[doc] 双抗体夹心法ELISA检测传染性法氏囊病病毒

[doc] 双抗体夹心法ELISA传染性法氏囊病病毒 双抗体夹心法ELISA检测传染性法氏囊病 病毒 爱痛眵,j=EL【A 国外兽鞋学一畜霄虞病第14卷第1期1993年2月地氏笳 双抗体夹心法ELISA检测传染性法氏囊病病毒 岫灿mar你p日.f『f.; 摘要利用双抗体夹心法ELISA从 腔上囊悬浮液检测传染性法氏囊病病毒 (IBDV).50羽五周龄的没有IBD的白 色来亨鸡,以IBDY作实验感染.在感染 后4812,2438和48小时,以及 3,4和5天时,分别采集法氏囊.另 外,用相同数量的鸡作为对照.用肉眼明 显区分阳性和阴性反应之间的不同颜色. ELISA阴性和阳性吸收值之间的分界线是 阴性对照平均吸收值加三倍橱准差. l引言 双抗体夹心法ELISA,早巳用于种禽 群的禽类造淋巴细胞组织增生病毒感染. 而本文将此法用于从人工感染禽的法氏囊 悬浮液中检~JlBDV. 2材料与方法 实验: 将100羽没有IBD的五周龄白来亨鸡 平分为二组其中一组以IBDV(血清 J型,10TCIDo/m1)作鼻内和眼内个 体滴种0.1mb另一组每羽以同法滴i种 0.1ml感染鸡胚成纤维细胞培养物.在 接种4,8,12,2436,48dx时和3, 4,5天时,各组分别抽取5羽扑杀. 试荆t 兔抗鸡IgG的制备,是按照Smith& Witter(1983)用于检测网状内皮组织 增生病毒抗体的ELISA技术.制备辣根过 氧化物酶结合物是根据Levy&Sober以及 Miller等(1974)的方法.抗鸡IgG的兔 血清用二乙胺乙基纤维素(DEAE)过 柱.结合过程分二步,即辣根过氧化物酶 的活化,用1的2,4一氟硝基苯和高碘 酸钠使其形成醛基J然后加入兔抗鸡丙种 球蛋白与过氧化物酶一醛基结合,形成结 合物.ELISA结合物的最佳稀释度经测 定,在1:100稀释对出现最高阳性值, 并以此为试验中的工作浓度.用Ide (f974)作禽脑脊髓炎荧光抗体试验的 方法,制备IBDY的兔高免血清.鸡抗 IBDY高免血清的制备是依据Allan& McNuhy(1985)的方法.ELISA—IBD 抗原的制作是按MarquarJt等(1980)的 方法.用于双抗体夹心技术的法氏囊样 品,其准备方法如同于Perin等(1986) 的快速狂犬病酶免疫诊断.将采自感染禽 的法氏囊小块,加4体积pH7.4的PBSf~, 作成均浆,然后在1400g离心30分钟,除 去大颗粒.上清液用作检测的抗原JIBD 阴性抗原的制备为采集未感染的法氏囊, 其余程序如上述. 抗体和抗原最适稀释度的测定: 预备试验冉方阵滴定法,测定最适抗 体稀释度(兔和鸡抗IBDV的高免血清) 和ELlSA—IBD抗原. 本试验使用平底96孔微量板.前两行 后)可用青霉素. (参考文献16篇略) 彭广能译自VetMediApril1992; 芮荣校 34国外普医学一音青疾病》第”卷第1期19S8年2月 竖孔分别为底物(s)对照和底物结合物 (C—S)对照.以pH9.6碳酸盐缓冲液对 兔IBDV高兔血清作l:500,1:1000, l{2000,l{4000,l:8000稀释.每 一 抗体稀释度加入两行竖孔,每孔100~[, 4?孵育过夜,然后冲洗六次.ELISA稀 释抗原(以PBs一吐温稀释成1:5,1 Ii0,l{20,1:40)~n入敏化孔i00l, 测验所有抗体稀释度.37?孵盲90分钟 后,水洗|除s和0一s对照外,每孔加入 100gl鸡抗IBDV高免血清(以含0.5牛 血清自蛋自的PBs一吐温作l:lOOO稀 释),37?孵育15o分钟,水洗.接着, 除s和c—s对照外,每孔加入lOOgl以台 o.5N牛血清自蛋自的PBS一吐温作1t i00稀释的结合物,37?孵育90分钟,水 洗I然后,所有孔分别加入IOO~,I新鲜配 制89OpD~过氧化氢|37?孵育30分钟, 每孔加入5ooI2.5MH2SO’终止颜色反 应.反应结果以肉眼可视和借助酶标仪在 490nm处读O.D值.阳性反应为橙色和红 棕色.对照孔s和c—s没有颜色变化.高免 血清和抗原的稀释度为近于1.0OD值的即 为ELISA试验时一 稀释度.在方阵滴定 中,最适兔抗IBDV高免血清稀:释度和 ELISA抗原稀释度,即出现最高阳性值的 稀释度分别为1t8000和l;10J该稀释 度用于本试验.相同的方阵滴定用于鸡抗 IBDV高免血清,测定其最适稀释度,获 在l;4000时出现最高阳性值. 试验程序t 对世界卫生组织用于在粪便中检涮 轮状病毒抗原的ELISA程序稍作改良. 兔抗IBDV高免血清以pH9.6的碳酸盐缓 冲液作l;8000稀释,然后对微量板除第 一 竖行从A到H孔作s对照和最后竖行 EFGH孔作c—s对照外,其余反应孔都加 入1001. 反应板置4?过夜孵育后,准备试验 样品.每一样品作四个竖孔.第10和第l1 竖行的EFGH孔作已知阴性和阳性对 照,前者加入100pl1{i0稀释的IBD阴性 法氏囊抗原,后者加入i00}Ill{i0稀释 的巳知洼氏囊抗原.试验样品以PBs一吐 温作l:10稀释,然后,除第l竖行和第 10,1l和12竖行的EFGH孔外,其余反 应孔分别加入100~l.4?孵育过夜后, 水洗,除s和c—s对照孔外,各反应孔分日6 加入100~llt4000鸡抗IBDV高免血清, 以覆盖抗原.接着,37?孵育60分钟,水 洗,以含0.5牛血清白蛋自的PBs一 吐温对兔抗鸡IgG结合物作l?i00稀释, 而后除s对熙外,所有反应孔加.A100~I. 置37?孵育90分钟后,水洗,所有反应孔 都加入i00~I新鲜配制的OPD一过氧化 氢I37?孵育30分钟后,加入50~*I2.5M HS..终止颜色反应.反应结果以肉眼 可视和借助酶标仪阅读.s,(-s和阴性 对照没有颜色变化.l0份已知阴性法氏囊 样品(1:10稀释)以相同的试验程序操 作,并借助酶标仪在490nm处阅读反应结 果.ELISA阴性和阳性吸收值之间分界 线,是阴性对照的平均吸收值加三倍 差. 3结果 未感染法氏囊悬浮液对照不与免疫吸 收剂作用,10个样品平均吸收值为0.115. EL1SA阴性和阳性吸收值的分界线是 0.140.本研究结果表明,感染后4蓟24 小时的法氏囊样品,其O.D值范围为0.11 至0.12,即低于分界线,也就是没有病毒 抗原.可是,感染后36到12O小时,其O.D 值逐渐上升,范围为0.21到0.45.本法中 病毒抗原的含量可能影响0.D值的获得. 以内眼可以明显区分阴性和阳性样品之间 国外普医学一言霄疾病》第1?卷第l期193年2月35 的不同颜色}大多数阳性样品的O.D值>试验结果的判断,井不一 定需要酶标 0.21(一种明显的黄色),绝大多数阴仪,因为在印度,置试验于野外条 件下进 性样品的O.D值<O.1I(没有可见颜行,可明显区分阴性和阳性样品之间的不 色).同颜色.在缺乏贵重的荧光显微镜和有关 . . ,, ‘ . .知识时,.’可以方便地使用本试验.本试验 4词化比同接ELIsA有一个优点,即无需纯化病 研究表明,本方法是特异的,敏感e毒.所以,对印度现有条件下的常规实验 且每一样品均可容易地重复试验.还可很室诊断IBD,以及当有大量样品需要检 快得到精确的结果.与其他诊断方法相查,作流行病学研究时,本试验是一种实 比,例如免疫过氧化物酶,放射免疫扩散用的工具,并因此免去了传统的病毒分离 法和荧光抗体技术,结果表明前面二种技和鉴定方法的麻烦. 术,在感染后36小时到4天可检测IBD抗(11篇参考文献略) 原,而第三种方法,感染后24小时到4天陈耀曙译自Br.”Vet.J.IFv9lJ 可检测IBD抗原,这样证明双抗夹心.”7l251—25 ELISA用于检测法氏囊组织的IBD抗原,胡永强校 具有相同的敏感性.?’.,’ — j0褊太日千掏螽.秀南食中毒 影响印度禽业的两种主要疾病 S~xenaHC xt,Hc设寿亏r路. 印度的养禽业一开始就处于徘徊阶 段,虽然饲养管理和饲料质量方面已有很 大改善,但仍有几个主要问题产量影响着 养禽业的发展,如两个慢性病一一大肠杆 菌病和霉菌毒素中毒病,使养禽业的效益 损失很大. 大肠杆菌病是由大肠杆菌类的细菌引 起的,这些细菌通常是消化遭的常在菌, 广泛存在于家禽的环境中,生殖道感染, 呼吸遭吸入或粪便污染常引起发病,饮水 污染已使养禽场遭受了严重损失.离璃l严 重呼吸道病常由大肠杆菌引起,影响生长 发育,并常常导致很低的饲料转换章,扁 鸡出现心包受,秆周炎和腹膜炎病变.4 周龄鸡多发,还可引起肠炎,表现严重下 痢,不同程度的脱水和迅速消瘦- 使用净化水:蛋鸡产蛋量突然下降, 跟踪调查发现是由于饮水中存在大肠杆 菌,通过加强饲养管理和防治措施就可控 制,首先要减少鸡舍中的应激因素,如寒 冷和高浓度韵氢气,因此适当的通风和 气流交换极为重要. 鸡只饮用的水一定要氯化消毒,以 便消除水源感染,水中添加Medichlor(医 用氟一骗者注)最为方便,但需放置4— 6小时才能起到杀菌作用.只有早期使用 药物防治,鸡衩才不会发生急性败血症, 饮水中添加映喃类药物进行防治是非常有 效的,广谱抗菌素连用4—5天有助于减 少此综合征的发生,在呼吸道症状出现的 早期就使用药物治疗能收到最好的疗效. 早期诊断和治疗是控制大肠杆菌病的