减少，使得其衍射峰的强度有所降低。第一和第三特征峰(U1、U3)都是区别于NTD和β-CD的新峰，因此证明已有一种新的物相包合物产生。 表6 X-衍射数据表 Tab 6 Table of X- diffraction data 测定物 三大特征峰 2θ角度 面间距(d) 强 度 N1 24.328 3.656 100 尼群地平 N2 10.054 8.791 62 N3 27.382 3.254 58 C1 12.444 7.107 100 β-环糊精 C2 19.482 4.553 79 C3 20.743 4.279 80 M1 24.328 3.656 100 物理混合物 M2 12.444 7.107 36 M3 27.382 3.254 63 U1 18.751 4.728 100 超声包合物 U2 12.444 7.107 79 U3 34.685 2.584 52 定量分析结果如下: 1)从对尼群地平和β-环糊精分别进行的衍射测定结果中，找出强度最大(相对强度为100)的峰，其面间距d值和2θ值为: 尼群地平: d,3.656 2θ,24.328 β-环糊精: d,7.107 2θ,12.444 2)对待测相β-环糊精(j)与内标相尼群地平(s)的X衍射测定，在混合试样的衍射峰中分别选择d值为3.565和7.107的衍射峰，其积分强度I,5632 ，I,1614。于是 SjjK,I/ I=0.287 SjS 3)对待测复合试样中选定的待测物β-环糊精进行X衍射测定，在复合试样的衍射峰中分别选择d值为3.656和7.107的衍射峰，其积分强度I,2008，I,2822。通过公式: Sj ,IWjjj K,SIWSS j 其中W=0.1，K,0.287 SS ,W所以，复合试样中β-环糊精含量,0.248 j ,，，W,W1,W计算得出15号包合物试样中β-环糊精的含量为27.56,。 再通过公式:jjS 所以由超声法制备的包合物试样中，纯包合物的含量为:72.44,。 纯包合物含量=(样品中包合物的质量/包合物样品质量)×100, 假设NTD与β-环糊精以1:1的形式包合，则将实验数据代入上式及包合物含药量的公式可得:包合物含药量为19.01%，与此前的实验值16.2%相近。 2.4 精密度实验 精密度实验的浓度计算结果为:标准曲线上高、中、低3种浓度的尼群地平溶液的日内变异系数(RSD%)平均为1.19%和日间变异系数(RSD%)平均为2.54%。说明NTD在介质中是稳定的。 2.5 加样回收率试验 根据公式:加样回收率,实测浓度/理论浓度。计算得其平均回收率为99.91%，RSD为0.83%，符合中国药典规定的?2,的变化范围。表明NTD在15%乙醇及β-环糊精溶液中的回收率较好。 2.6 含药量试验结果 超声波最优条件下制备的包合物其原料药包封率为75.99,77.48,，含药率为9.83,10.02%。 2.7 溶解度及累计溶出度测定结果 根据吸光度计算溶解度值，得到尼群地平、超声包合物的溶解度分别为(0.81?0.02)mg/l和(8.48?0.07)mg/l。可见，尼群地平、包合物溶解度有显著提高，约为原料药的10.5倍。 运用转篮法得到三种样品在15、30、45、60分钟时的溶出度值。 4.5 4 3.513 2.522231.5 1 Dissoloved rate(%)0.530 015304560 Time(min) 图1 不同时间的药物累计溶出度(%) Fig 1 Dissolution profile of nitrendipine with different treatment 1-NTD-β-CD inclusion; 2-mixture of drug and β-CD; 3-material drug 由上图可知，制备出的包合物溶出情况较好。在60min时，包合物的累积溶出百分率约为NTD的2.14倍，而相同配比的物理混合物此时与NTD的溶出率相近。可见包合物能明显增强难溶性的NTD的溶出速率。 2.8 光稳定性考察 由于NTD的畏光性，故选择光照因素考察比较形成包合物后NTD的光照稳定性。在长期强光照射后，NTD颜色明显变深，混合物跟包合物颜色变化不大。经紫外分光光度法测试计算后，NTD在原料药中的降解率为15.5%，物理混合物中降解率为9.6%，包合物中降解率则为4.2%，远低于前面两项，证明NTD形成包合物后光稳定性增强。 3 讨论 3.1 通过对比尼群地平与β-CD不同工艺的包合制备结果，以及包合物与原料药NTD的测定结果对照，试验结果表明:饱和水溶液法的收率虽然较高，但是含药率低，最佳条件下超声波法制备包合物平均包封率为74.68%，平均含药量为16.2%，综合而言，优于饱和水溶液法跟研磨法。 3.2 从结构大小看，β-CD分子空洞内径深度均0.7-0.8nm，在物理作用下可容纳NTD分子。包合后的新物质形成了特定的内部晶体结构，可以根据其衍射花样与原料药辅药的衍射花样比较进行成分鉴定。再以混入试样中的纯原料药的衍射线作为参考，代入K值法公式求解，得到包合后样品中包合物的纯含量为72.44,，含药量理论值为19.01%，与实验值相近。 3.3 超声波法制备时，超声振动加强，令分子热运动加剧，促进NTD分子向β-CD疏水空腔运动，可提高包合率。原料药见光后易被氧化，被包合后，其不稳定部分被包合在β-CD的空穴中，一定程度上切断外界的影响，使光稳定性提高，也证明了NTD-β-CD包合物的形成。 PEFERENCES [1] G.Antolic，F.Kozjek，S.Primozic.The relevance of nitrendipine erythrocyte partitioning for the variability of its bioavailability parameters[J].International Journal of Pharmaceutics,2001，215:147-152. [2] Ding YF,Yao Y,Zhou YB.Study on inclusion complex of nitrendipine-β-cyclodextrin[J].Chin Hosp Pharm J,2003,Vol 23(8):461-463. [3] Guan QQ,Lin TM,Ding ZY, Jing XQ,Wang ES.Preparation of inclusion complex of nitrendipine-β-cyclodextrin[J].Journal of Jilin University(Medicine Edition),2005,Vol 31(5):811-813. [4] Tong LH.Cyclodextrin Chemistry[M].Beijing:Science publisher,2001:235-238. [5] Zhou SQ.The Analyse of X-ray Diffraction[M].Chongqing:Chongqing University Publisher,1991:135-142. [6] Zhang QR,Wu CL,Shan LH,Liu YK,Li LC.Improvement technology for the ultrasonic extraction of zein fron corn gluten meal[J].Journal of Zhengzhou University(Medical Scienses),2005,Vol 40(5):913-915. [7] Wang LL,Zhen WS.Inclusion Effects ofβ-CD and HP-β-CD on Monobenzone[J].Chin Pharm J.2006,Vol 41(7):529-531. [8] Elisma Spamer, Douw G. Muller, Philippus L. Wessels, Johannes P. Venter.Characterization of the complexes of furosemide with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and sulfobutyl ether-7-β-cyclodextrin[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2002,16:247-253. [9] Shen YL, Ying W, Yang SH, et al.Determinations of the inclusion complex between gossypol and beta-cyclodextrin[J].Spectrochimica Acta Part A-molecular and Biomolecular Spectroscopy,2006,65(1):169-172.