一种球形纤维素／钛白粉扩张床吸附剂的研究——组成对性能的影响

一种球形纤维素／钛白粉扩张床吸附剂的研究——组成对性能的影响 一种球形纤维素,钛白粉扩张床吸附剂的 研究——组成对性能的影响 第1期 2004年2月 高分子学报 ACTAPOLYMERICASINICA No.1 Feb.,2004 一 种球形纤维素/钛白粉扩张床吸附剂的研究 —— 组成对性能的影响 雷l林林东强姚善泾朱自强 (‘浙江大学化学工程与生物工程系杭州310027) (浙江大学宁波理工学院生物与制药工程系宁波315100) 摘要采用反相悬浮再生法,以超细钛白粉颗粒作增重剂,包埋于纤维素骨架之中,经环氧氯丙 烷活化后与 二乙胺连接,制得一种球形扩张床吸附剂.研究表明,吸附剂的密度,机械强度和孔结构可以 随钛白粉用量的 变化而改变;钛白粉颗粒的掺入有利于基质的活化,活化后环氧基含量可达220pmol/mL.吸 附剂具有良好的 扩张床性能,扩张床中的蛋白质吸附行为与填充床中相似,吸附容量为48.9mg牛血清白蛋 I~/mL吸附剂. 关键词纤维素,钛白粉,复合微球,扩张床吸附,蛋白质 扩张床吸附(Expandedbedadsorption,EBA)技 术能直接从发酵液,细胞培养液或匀浆液中捕获 目标产物,集固液分离,浓缩和初期纯化于一个操 作单元之中,近年来在生物工程下游过程中的应 用十分广泛’.吸附剂是EBA过程的关键,为达 到接近于填充床的分离效率,必须确保吸附剂颗 粒在扩张床内能够适度膨胀,并停留在各自特定 的位置.因此,需要对扩张床吸附剂进行特殊的设 计,譬如密度,粒径及其分布,功能基团种类及其 数量等. 纤维素是自然界中最丰富的天然高分子,价 格低廉,由此制备出的球形基质具有良好的亲水 性和大孔特征,易于活化,衍生出各类吸附剂,在 生物工程领域应用十分广泛.Gilchrist等曾采 用纤维素作基质骨架,复合钛白粉微粒制备出扩 张床吸附剂.但这种基质系经过研磨,筛分而得, 具有不规则的形状,这将降低过程的稳定性,并可 能导致重复性不佳的洗脱行为. 我们曾采用经典的”反相悬浮热再生”法,以 超细钛白粉作增重剂,包混于纤维素黄原酸酯黏 胶之中,再生得到了纤维素/钛白粉复合微球,并 研究了它在扩张床中的流体力学性能.本文拟 以此微球为EBA的基质,经环氧氯丙烷活化后与 二乙胺偶联,制备出一种扩张床吸附剂,然后测试 该吸附剂的扩张床性能和蛋白质吸附能力,为随 后的实际应用提供必要的数据.经典的纤维素两 相共存学说认为,纤维素结构中存在分子链紧密 排列的结晶区和分子链疏松堆砌的无定形区,两 相的化学反应能力悬殊.超细钛白粉颗粒的掺 入有可能影响再生纤维素的两相结构,因此本文 还将讨论钛白粉用量对微球活化反应的影响. 1实验部分 1.1材料 纤维素黄原酸酯黏胶,粘度4×10,9×10 cSt,纤维素含量7.5%(W),自制;钛白粉,金 红石型,0.2,0.4nl,华东理工大学气流粉碎中 心;牛血清白蛋白(BSA),riffs,上海生工生物工程 有限公司;StreamlineDEAE,瑞典Ame~ham Biosciences公司;其余均为市售化学纯. 1.2微球制备 取100g黏胶和一定量的钛白粉,混合均匀, 加入到含有200mL氯苯和400mL泵油的三口烧 瓶中,搅拌分散0.5h,升温至90~C,保温1.5h固 化成球.热水洗涤微球数次,并于醋酸一甲醇溶液 中充分再生,水洗后筛取100,300,ttm组分. 1.3活化与偶联 取6mL微球,加入12mL3.0mol/LNaOH溶 液和2.4mL环氧氯丙烷,25?下反应8h;反应物 经丙酮抽提后测定环氧基含量.取活化微球 6mL,加入18mL二氧六环和18mL二乙胺,55? 下反应12h,得到扩张床吸附剂Cell—TiDEAHP *2003.01-06收稿,2003—03-06修稿;国家自然科学基金资助项目(基金号20206029)和教育 部留学回国人员科研启动基金资助项目; **通讯联系人 1期雷引林等:一种球形纤维素/钛白粉扩张床吸附剂的研究——组成对性能的影响4l (Diethylaminohydroxypropy1).制备路线如图1所示. .H…一HO--CH2--fi ,NH-~CH2+?- Matrix(Cell-Ti)Epichlorohydrin(ECH) [.一厂OHH/CH2--cCH/CH2--CH3HN\CH厂CH3 Diethylamine(DEA) Fig.1PreparationschemeofanionadsorbentCell-TiDEAHP 1.4吸附等温线 取14mL吸附剂,用50mmol/LTris—HC1(pH 7.5)缓冲液平衡,分为7等分,各加入50mL不同 BSA浓度的缓冲液,30cI=下振荡8h,测定蛋白质 浓度,根据物料衡算绘制出吸附等温线. 1.5扩张床性能 实验采用Streamline25扩张床(Amersham biosciences).扩张率E定义为床层扩张高度与 填充高度之比.测定一系列流速下的扩张率, 以衡量吸附剂的扩张床性能. 1.6蛋白质吸附曲线 分别取20mL和75mL吸附剂,注入到XK 16/20层析柱和Streamline25扩张床中,用缓冲液 平衡后进样,测定流出液中的蛋白质浓度,得到吸 附曲线. 1.7表征方法 离子交换容量测定采用HC1一NaOH滴定法; 湿真密度(P.)测定采用水替换法;烘干收缩率 (Sr)定义为Sr:(V.一V),,其中.,分别 为烘干前后微球的体积;孔比表面积(S)测定采 用次甲基兰吸附法;湿态孔度(P)和孔容(V)由 含水率(?),水密度(P)及P.计算而得..:P: P.×?/p,V:co/(1一?);红外图谱分析采用 KBr压片法. 2结果与讨论 2.1钛白粉用量对基质物理性质的影响 首先研究了复合微球的一些物理性质随制备 时钛白粉添加量的影响,结果如图2所示.研究表 明,随着钛白粉用量的增加,微球的密度几乎成线 性增加,钛白粉颗粒能有效地包埋到纤维素 骨架之中,确实起到了增重的作用.而微球的含水 率,孔度,孔容和收缩率则随钛白粉用量的增加而 下降,这主要是由于钛白粉颗粒占据了微球的一 部分空间,另外还起到了一定的支撑作用,阻碍了 纤维素高分子链失水时进一步收缩.值得关注的 是比表面积存在一个峰值,暗示出在钛白粉用量 较少时,再生纤维素高分子链可以包附在超细颗 粒周围,导致大量微孔的形成;而钛白粉用量过大 反而会占据一部分孔道,导致比表面积的下降. 90 80 70 一 电60 50 40 q E 一 7 6 l 0 TiO2/viscose(g/g) Fig.2EffectsofTiO2dosageOYIphysicalpropertiesof compositebeads a),PpandSr;b)V,SandP 2.2钛白粉用量对活化反应的影响 如前所述,钛白粉超细颗粒的掺入,可能会改 变再生纤维素的”两相结构”的比例,进而影响到 环氧活化时的反应能力.先固定钛白粉的用量为 42高分子学报2004焦 黏胶重量的10%,并以不加钛白粉时的纤维素微 球作对照,考察了在相同反应条件下活化效果随 反应时间的变化(图3).结果显示钛白粉的掺入 导致活化微球的环氧基含量大幅增加,达到最大 活化量所需的反应时间也缩短1,2h,说明超细 颗粒的加入使再生纤维素中产生了更多的”无定 形区”,有助于活化反应的进行.图4进一步比较 了不同钛白粉用量时的活化效果(反应时间为 8h),结果表明环氧基含量随钛白粉用量的变化 也存在一个峰值,这与微球比表面积随钛白粉用 量的变化规律是一致的.因此,本文选取TiO,与 黏胶重量比为0.1作为最佳条件进行偶联反应制 备吸附剂. E 0 E i— 0 ? 0 山 Fig.3Activationresultsatserialreactiontimes Fig.4EffectofTi02dosageonactivationreaction 2.3红外图谱 对比纤维素微球(Cellulose),复合微球(Cell- Ti),活化微球(Cel1.TiECH)和吸附剂(Cell—Ti DEAHP)的红外吸收图谱(图5),发现Cell—Ti在 682cm处有强烈的吸收,这主要是Ti—O的伸 缩振动引起的;Cel1.TiECH在1244,937和 852cm处有吸收峰,这是环氧基的特征峰;而 Cell—TiDEAHP在这些位置没有吸收峰,间接说明 了环氧基在与二乙胺反应时消耗殆尽(三级胺中 C—N的吸收峰易与C,C的吸收峰重叠).因此, 红外图谱分析印证了制备过程中各阶段反应的有 效性. 3Oo02000l000400 Wavenumber(cm一’) Fig.5Infr~edsoec~aofbeadsatvariousstages 2.4吸附等温线 表1列出了所制备的两种吸附剂的理化性 质,并与商用扩张床吸附剂StreamlineDEAE作比 较.其中,Cel1.Ti.2DEAHP由于具有更高的纤维素 含量,可使更多的羟基被活化,利用,因而其交换 容量比Cell—Ti一1DEAHP高.进而研究了上述3种 吸附剂对BSA的吸附等温线,结果发现三者都符 合Langmuir等温式(图6).对实验数据进行拟合, 求出Cel1.Ti.1DEAHP的平衡吸附容量Q为 47ms/mL,解离常数为0.35rag/mL;Cell—Ti一2 DEAHP的Q为61ms/mL,Kd为0.11mg/mL,与 StreamlineDEAE的Q=69ms/mL,Kd= 0.04mg/mL相差不大.说明适当增加基质中纤维 素的含量可以制备出吸附容量更高的吸附剂. 2.5扩张床性能 在一系列流速下测试了吸附剂的扩张率 (图7),流动相为蒸馏水,起始床层高度H.= 15.0cm.结果证明吸附剂具有很好的扩张床性 能;应该指出,当扩张率为2.5时,Cell—Ti一2 DEAHP的操作流速为480cm/h,高于Streamline DEAE的340cm/h,说明前者能够满足更高操作流 速的需要. 2.6蛋白质吸附曲线 比较了Cel1.Ti.2DEAHP和StreamlineDEAE 1期雷引林等:一种球形纤维素/钛白粉扩张床吸附剂的研究——组成对性能的影响43 Note:TiO2/viscose(,W)=10/100,celluloseinviscose6.0%forCell-Ti-Iand7.5%forCell-Ti-2 在填充床和扩张床中的蛋白质吸附行为,结果见 图8(BSA浓度c.:1.0mg/mL).发现在相同的操 作流速下,两者的扩张床吸附行为与填充床中的 情形都很相似,证实了扩张床内的流动性能接近 于填充床.定义10%穿透时的吸附容量为Q., E E — 一 BSA(mg/mL) Fig.6BSAadsorptionisotherms AppliedBSA(mg/mL) 100%穿透时的吸附容量为Q,将两者的吸附曲 线进行比较,结果列于表2,说明Cel1.Ti.2DEAHP 的扩张床吸附性能与商用吸附剂相当. 综合上述实验结果,通过反相悬浮热再生法, 将超细钛白粉包埋于纤维素骨架之中,经环氧 一 Linearvelocity(cm/h) Fig.7Expansiondegreesatserialflowrates AppliedBSA(mg/mL) Fig.8BSAbreakthroughcurvesinpackedandexpandedbeds a)Cel1.Ti-2DEAHP;b)StreamlineDEAE Note:PB?packedbed;EB-expandedbed 高分子学报2004矩 氯丙烷活化后与二乙胺反应,制得了一种球形扩 张床吸附剂.研究表明,钛白粉颗粒不仅起到了增 加基质密度的目的,还有利于基质的活化;适当增 加基质中纤维素的含量,可以得到交换容量更大 的吸附剂.钛白粉与黏胶重量比为0.1,黏胶中纤 维素含量为7.5%时,所制备的吸附剂具有很好 的扩张吸附性能,能够满足扩张床过程较高操作 流速的需要. REFERENCES HjoahR.’IkIldsBiotechnol,1997,15:230,235 HuHB(胡洪波),LinDQ(林东强),YezJ(叶子坚),MeiLH(梅乐和),YaoSJ(姚善泾),ZhuZQ(朱自强).JChemEngC~neseUniver (高等学校化工学报),2000,14:139,144 kiYL(雷引林),YaoSJ(姚善泾),”uzz(刘坐镇),ZhuZQ(朱自强).JFunctPolym(功能高分子学报),2002,15:219,224 ~tambergJ.SepPurifMethods,1988.17:155,183 GilchristGR,BurnsMT,LyddiattA.SolidphasesforproteinadsorptioninHqu~dfluidizedbeds.In:Pyle DLeds.SeparafiomforBiotechnology3. London:RoyalSocietyofChe~stry,1994.186,192 LeiYL,LinDQ,YaoSJ,uuzz,ZhuZQ.C~neseJChemEng,2003,11(2):141,145 GaoJ(高洁),TangLG(汤烈贵).CelluloseScience(纤维素科学).Beijing(:1~京):SciencePress(科学 出版社),1996.64,67 SundbergL,PorathJ.JChromatogr,1974,90:87,98 KaewprasitC,HequetE,AbidiN,GourlotJP.JCottonSci,1998,2:164,173 ZhangLN,ZhouJP,YangG,ChenJH.JChromatogrA,1998,816:131,136 ASPI|口EmCALCELLIJ】LoSE/Tio2ADSoRBENTFoR EXPANDEDBEDADSoRP.rIoN —— EFFECTSOFCOMPOSITon,clarification,andinitialpurificationintoasingleunit.OneofthekeypointsinEBAprocessesisthe choiceofasuitablematrix.Inthispaper,anewtypeofsphericalcellulose—TiO2compositematrixforEB Awas preparedthroughthemethodofwater-in—oilsuspensionthermalregeneration.Afteractivatedbyepichlorohydrinand attachedwithdiethylamine,thematrixWasderivatedtofunctionasananionexchangerforEBA.Theeffectsofthe contentsofTiO2andcelluloseinmatrixonitspropertieswereinvestigatedindetails.ItWasfoundthatTiO2notonly actedasadensifiertoimpa~anincreaseddensitytothematrix,butalsobenefitedtheactivationreactionby epichlomhydrin,givingtheactivatedmatrixanepoxygroupcontentof220~zmol/mLadsorbent.Theprepared adsorbentshowedafavorableexpandedbedperformanceandcouldbeusedwithhiigherlinearvelocitythanthatof thecommercialStreamlineDEAE.Thesimilarproteinadsorptionbehaviorbothinexpandedbedandinpackedbed Wasfoundwiththemaximumdynamicadsorptioncapacityof48.9mgbovineserumalbumin(BSA)/mLadsorbent. Theresultsindicatethecustom—madeadsorbentcallbeappliedtotheexpandedbedadsorptionofproteins. KeywordsCellulose,Titaniumoxide,Compositemicrosphere,Expandedbedadsorption,Protein l23456789”