【doc】斑头雁（Anser indicus）高铁血红蛋白的晶体生长和初步的X—射线...

【doc】斑头雁（Anser indicus）高铁血红蛋白的晶体生长和初步的X—射线... 斑头雁(Anser indicus)高铁血红蛋白的晶 体生长和初步的X—射线... 第卷.辅生物物理 1口89年9月 =一—===—一一 斑头雁 ACTAB10PHYSICASIICA (Anserindicus) V0】.5N0.3 Se1J.1989 高铁血红蛋白的 晶体生长和初步的x一射线衍射研究 卢光莹毛春虹卫新成华子千顾孝诚 (北京大学生物学系) 擅要 本文报导了斑头~(Anserindietts)高铣血红蛋白的晶体生长和初步的晶体学研究.晶体 的衍射分辨率为2.5A或更好,四方晶系.空间群为P4,2-2,晶胞参数为;a;b:80.8A, c:107.3A,V=700523A~.每个晶胞中含4个四聚体分子,每个不对称单位中含半个四聚体分子 引言 自从Perutz用x一射线衍射方法首先对马血红蛋白进行了晶体结构之后,人们对 其它生物特别是人的各种类型的血红蛋自进行了结构分析.目前,血红蛋自是结构与功能 的关系研究得最广泛,最深入而且也是最清楚的蛋自质之一,但有关鸟类血红蛋白的晶体 学研究刚很少. 斑头雁(Aaseriadlcus)是一种候鸟,生活在海拔3—4,000米的我国青海高原.它能高速 飞越海拔7,500米以上的喜玛拉雅山脉,迁徙到接近海平面高度的冬栖地.斑头雁在氧气 还不足大气压氧分压的二分之一这样的高度下作长距离高速飞行,所受到的主要生理 学压力是缺氧.它的血红蛋白或血液必定具有独特的,有效的分子适应机理,能在迁飞期 间从稀薄的空气中将氧结合并运输和释放给急需氧的肌肉组织m. 斑头雁血红蛋白的一级结构已经测定I,这将有助于我们用x一射线衍射方法测定其 晶体三维结构,以揭示斑头雁血红蛋白的结构与功能关系.本文报导了斑头雁高铁血红蛋 白的晶体生长和初步的晶体学研究. 实验 斑头雁购自北京动物园JSephadexG-100为Pharmacia公司产品,PEG10000和PEC 6000为Merck公司产品}其它试剂均为国产分析纯试剂. 实验方法和结果 一 ,离铁血红蛋白的嗣备和纯化I取斑头雁新鲜静脉血,与5柠檬酸钠溶液以体 260生物物理l98~-'T- 租比9:1迅速混匀.2500r.P.m.离心5分钟,除去上清液,得到红血球并用0.82NaCI生 理盐水洗涤三次.然后加入与红血球等体积的水和0.5体积的CC1t,猛烈振荡5分钟, 4000r.P.m.离心20分钟.吸出上层溶血液,置4?冰箱中备用. 取上述溶血液6ml,加入固体K3Fe(CN)~2O0mg,充分混匀".反应10分钟后,对 0.01mol/LNaC1溶液彻底透析.然后经Sephadex-1OO柱进行层析.用0.01tool/INaC1为洗 脱液,藉助于紫外监测仪收集血红蛋白峰[图1,峰I].吹风浓缩至较小体积后,改用 PEG]00O0进行浓缩.再对0.O05mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)彻底透析后,置于4?冰箱中 保存供晶体生长用. Fig.i.ThepurificatioaofMet—HbbyFig. 2.Crysta1.0.7×04x0.3mm SephadexG一】00eoluma(3X40cm) 二,晶体生长:用悬滴式蒸汽扩散法生长晶体.悬滴中为5#1血红蛋白溶波,2#1 20PEG6000和3110.05mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0),池中平衡液为1ml12PEG6000 于0.05mol/L磷酸钾缓冲液中.23,25?恒温箱中生长晶体.晶体最大线度可达0.6×0.6× 0.4mm.若采用晶种接入法,则可使线度为0.1×0.1×0.1mm的晶种生长成线度为0.7× 0.4x0.3ram的单晶体[图2],可用于x一射线衍射实验. 三,旋进照相和结昌学参数:用日本理学电机的Ru—S00型旋转靶X一光机和西 德H曲er徘循相机拍摄衍射照片[图3,4],CuK.,单色器滤波,40KV.2S0mA,3o/J~时. 沿晶体c轴展开的徘循照片hk0~11hk]衍射显示了4重对称性,并在a轴和a+b方向都显 示了2重对称性.因此,晶体属于422点群.再结合沿晶体a+b方向展开的徘循照片分析,得 知系统消光规律为;oo1:1=2n+1,h00h=2n+1,h+k+l:无.因此确定其空间群为 P4z2【2.晶胞参数为;a=b=80.8A,c=l07.0A,V=700523A.一个不对称单他体积为 87565A血红蛋白四聚体分子的分子量约为65000按Matthews方法推算,若每个不 第3期斑头雁(Anserindicus)高铁血红蛋白的晶体生【乏和初步的x一射线衍射研究 …———,一 一一…一——一一 . 对称单位中含有半个四聚体分子,则V=2.69A./dal,在蛋白质的取值数值范围之内.因 此每个晶胞含4个暇聚体分子. Fig.3X—rayprecessionphotographsalong c.(A)hkOZO13.~(B)hk1zone Fig.4.X—rayprecessionphotographalong a+b. 讨论 我们采甩了与前人不同的方法米纯化供结晶甩的高铁血红蛋白样品[图l,峰I],即只 需通过透析和SephadexG—i00柱,就可以除去少量杂蛋白(图l,峰I]和残余的KsFe(CN). (图1,蜂?).实验表明,这种纯化方法简单,能生长出可用于x一射线衍射实验的较好的单 晶体. 我们曾试验用不同的沉淀剂来生长斑头雁高铁血红蛋白晶体,得到了不同晶型的晶 体.其中,本文所报导的用PEG6000作沉淀剂生长出的四方晶体,不但形状规则,分辨 率较高,而且耐辐射能力很强. 人们已对斑头雁进行了生态学,行为学,生理学以及血液和血红蛋白的生理生化研 究.许多实验表明,与生活在低处的和它有亲缘关系的种属(如北京鸭,灰腿鹅及加拿大 鹅等)相比较,斑头雁的血液具有稍高的氧亲和性[o-10.有人认为这可能与它的血 红蛋 262生物物理l989华 白HbA中63(E12)和al19(H2)的变异有关".因此,看来若能用X一射线衍射方法分 析它的血红蛋白及其与各种配位体如O.,CO,H.O,DPG或IHP等结合型式的晶体 三维结 拇,将会最有效地从原子,分子水平上测定出细微的变化,揭示结构与功能的关系. 参考文献 M.F.Perutz.etaj.NatureI85.j960,4id WOberth[[r,eta1.HappeSeylersz.Physio1.Chem-.363r1982-58 I?Hiebl-et41.:BiologiealChemistryH.Pp一Seyler-367-1986r59【 M.F.Perutz,ft&f:J.Mo1.Bio】..1.1959,409 B.W.M&tthe日:J.Mo1.Bio]..33.196849I D.Petsehov~,et^l:J.App1.Physio1.42.t977.139 cK.Snyder,et.】.playi"Zeel85(2)199213 C.P.Black,eta1.:Respi~.Physio[.,39(2),1980.21T F.M.Faraci.eta1.:Re叩ir.Phiiio1.8】(I).1985.2l F.M.Farlei,eta1.:Am.J,Physio1.2471984,RG9 M.F.P啪Lz.Mo1.Bio1.EvoI.11983.1 CRYSTALLIZATIoNANDPRALIMINARYX—RAY DIFFRACTIoNSTUDIESoFBAR—HEADEDGooSE (ANSERINDICUS)METHEMOGLOB1N LuGuangyingMaoChunhongWeiXinehengHuaZiqian GuXiaoeheng (DepartmentofBioIogy.PehingUnioersitY) ABSTRACT CrystallizationinPEG6000andcrystallographicparametersofBar—headed goose(Anserindicus)methemoglobinarereported.Thecrystalshavediffraction 0 resolutionof2.5Aorbetter.Thespacegroupistetragona1.P4t2t2withab 口0o 80.8A,e=107.3A,V:700523A..Thereare4tetrameri~moleculesinthe uniteel1withahalftetrameriemoleculeperasymmetricunit. 本文于1988年9月22日收到 …??…??…?