【doc】应激引起血压升高大鼠血管升压素V1受体mRNA水平改变

【doc】应激引起血压升高大鼠血管升压素V1受体mRNA水平改变 应激引起血压升高大鼠血管升压素V1受体 mRNA水平改变 生理,1999年8月,51(4),471—476 Actae~sio:ogicaS/n/ca—-—_—__-—, 应激引起血压升高大鼠血管 升压素V1受体mRNA水平改变 墅坚适星:姚泰 (上海医科大学生理学教研室.''上海医科大学神经生物学国家重点实验室,上海200032) 摘要实验在雄性Sprasue-I)aMey大鼠上进行.实验动物被随机分为对照组和应激组,应 激组大鼠每天给予电击足底结合噪声的应激刺激,每日2次,每次2h应激组大鼠在接受连续 15d的慢性应激刺激后,其尾动脉收缩压与对照动物相比有显着升高.对照组为16.25?0.岛 kPa(n=7);应激组为19.55?145kPa(n=8,P<0.o5).用BT-PCR结台Southern印迹核酸分 子杂交技术观察到,血管升压素(vasopresshl,AVP)受体mRNA广泛存在于大鼠下丘脑,皮 质,延髓等部位及心脏肝脏,肾脏等组织中用定量PcR方法观察到,大鼠在接受慢性应 激刺激之后,其大脑顶叶皮质,下丘脑及延髓组织中AVPv受体mRNA水平均显着低于正常 大鼠(顶叶皮质:P<0.05;下丘脑:P<001;延髓:P<0001),而心脏,肝脏及肾脏组织中的 AVPv1受体?A水平与正常太鼠相比均无明显差别(心脏:P>005;肝脏:P>005;肾脏: P>0.05).上述结果提示,慢性应激刺激可引起大鼠不同部位脑组织AVPv1受体合成水平下 调,可能导致上述部位组织中AVPV受体密度降低,而对心脏,肝脏及肾脏组织中的AVPv1 受体密度则无显着影响. 关键词:堡萋王且黑熊;堕堂; 学科分类号:Q463;113313 ?——-- , 环境因素对机体影响的研究已越来越多地受到人们的重视,其中随着现代生活节奏 的加快,人长期处于紧张状态所造成的慢性紧张应激刺激对机体心血管系统的影响已成 为一研究热点.目前临床上心血管疾病的发病率呈上升趋势,慢性紧张应激刺激被认为 是导致高血压,冠心病等心血管疾病发病率升高的重要因素.研究结果表明,应激刺激引 起体内神经及多种体液因素的改变,包括中枢神经肽(如阿片肽),神经递质(如乙酰胆 碱)及外周肾上腺皮质激素等,这些变化均参与应激对机体心血管活动功能的影响.本实 验室在过去几年中,用噪声结合电刺激大鼠足底的手段建立了应激性高血压大鼠模型, 并对其发病机制进行研究….实验结果证明,给予大鼠慢性电击足底结合噪声的应激刺 激可导致动物血压持续性地升高,体内多种因素,包括中枢乙酰胆碱,肾上腺皮质激素以 及血管紧张素?等的改变都参与了应激刺激引起血压升高过程?一1.近来的研究观察到, 大鼠在接受电击足底结合噪声的应激刺激后,下丘脑内血管升压素(vasopre~in,AW)的 合成和释放有明显增加J,并通过中枢V1受体参与应激引起机体血压升高过程.AvP水 平长期持续地改变,可影响其相应受体密度L4J.本实验观察了大鼠接受慢性应激刺激后, 19984)84)9收稿1998—11-15修回 国家教育委员会博士点基金(No1332104)~美国纽约中华医学基盘会(H09o-527)资助项目 生理51卷 其不同组织中A,vl受体的变化. 实验动物及处理实验动物全部采用雄性Sprague-Dawley(sD)大鼠,由上海医科大 学实验动物部提供.动物随机分为对照组和刺激组.刺激组动物每天给予电击足底结合噪 声的刺激,每天2次,每次2h.刺激时,将动物放在22cmx22crnx26cm的笼内,笼底由 细的铜栅构成,通过铜栅给大鼠足底以电脉冲刺激.刺激脉冲由计算机控制,每2—25s之 间随机发生一次,刺激脉冲电压为50,100V,持续时间50一.电刺激的同时,由蜂鸣器发 出噪声(80,100dB,时程50ms).计算机产生的刺激形式分为两种,一种为噪声+电击, 另一种为仅给予噪声刺激,每次刺激的形式由计算机随机控制【J].对照组动物在相同条件 下饲养.不给予任何刺激.动物于清醒状态下用尾套法测大鼠尾动脉收缩压,每次测量均 在应激刺激停止2h后进行. 动物组织RNA样品准备动物腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后断头处死,迅速取组 织放入预先冰浴冷却的组织裂解液中,用高速组织分散器打成匀浆,用改良一步法 分离组 织总I~IAC5].分离得到的RNA经MOPS变性凝胶电泳鉴定,两条rRNA条带清晰,OD260/ OD280比值于1.8,2.0之间才用于以下实验. 寡聚核苷酸引物设计AvPvl受体mRNA长1.3kb,实验设计下游引物primer-1与 AVPV.受体mRNA上第579,598位碱基互补,其碱基顺序为:5-TAGrIGccA?蜘眦^c— CTCG-3,,上游引物与AvP受体mRNA第1,21位碱基顺序一致,其碱基顺序为:5一 A他AGTcccGcGAGGcI?G3,并设计引物primer.3其碱基顺序为:5'-TACATCGCCG. 7GTCA2~ACCC一3,该引物与AVPVl受体mRNA第444,463位碱基顺序一致,经标记后,作 为寡聚核苷酸探针用于PCR产物的Sou~em鉴定.上述引物均由美国01igosETC公司合 成.用primer-1和prlmer-2扩增AvPvl受体基因所得DNA产物片段长应为598bp_6'. 逆转录合成cDNA取动物组织分离得到总RNA10ttg,加入AMV20U,dNTP(10 mmol/ldN'lPeach)2,PCR下游引物primer-120pmol,5×RT反应缓冲液4,RNasin30 u,用DEPC处理水调节反应体系体积至2ol,混匀,置于42?水裕中保温15nfin合成 cDNA,然后置于96?水浴中3min使酶灭活. PCR扩增AvPvl受体基因片段取逆转录产物2,分别加入TaqDNA多聚酶1U, 10×反应缓冲液3,prlmer-18pmol,primer-210p?1ol,dNTP(10mmol/ldNrPeach)1l,混 匀后,加入适量液体石蜡盖封,经94.c预变性3min,然后94?60s,6o?60s,72?150s, 扩增30个循环,再在72.c延伸10min. RT-PCR扩增产物鉴定取PCR产物6l,加1l电泳用载样缓冲液,在2%agarose 凝胶中电泳.电泳结果看到,从正常sD大鼠脑顶叶皮质,下丘脑,延髓及心脏,肝脏,肾脏 组织中分离得到的RNA,经RT-PCR扩增后在约0.6kb处均有一条特异性扩增条带(图I). 如果在逆转录体系中不加入逆转录酶,则PCR扩增产物在约0.6kb处不能得到特异性 扩增条带.这一结果证实,实验中0.6kbDNA扩增片段为mRNA来源,而非从染色体DNA 扩增所得. 将PCR产物~rOSe凝胶电泳结果经Southem印迹转移到尼龙膜上,primer-3用DIG寡 聚核苷酸3末端标记试剂盒(DIG01igonucletide3t-EndLabelingKit)进行3末端DIG标记后, 作为探针,对尼龙膜上DNA进行核酸分子杂交检测j,检测结果如图2所示. 4期陆利民等:应激引起血压升高大鼠血管升压素Vl受体mRNA水平改变 图1不同组织来源RNART-PCR扩 增产物琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.1ElectzophoreticresultofPCR productsin2%agali~egel usingRTproductofRNA isolatedfromdifferemtissues ofratsastemplate: 1.Ki2Liv盯3.Heart. 4.Medulla5Hv【1alImg. 6.C,oltex.expectedDA (size0.6kb)isindicatedbv 123M456 ?—' . O.6kb 图2PCR扩增产物Southem印迹杂交 结果 Fig.2SketchmapshowingtheSouthem 6--I1.61(bngAsin 岛tonVIon?n1b璃ne 从图2可以看到,在0.6kb处均有杂交信号存在,即0.6kbDNA扩增片段为特异性 AIPV.受体基因扩增产物,证实正常大鼠脑顶叶皮质,下丘脑,延髓,心脏,肝脏及肾脏6 种组织来源的RBA中均有AVPV.受体mRNA存在.即有AVPV.受体基因表达和AVPV. 受体分布.本实验中所采用的RT-PCR条件是理想的,能得到正确的AVPV1受体mRNA扩 增产物. AIPV.受体mRNA水平PCR定量分析本实验中采用的PCR定量方法是以单一碱 基突变模板作为内标的PCR半定量分析方法.具体做法与我们过去的报道相同_】,其原 理简述如下:实验中用RT-PCR方法扩增得到AVPV1受体基因片段,用计算机对其序列进 行限制性酶切谱分析,观察到该序列中无EcoRI酶切位点,将此序列中第163位碱基A改 为T后,形成的突变模板中就引入了EcoRI酶切位点,这一突变模板AB经EcoRI酶切 后,分成0.44kb和0.16kb两个片段,而原始RT-PCR产物则不能被F2.oRI酶切.在进行 ,还加入一定浓度的突变模板ABPCR定量分析时,扩增体系中除加入RT产物外 进行同 时扩增扩增产物经EcoRI酶切后电泳,根据电泳结果中被切开和未被切开产物的相对 量的比较,即可对组织中AVPv.受体mRNA进行相对定量.本实验中,取RT产物2vl, 加 入突变模板约为2×10g.图3为一组正常大鼠肝脏组织中AvPv1受体mRNA水平PCR 定量结果. 用DIPYectlaPC(80286)图像处理系统对图中0.44kb和0.6kbDNA片段进行光密度扫 描,求出条带的平均光密度和面积,用平均光密度与面积的乘积代表电泳结果中0.44kb ,用方差分析的统计方法,分析各组间的差异是否具有显着和0.6kbDNA相对含量 性. 474生理5l卷 MABAB123456 一 0.6kb '一0.44kb 一 016kb 圈3定量MR结果 Fig.3QuantitativePCRresult Frc~alefttoright,linei:l:ll~fker; lines2,9:dec?DI.o商eresultof dil戚edPCR0dfl衄templale AB.AB.AB(about2X l0g)wasaddedinto2eT3e munscnp~onprodu~stomRNA isnlafreraheDcti~,saerats 应激刺激对大鼠不同部位组织中AVPV.受体mRNA水平的影响应激组太鼠在接 受15d电击足底结合噪声的应激刺激后,用单碱基突变模板为内标的定量PeR方 法观察 到,大鼠脑皮质,下丘脑及延髓组织中AVPV1受体mRNA水平均有显着下降.皮质:对照 组为6.641?3.827(/I,=6),应激组为I.626?0.133'(/1,=5,P<O.05);下丘脑:对照组为 2.380?O.232(n:6),应激组为1.789?0.286(/1,:5,P<O.O1);延髓:对照组为6.174? 1.279(/1,=6),应激组为1.029?0.196(/7.:6,P<O.(301);而心脏,肝脏及肾脏组织中 AVPV受体mRNA水平与对照组动物比较均无显着差别.心脏:对照组为7.241?1.886(/7. =6),应激组为7.824?3.857(n=6,P>0.05);肝脏:对照组为18.43?6.019(I1=6),应 激组为21.59?9.877(/1,=5,P>0.05);肾脏:对照组为7.416?1.421(/1,=6),应激组为 8.915?4.737(=6.P>0.05),见图4. 图4应激刺激对大鼠不同部位 组织中AVPVt受体mRNA, 水平的影响墨 rlg.4Effectsofstressstimulation崔 onAVPV1receptor垂 raRNAlevelindifierent C tissuesofrats P<0.05,P<001,…P <0001. CortexHypothalamusMedullaHeaffLiverKiddy 给予动物电击足底结合噪声的应激刺激时,大鼠出现呼吸加深加'陕,直立,企图逃避 等一系列紧张表现.经过多次刺激后,仅给予噪声刺激动物也会出现上述一系列反应.15 d后,应激组大鼠尾动脉血压为19.554-1.45kPa(/1,=8),显着高于对照组大鼠尾动脉 血压 水平(对照组16.254-0.63kPa,/1,=7,P<0.05),这一结果与我们过去观察到的结果一致, 即慢性紧张应激可引起大鼠血压出现持续升高. 本实验用RT-PCR的方法观察到,在大鼠脑的顶叶皮质,下丘脑,延髓,心脏,肝脏及 肾脏6种组织中均有AVPV】受体mRNA存在,证实上述6种组织均有AVPVl受体分布.在 ?;乌约伸0 0??cI×m一 一日日x口0? 4期陆利民等:应激弓I起血压升高大鼠血管升压索v受体mRNA水平改变475 慢性应激引起血压显着升高的大鼠中,用定量PCR的方法观察到大鼠在电击足底结合噪声 的应激刺激后,大鼠脑顶叶皮质,下丘脑及延髓等不同部位脑组织中AVPV受体mltNA水 平显着降低,而心脏,肝脏及肾脏组织中的AVPV.受体mRNA水平则无明显改变.上述结 果提示,慢性应激刺激可导致顶叶皮质,下丘脑及延髓组织中的AVPV.受体蛋白合成水平 下调.导致上述组织中AvPv.受体密度下降.而心脏,肝脏及肾脏组织中AVPVI受体的合 成在应激之后则未出现明显改变. 大量的实验资料证实.递质或激素水平的长期持续改变可引起受体密度及亲和力的改 变.在血管升压素的研究中也有报道,AVP水平长期持续改变后,引起AVP受体密度发生 改变.如Steiner报道,禁水使血浆AVP浓度持续高于正常水平之后,肾脏组织AVP受体密 度出现下调j.在对糖尿病大鼠的研究中也观察到,由于血浆渗透压的升高,AVP血 浆浓 度持续高于正常,随之出现AVP受体密度下调_9J. 本实验中观察到,大鼠接受慢性应激刺激之后,中枢神经组织中AVPV受体出现下 调,而其他组织中AVPV,受体并未出现明显改变,我们推测这可能也与AVP水平的持续改 变有关.我们过去的研究曾观察到,电击足底结合噪声的慢性应激刺激可引起太鼠下丘脑 内AVP的合成及释放增加3J,应激之后AVP的改变与应激引起大鼠血压升高有关,AVP的 作用主要通过中枢v受体实现.结合过去的研究结果,我们推测,应激引起AVP合成增加 可能主要通过中枢神经系统发生作用,应激刺激之后大鼠中枢神经组织中AVP水平出现持 续高于正常,导致中枢神经组织AVPVI受体下调,AVPv】受体mRNA水平下降.而血浆中 AVP水平并未出现明显改变.这是否与其他组织AVP的改变不如中枢神经组织显着有关还 有待进一步研究.当然,不能排除其它因素参与应激引起AVPV受体改变过程. 参考文献 【1J"nQ.LiP.Roslxalmedullaryeholinergiem?ha驯*andchronics'a~ss-indueedhyperteEtsionJAutoNew 蹄,1990,31:211,218. 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KeywDnls:vasopressinVtreceptor;stressihypertension 弛曲wassupportedbythesEaueafionc?商0I10fc(Gmm1332104)andthe‰naMedical &lard0fN(Grant9O-527).