犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性（可编辑）

犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性（可编辑） 犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性 北 京 大 学 学 报 医 学 版 . . .论 著 犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性 杨 杰,赵玉鸣,王文君,贾维茜,葛立宏 北京大学口腔医学院?口腔医院儿童口腔科,北京摘 要 目的:分离培养比格犬犬根尖牙乳头干细胞并研究其生物学特性。方法:拔除 犬上颌年 轻恒前牙,切取根尖牙乳头,采用酶消化法分离培养 犬根尖牙乳头细胞,进行成纤维细胞克隆形成实验、生 长曲线测定、多向分化能力研究及间充质干细胞相关面标记物.、 和 的表达分析,并将其移植至 免疫缺陷鼠皮下观察矿化组织的形成。结果:犬根尖牙乳头组织中存在一群具有高度增殖能力的细胞,在 相同培养条件下,其克隆形成率明显高于人根尖牙乳头干细胞,差异具有统计学意义 .;所获得 犬 根尖牙乳头干细胞具有成骨、成脂和成软骨等多向分化能力;在体外经成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可 形成脂滴,成软骨诱导后免疫组织化学染色?型胶原阳性表达;同时该群细胞. 和阳性表达,而阴性表达;与羟基磷灰石混合移植于免疫缺陷鼠皮下可形成矿化组织和牙髓.牙本质复合体样结构。结论:犬根尖牙乳头中存在具有高增殖能力和多向分化能力的根尖牙乳头干细胞。 关键词 根尖牙乳头干细胞;细胞增殖;多向分化;犬 中图分类号 .文献标志码 文章编号?: . /. . ? . . . , ,,, ?,? , , , : .: ’. .., : , , . , ? . : , ’ , ?. ., ?. , . ?. . . . 。??. : ’ .;; ; 牙乳头是牙齿发育过程中成牙本质细胞的来 发育完全的人根尖牙乳头中分离出一种新的牙源 性间充质干细胞,并将其命名为根尖牙乳头干细 源,根端部的牙乳头在上皮根鞘 ’ ? 胞 , , 是 , 的信号下,使邻近未分化的 间充质干细胞分化为成牙本质细胞,参与根部牙 存在于未发育完全牙齿根端牙乳头组织中的间充 本质的形成。 等?于年首次从未 质干细胞,在牙根的形成和发育中起着重要的作 基金项目:国家自然科学基金资助’ ? . ..网络出版时间:: : 网络出版地址: ://. . / / / . . . ... 北 京 大 学 学 报 医 学 版 用心 ;同时, 还显示出不同于牙髓干细胞 头,用同样方法培养人 。 . 犬 成纤维细胞克隆形成单位 , 的生物学特性,如: . ,? 及生长曲线 具有更强的群体倍增能力、端粒酶活性、迁 测定 移率以及成牙本质能力。 取第 代犬和人 用 . % 质量 近年来,随着干细胞在口腔领域研究的广泛 开展,牙源性干细胞受到越来越多的关注, 分数 乙二胺四乙酸二钠, . % 质量分数 胰蛋 亦成为研究的热点。鉴于伦理学限制和实际操作 困难。牙源性干细胞的研究尚处于体外实验和动 白酶消化,制成单细胞悬液,以 个/皿的密度接 物实验阶段。本研究旨在对犬 进行 种于 的培养皿中,每 天换液 次。 后使用 % 质量分数 多聚甲醛固定, . %甲苯胺 分离培养,并对其进行增殖能力检测、多向分化能 蓝 美国公司 染色显示集落数,分别记录 力研究及表面标记物分析,以证明 犬犬和人 在 个以上的克隆数,重复 的存在。 次,进行统计学分析。 与方法 取第 代犬和人 单细胞悬液以 个/: 接种于 孔板,每组 个复孔, ?, . 实验动物 雄性驯化纯种 周龄犬,由北京玛斯 %培养 ,更换培养基,每孔加入 生物技术有限公司提供,遗传背景清楚明确,饲养于 . 细胞增殖一毒性检测试剂盒, . ,日本同仁研究所 , ?孵箱孵育 . 后 北京大学口腔医院,饲养级别为清洁级。 周龄 免疫缺陷鼠,由北京维通利华实验动物技 将 孔板置于酶标仪 , 内,以波 术有限公司提供,遗传背景清楚明确,饲养于北京大 长 ,参比波长,测定各孔光密度值 学口腔医院,饲养级别为无特殊病原体 ,记录结果。连续检测 ,重复 次, , 级。软件统计 值。以细胞接种和检测的天数 本研究通过北京大学生物医学伦理委员会审 为横坐标, 值为纵坐标绘制犬和人 查,批准号为 。 生长曲线。 . 细胞培养 .犬 多向分化能力研究 . . 犬 的培养 使用 % 质量分 按照以往文献报道的方法,对的体外成 数 戊巴比妥钠按 / 体重剂量静脉注射于 骨分化、成脂分化和成软骨分化等多向分化能力进周龄 犬,进行麻醉,采用分角线投射技术 行检测。 拍摄上颌前牙根尖片,观察到上颌第三切牙牙根形 成骨分化:将第 代犬 以 × / 成/ ,拔除该牙,使用无菌组织剪沿牙根末端分离 孔的密度接种于 孑 板,培养至 %汇合后,成骨 根尖牙乳头 图 。将分离的犬根尖牙乳头立即在 诱导组更换成骨诱导培养液 表 进行培养,对照 含有双抗链霉素.青霉素 的 液中反复浸 组继续用细胞培养液培养,每 天换液,后 % 泡,剪碎后加入的 / 型胶原酶 美国 . 多聚甲醛固定,磷酸盐缓冲液 公司 和 /酶 美国公司 轻 , 漂洗, %茜素红 . ,美国 轻震荡, ?消化 ,过 的细胞筛 美国 公司 染色,肉眼及镜下观察。公司 后获得单细胞悬液,加入培养基 成脂分化:用同样的方法将第 代 犬 . ’ ,美国公司, 接种于 孔板,培养至 %汇合后,成脂诱导 含 % 体积分数胎牛血清美国 公司 、 组更换成脂诱导培养液 表 进行培养,对照组继/ 谷氨酰胺、 × / 青霉素、 / 续用细胞培养液培养,每 天换液,后 %多聚 链霉素 中和,/ 离心 ,弃上清,使用 甲醛固定,漂洗, . %油红 美国 公 培养基重悬,接种于 培养皿,于 ?, 司 染色,镜下观察。 成软骨分化:将第 代 犬根尖牙乳头 %体积分数 :孵箱中培养, ~ 天换液 次, 干细胞消化,制成单细胞悬液,调整细胞浓度为 待细胞生长汇合,消化收集细胞,传代培养。 × / ,转移至 离心管, / 离 . . 人的培养 取临床拔除的 岁男性 心 ,轻拍使细胞团从管壁分离,加入成软骨 患者下颌阻生第三磨牙,沿牙根末端分离根尖牙乳杨 杰,等 犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性 诱导培养液 表,每 天换液,后 %多聚 察?型胶原的表达。 甲醛固定,包埋,制备 切片,脱蜡至水, % .犬 免疫组强化学分析 : :室温孵育 ,阻断内源性过氧化物酶, 将第 代 犬 以 个/孔的密度 洗× 次,正常山羊血清封闭 ,滴 接种于 孔板中爬片生长,培养后用 %多聚 加人兔抗人?型胶原 中国中杉金桥生物技术公 甲醛固定。 % :室温孵育,阻断内源性 司 单克隆抗体,将切片置湿盒 ?下过夜。次 过氧化物酶,洗× 次,正常山羊血清封 日,切片置室温 复温,洗× 次,滴加 闭 ,分别滴加鼠抗人 . 稀释梯度 入生物素标记二抗工作液,室温 ,洗 : ,美国 公司 、兔抗× 次,滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液,室 人 工作液,中国中杉金桥生物技术公司 和 温 ,洗 × 次,光镜控制下 兔抗人工作液,中国中杉金桥生物技术公司 室温显色。对照组用代替一抗,余步骤同前。 单克隆抗体,将切片置湿盒下过夜。余步骤同 用苏木精复染,脱水透明,中性树胶封片。光镜观 上述成软骨诱导分化?型胶原免疫组织化学染色。 表 干细胞多向分化诱导液配方和鉴定方法 , , ; , ’, ;,, ;,, ;, , ; 一 , , . . 犬 免疫缺陷鼠皮下移植实验。细胞可以稳定传代,传至 ? 代时细胞形态 变异不能用于进一步研究。 取第 代 犬 消化后,调整细胞 浓度为 × / ,加人到与培养基共浴的 犬 的? 平均为个集落/ 细胞 图 , ,人 的. 平均为 羟基磷灰石, ,中国意华 健公司 中混合培养后, / 离心 个集落/细胞 图 , ,二者克隆形成率差异 ,弃上清,将细胞和 混合物移植于 周 具有统计学意义 . 。通过 法绘制 龄 一 免疫缺陷鼠背部皮下, 周后处死 生长曲线可见犬 生长速度快于人动物,取出移植物, 脱矿 周, %多聚甲醛 图 。 . 犬 多向分化潜能研究 固定,包埋,制备 切片,行染色观察硬 经成骨及成脂肪诱导分化后的 犬 组织形成情况。 可以形成矿化结节和脂滴,对照组无矿化结 . 统计学分析 应用. 进行统计学分析, 犬和 节和脂滴形成。经成软骨诱导分化后形成的 软骨细胞球可见?型胶原阳性表达,对照组阴性表 人 的. 之间比较采用 检验,. 为 达 图 ? 。 差异有统计学意义。 .犬 表面标记物免疫组织化学分 结果 析 犬 上 . 、 呈阳性表 .犬分离培养及生长趋势检测 经酶消化法获得的 犬 与人 达,而 呈阴性表达 图 ~ ;对照组全部为 阴 形态相似,较为短小,呈典型成纤维细胞形态 图 性表达。