分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达

分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的达 分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表 达 ? 20? 第20卷第1期 2007年1月 医学研究生 JournalofMedicalPostgraduates V01.20No.1 Jan.2007 ? 论着? 分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达 汪萍,李晓军,贾丽,马百坤,黄宇烽 (南京军区南京总医院解放军检验医学研究所,江苏南京210002) 摘要:目的i研究分化抑制因子()基因家族在不同肿瘤细胞及健康人外周单个核细胞(PBMC)中的表达情况, 为探讨基因与肿瘤生长的关系提供实验依据.方法:提取血液病患者和健康人PBMC,人Burkitt'sB淋巴瘤 细胞(Daudi),人T淋巴细胞性白血病细胞(Jurkat),人慢性髓性白血病细胞(K562),人组织细胞性淋巴瘤细胞 (U937),人前列腺癌细胞(PC-3),人胃癌细胞(SGC),人肺癌细胞(SPC),人卵巢癌细胞(COC2)的细胞总RNA,根 据Id2和Id3cDNA全长序列合成两对引物,运用RT-PCR方法,对以上细胞中Id2和Id3mRNA的表达进行半定量 分析.结果:不同的基因在不同人肿瘤细胞中的表达具有一定差异性:Id2在健康人PBMC和各类肿瘤细胞中 均呈普遍表达趋势;Id3在健康人淋巴细胞中未见表达或表达水平极弱,而在不同 肿瘤细胞中的表达有差异,Id3在 PC-3中的表达最高,K562中最低.不同的基因在同种细胞中的表达的差异性也较 大,Id2mRNA的表达水平显 着高于Id3mRNA的表达水平.Id2,Id3mRNA在血液病患者PBMC中均有不同程 度的的表达.结论:不同的 基因在不同的肿瘤细胞中有不同的表达水平,Id3的异常表达在肿瘤细胞增殖及 肿瘤的发生中可能发挥一定的 作用. 关键词:分化抑制因子;逆转录聚合酶链反应;血液病;肿瘤细胞 中图分类号:R730.23文献标识码:A文章编号:1008.8199(2007)01-00204)4 ExpressionofinhibitorsId2andId3ofdifferentiationmRNAintumorcells WANGPing,LIXiao-jun,JIALi,MABai-kun,HUANGYu-feng (InstituteofMedicalLaboratoryScienceofPLA,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand, PLA,Nanfing210002,Jiangsu,China) Abstract:Objective:TostudytheexpressionofIdmRNAinhumanmalignanttumorcellsandthepe. ripheralbloodmononuclearcell(PBMC)0fthehealthyadaults.Metho~:ThetotalcellularRNAwas extractedfromtheperipheralbloodmononuclearcell(PBMC)ofthepatientswithhematologicdisorders. PBMCfromhealthyadultsandeighttumorcelllines(Daudi,Jurkat,K562,U937,PC.3,SGC. SPC-A1,andCOC2).TheprimersbasedonthereportedsequencesofId2,andId3weresynthesized. ThemRNAexpressionlevelsofI(12andId3inthePBMCandtumorcellsweredetectedbyRT.PCRtech. niques.Results:I(12andId3mRNAhavedifferentexpressionlevelsinthedifferentcells.I(12iSwidely expressedinmanycelltypes.bothinnormalandmalignantcells.ThelevelsofId3mRNAexpr essionlev. elsintumorcellsandPBMCfromhematologicdisorderpatientsaresignificantlyhigherthant hatin healthyadult'SPBMC.Conclusion:Id2andId3havedifferentexpressionpatternsindifferen tcell types.ItseemsthatId3mayplaysomeimportantrolesintheproliferationanddifferentiationo ftumor cells.aswellasinthedevelopmentandgrowthoftumors. Keywords:Inhibitorsofdifferentiation;Reversaltranscription.polymerasechainreaction: Hemato. 1ogicdiseases;Tumorcells 收稿日期: 基金项目: 作者简介: 通讯作者: 2006-01-02;修订1日期:2006-02—14 江苏省六大人才高峰基金课题资助项目(批准号:050203D) 汪萍(1980-),女,安徽蒙城人,医学硕士研究生,从事免疫学专业. 李晓军(1962-),女,北京人,教授,医学博士,教授,医学硕士生导师,从事免疫学专业. 第1期汪萍,等分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达'21? 0引言 分化抑制因子(inhibitorsofdifferentiation,Id)又 称DNA结合抑制因子(inhibitorsofDNAbinding),是 一 类广泛表达的转录调控因子,属于螺旋?环?螺旋 (helix.1oop.helix,HLH)转录因子家族成员之一,人类 等哺乳动物细胞中含4个基因,即/dl,ld2,ld3和 ld4,分别位于不同的染色体上.Id蛋白是一类相对 分子质量约为13000,20000的小分子蛋白,它们主 要通过与另一组碱性HLH(bHLH)蛋白(如E蛋白) 结合,阻止E蛋白之间以及E蛋白和其他bHLH蛋白 的二聚化,负调控bHLH转录因子的活性而抑制细胞 分化?.Id分子在细胞周期调控中发挥重要作用, 其细胞表达模式及其调控机制具有多样性和复杂性. 一 般认为,基因家族成员的行为与致癌基因相似. 某些基因的过度表达可延迟细胞衰老,与肿瘤的 发生及其严重程度有关联.用原位杂交和免疫组化 技术在多种实体瘤组织(如神经母细胞瘤,胰腺癌,甲 状腺髓质癌,乳腺癌,子宫内膜癌,宫颈癌,黑色素瘤, 前列腺癌,肝细胞癌等)中均发现Id1呈异常高表达 趋势,且其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度,肿瘤的 发展及不良预后密切相关J.为进一步研究Id分子 在肿瘤细胞中的表达情况及其临床意义,本研究采 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT.PCR)技术,对 部分人肿瘤细胞系及血液病患者外周血单核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)中的Id2 和Id3mRNA的表达进行了检测和分析. 1资料和方法 1.1主要试剂TRIzol试剂购自Invitrogen公司; 限制性内切酶EcoRI,BamHI,RT.PCR试剂盒,琼脂 糖,pGEM-TEasyVector系统购自Promega公司;Taq 酶,dNTP,T4DNA连接酶,DNA标记物D嘲购 自Takara公司.质粒抽提纯化试剂盒,DNA胶回收 试剂盒购自上海华舜公司;淋巴细胞分离液购自上 海华精公司;RPMI1640培养液为美国Gibco产品; 胎牛血清购自上海四季青公司;PCR仪(PE9600), 紫外分光光度仪(U一2001). 1.2细胞培养人Burkitt'sB淋巴瘤细胞(Dau. di)和人T淋巴细胞性白血病细胞(Jurkat)由军事医 学科学院基础医学研究所黎燕教授惠赠;人前列腺 癌细胞株(PCo3M)由第二军医大学附属长海医院孙 颖浩教授惠赠;人胃癌细胞株(SGC)由南京大学侯 亚义教授惠赠;人慢性髓性白血病(K562)细胞,人 组织细胞性淋巴瘤细胞(U937),人肺癌细胞 (SIC.A1),人卵巢癌细胞(COC2)均由本室保存. 上述细胞均用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640 培养液,在37~C,5%CO:培养箱中培养,每3d换液 1次,取对数生长期的细胞,提取细胞总RNA. 1.3研究对象血液病患者共40例,包括白血病 11例,多发性骨髓瘤l4例,淋巴瘤l5例,均为我院 血液病专科门诊和住院的确诊患者.正常对照组 l5例为健康体检人员. 1.4引物设计根据GeneBank中报道的人和 ld3基因序列,设计两对引物扩增ld2和ld3基因, 表1列出扩增Id和内参(GAPDH)所用的引物序 列,引物由上海博亚公司合成. 表1Id2,Id3和GAPDH引物序列 Table1TheprimersequenceofId2,Id3andGAPDH 1.5细胞总RNA的提取取生长至对数生长期的 上述细胞约1×10细胞,加1mlTRIzol试剂,按说明 书提取细胞总RNA,产物以20lDEPC水溶解.电 泳检测RNA完整度,使用紫外分光光度计测量吸光 度(A)的A猢/A帅值,计算RNA含量及纯度. 1.6RT.PCR反应取1gRNA做,逆转录合 成eDNA第一链,反应体系中含:25mmol/LMgC14 l,10×Buffer2,10mmol/LdNTP2l,RNase抑 制剂0.5l,AMV反转录酶1l,Oligo(dT)引物1 ,补无核酸酶水至终体积20.反应条件:42~C 30min,95?5min,5~C5min.用无RNase重蒸馏水 稀释逆转录反应液至100l,取5进行PCR扩增. 20l体系中含RT产物(eDNA模板)5l,25 mmol/LMgCl21.5p,1,10×Buffer2,10mmol/L dNTP0.4V.1,Tat/酶1U,上,下游引物(5pmol/)各 1.3l,补水至终体积20.PCR反应条件:94~C预 变性3min,94?50s,55?50s,70?50s,共30个循 环,70?终末延伸7min. 1.7扩增产物检测取PCR产物6l,于含0.5 g/ml溴化乙锭(EB)的l2g/L琼脂糖凝胶中电 泳,恒压100V,电泳30min.用凝胶成像仪采集, 并保存图像.用凝胶成像分析软件分析各样品条 带A值积分,计算各样品Id与内参GAPDH的A比 值(AId/AGAPDH). 1.8基因产物序列分析用胶回收试剂盒回收纯 化PCR产物,采用pGEM-TEasyVector系统将纯化 的R产物1(12f?Id3cDNA捕八pGEM一rEasy载 体.将构建的匝组载体进行DNA序列分析 19统计学分析实验结果采川I均数?准差 (x?)表示,彳乏SI,P100统if软件进行统计分析, 织问差肄片j非刘'资料检验以,?{)05为差异 有硅着陛统汁学意义 2结果 2.1,.『2和fd3基因扩增及序列分析运不1ht2和 lII3特异性引物,刷Rr-J'cR法舒圳在健康人})HMC, I)audi,Jurkat,K562,LJ937,I'C一3M,SPC—A】,S(C, COC2苒细胞中扩增m栅直ht2}1Ih13I)NA条带, 增产物经12g/"L琼脂糖凝胶电泳鉴定,果{I示与 日的基相符的特rI:条带(罔lA,B)将纯化的 『1]3:DNA克隆至pGEMrr刈扛叶1.构建克隆姣体 【JGEM—rl/_I2pG~1一l'/h将构建的喧小薮体进 {rDNA『列讣忻表_….丧逃戟怍所插八片段的序列 与{;eneBank巾,人1,t2cDN^和ht3cDNA的宁列完 全?致 22肿瘤细胞h】TIIl{N^表达夺析运川hi2f1_ 1(13特异f;】物,LJ,GAPDH为内磬,H{牛定量 Rr—PCR法分剧在健康人PBM(:,Da.di,Jurkat,K562, [1937,PC-3M,SGC,SI【一A】,t(}C2细咆巾扩增fn 柑1成h]2神JId3I)NA条带(),条带?…/J… 的比(结果丧2]d2无沦一各肿瘤细胞系还是 在踺康人PBIMC均咎遍表达;hi3健康人PBMC tff犟乍不表达或嵌逃水平傲弱,f1]大部分ilI4PJfll,} 埔细胞系巾均有水l刊度n0袭.表逃水平较州 罹的差,n—n一3巾[d3的表达{I苫高于他 胞,SIf一A1,1)autt,次之,K562轰达胜低 图l正常^PBM(曩奋刑,瘤如胞hi2,ld3和【^PDHfllR,,的表达情扎 Figur~?IM2hi3clnIIn4PDIITI1R,At*xi)r(:~sillll…ti)ilqOlt,clbandII[FFIn~IIhtllll~l1]PBMt 1~12(40I);II:h13(369l-ll1:1:CAIf】H(18(?.11) MIr,k-rDI~_(ICQI2:l'I{【3Daudi:4:IllYk".5:KS6b:Ll11:7'(-3:S t]t}lqll~llhll『llanI_BMC【1lJ{..~lqil 的戎达('<00】) RN4表达水平丧逃或表达量弱 23血液璃惠者PBMC中MtuRN&表达水平对 l】例白m病,14例多发骨髓瘤】5例淋巴橱患者 和I5唰健康体检者f19Pl{MCIt]n1RN^检测结果(表 3)提示,l缸液病(血痛,骨髓癌千口淋嚼)患_并与 健康人PBMC中hi2均有遍表达各组问无娃着 性最异各组患肯ld3表达均高丁健康人PBMCId3 血渍祸患者和正常人l1?IM【k12,I,I.3…ltN^表达水平 (ll,i??11) l3n1PI'x…L_ln-k(订Id2,nd{N&…I吣,ll ?1{【-rpd1i!his?Il131ii~BzllhiIlII[Ulf1IlM(:(41,/1?… 3讨论 l990年,Benezra等发脱基阁,其表丛产物 是HIH(Ilelix—Ip—llelix)蛋门家族成员之?,l 基因在多种类型细胞及组!巾部自丧达.分子 本身缺乏I)NA结台必需的鲺基艘列,与bI-ILH蛋 白结合成二聚体后,『引印制?IIH0DNA及其组织 第1期汪萍,等分化抑制因子Id2和Id3在肿瘤细胞中的表达.23? 特异性bHLH转录因子结合,从而抑制细胞分 化[,.Id分子参与细胞的发育,骨骼肌的分化,血 管平滑肌的增殖,胚胎的神经系统形成,骨发生和肿 瘤诱导的血管发生等多种生物学过程..10余年 的研究中,在鼠和人的体外培养细胞系,活体细胞, 组织切片及分离的器官中研究IdmRNA水平的表 达,结果发现,几乎所有的细胞都至少表达一种 基因,更多的是同时表达多个基因.基因 在不同来源及不同发育阶段的细胞中有不同的表达 模式,同种细胞内的不同Id蛋白也具有不同的功 能,由此决定了Id蛋白对细胞周期调控具有细胞种 类和阶段的特异性. 基因具有"永生化"癌基因的某些特性川. /d1基因和蛋白在多种人体肿瘤中均呈高表达趋 势剖,Idl过度表达可延迟细胞老化或导致细胞永 生化.Id3在不同组织种类的肿瘤中具有截然不同 的表达谱12,13],在结直肠癌,星形细胞瘤中呈高表 达,而在甲状腺癌,卵巢癌中表达呈下降趋势;Id3在 分化良好的肝癌细胞中的表达要高于分化不良的肝 癌细胞.本研究以GAPDH为内参照,用半定量 RT—PCR法检测Daudi等8种肿瘤细胞系以及健康人 PBMC中Id2和Id3mRNA的表达情况.结果表明, 无论在健康人PBMC还是肿瘤细胞,Id2mRNA均呈 普遍表达趋势;但健康人PBMC中,Id3mRNA基本 不表达,或表达水平极弱.Id3在不同肿瘤细胞中虽 有不同程度的表达,但其表达水平普遍偏低,明显低 于Id2的表达,也显着低于内参GAPDH的表达,因 而造成AAAPD比值过于偏低.Id3在不同的肿瘤 细胞中表达程度有较明显的差异,这也是与Id2的 不同之处,PC-3M中Id3表达量最高,SPC—A1,Daudi 次之,K562最低.对40例血液系统恶性肿瘤(白血 病,骨髓瘤,淋巴瘤)患者的PBMCmRNAId检测结 果也提示,Id2mRNA无论在各肿瘤细胞系还是在血 液系统恶性肿瘤患者PBMC中的表达水平,与健康 人PBMC无显着差异,均呈普遍高表达趋势.Id3 mRNA在上述患者PBMC中均有表达,而在健康人 PBMC中几乎不表达. 最初研究发现,在细胞发育过程中,基因大量 表达于未分化的,增殖性细胞,随着细胞分化和成 熟,基因表达逐渐减少.但近几年的研究表明,Id 蛋白的表达根据其所在细胞的种类和生长发育阶段 的不同而呈现不同的水平,从而执行各种特殊的细 胞生物学功能.Id3的表达水平不是静止不变的,而 是随着细胞生长发育和生理状态的变化而变化,并 能对细胞外的不同刺激作出应答?.'.本项研 究也得出类似结果,Id3mRNA在不同细胞中的表达 程度显着低于Id2mRNA的表达,但不同组织类型 的肿瘤细胞中Id3的表达程度有明显差异.因此, 对于Id3在不同类型细胞中,以及细胞的不同生长 阶段,生长环境下的表达状况进行分析,有助于探讨 作为细胞调控蛋白的Id3分子在某些病理生理状态 下的生理,生物学功能及其意义. 参考文献: 【1]BenezraR,DavisRL,LockshonD,et02.TheproteinId:aneg- ativeregulatorofhelix—loop—helixDNAbindingproteins[J]. Cell,1990,61(1):49-59. [2]NortonJD.IDhelix—loop—helixproteinsincellgrowth,differentia- tionandtumorigenesis[J].JCellSci,2000,ll3(Pt22): 3897-3905. [3]李晓军,秦浚川.分化抑制因子研究进展[J].生物化学与生 物物理进展,2004,3l(10):865-869. [4]RuzinovaMB,BenezraR.Idproteinsindevelopment,cellcycle andcancer[J].TrendsCellBiol,2003,13(8):410-418. [5]YokotaY,MoriS.RoleofIdfamilyproteinsingrowthcontrol [J].JCellPhysiol,2002,190(1):21-28. [6]YatesPR,AthertonGT,DeedRW,et02.Idhelix—loop—helixpro- teinsinhibitnucleoproteincomplexformationbytheTCFETS—do- maintranscriptionfactors[J].EMBOJ,1999,18(4):968-976. [7]KeeBL,RiveraRR,MurreC.Id3inhibitsBlymphocyteprogen— itorgrowthandsurvivalinresponsetoTGFB[J].NatImmunol, 2001,2(3):242-247. [8]BainG,CravattCB,LoomansC,eta1.Regulationofthehelix— loop—helixproteins,E2AandId3,bytheRas—ERKMAPKcascade [J].NatImmunol,2001,2(2):165—171. [9]K0M,AhnJ,LeeC,et.E2A/HEBandId3proteinscontrol thesensitivitytoglucocorticoid—inducedapoptosisinthymocytes byregulatingtheSRG3expression[J].JBiolChem,2004,279 (2t):21916-21923. [10]KowanetzM,ValcourtU,BergstromR,eta1.Id2andId3define thepotencyofcellproliferationanddifferentiationresponsesto transforminggrowthfactorbetaandbonemorphogeneticprotein [J].MolCellBio,2004,24(10):4241-4254. [11]范婷婷,李晓军.细胞分化抑制因子与肿瘤[J].医学研究生 ,2005,18(10):942-945. [12]ArnoldJM,MokSC,PurdieD,et.Decreasedexpressionofthe Id3geneatlp36.1inovarianadenocarcinomas[J].BrJCancer, 2001,84(3):352-359. [13]DamdinsurenB,NaganoH,KondoM,eta1.ExpressionofId proteinsinhumanhepotocellularcarcinoma:relevancetotumor dedifferentiation[J].IntJOncol,2005,26(2):319-327. [14]IJiXJ,HataK,MizuguchiJ.Engagementofmembraneimmuno- globulinenhanceId3promoteractivityinWEHI-23lBlymphoma cells【J].ActaPharmacolSin,2005,26(4):486-491. (责任编辑:张锐;英文编辑:徐军)