诺氟沙星胶囊微生物限度检查法验证报告1

山西太原药业有限公司 诺氟沙星胶囊微生物限度检查法 验证报告 文件编码：TY-GSB-YZ（02）-013-04 二零一六年一月 验 证 立 项 申 请   立项部门 质量部QC 申请日期 年  月  日 立项题目 诺氟沙星胶囊微生物限度检查法方法学验证 验证原因 为确保检验结果的准确性，可靠性及检查方法的完整性，对产品检验方法进行方法学验证是极为重要的措施，因此，我们对本品的无菌检查法进行了方法学验证。 验证及目的： 按照2015年版《中国药典》四部通则微生物限度检查法规定内容进行验证。为确保检验结果的准确性和可靠性，定期对检验方法进行方法学验证是极为重要的措施。 立项负责人签名：                              年  月  日 质量保证部意见 签名：              年  月  日 验证小组负责人意见 签名：              年  月  日 编制验证方案的人员： 验证完成要求及日期： 严格按照验证方案的内容进行试验并进行数据处理。要求在    年  月  日前完成。 验证小组负责人签名:                          年  月  日 备注： 目录 1 验证目的    1 2范围    1 3    1 4内容    1 5验证方法    1 5.1供试品    1 5.1.1菌种名称及来源    2 5.1.2培养基与试剂名称、批号及来源    2 5.1.3仪器与设备    2 5.2菌液的制备    3 5.3菌液计数    4 5.4计数培养基的适用性检查    4 5.5供试液制备    5 5.6需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法验证    6 5.7控制菌检查方法验证    7 6试验结论    8 7偏差    9 7.1偏差报告    9 8验证评价及建议    9 9验证报告：    10 10验证证书    10 1 验证目的 根据《中国药典》2015年版四部通则微生物限度检查法要求，为保证检验质量，确保检验结果的准确性和可靠性，对诺氟沙星的微生物限度检查法进行方法学验证。 2范围 本验证方法适用于供试品的微生物限度检查法方法验证。 3责任 部  门 姓 名 职 责 质量部 蔚晓娟 负责验证项目的申请、验证方案的编写和验证的实施 质量部 李海晋 负责验证项目的实施 质量部 张慧慧 负责验证项目的实施 质量部 高彦红 验证小组负责人 质量部 王雅玲 负责验证方案的审核、项目立项的批准、验证的组织实施和验证报告的批准 质量部 刘伯梅 负责验证报告的批准和偏差的调查 4内容 验证方法需进行3个不同批次的产品验证并且结果都符合规定时，该方法才可以用于日后日常检验。 5验证方法 根据《中国药典》2015版四部通则微生物限度检查法 5.1供试品 诺氟沙星胶囊               规格:   10ml                                批号  160101    160102    160103    5.1.1菌种名称及来源 枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕、  金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕 大肠埃希菌〔CMCC（B）44102〕、  白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕 黑曲霉〔CMCC（F）98003〕      铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕 以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。 5.1.2培养基与试剂名称、批号及来源 胰酪大豆胨琼脂培养基 151109 胰酪大豆胨液体培养基 151112    沙氏葡萄糖琼脂培养基 151117  PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液  150313      以上培养基均由   北京三药科技开发公司  提供。 5.1.3仪器与设备 SPX-250B-Z 生化培养箱：        上海博讯实业有限公司医疗设备厂                    MJX-250B-Z霉菌培养箱：        上海博讯实业有限公司医疗设备厂                    5.2菌液的制备 （1）接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上， 30～35℃培养18～24小时, 上述培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。 （2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养48～72小时，上述培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。 （3）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 5.3菌液计数 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌各小于100cfu分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，立即倾注不高于45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，30～35℃培养不超过3天。取白色念珠菌、黑曲霉各小于100cfu分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，立即倾注不高于45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约15～20ml，20～25℃，培养不超过5天，培养计数见表5.1 表5.1活菌计数 菌种名称 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 稀释级 10-6 10-6 10-6 10-6 10-5 10-6 1 88 93 83 76 73 62 2 74 84 89 82 64 74 平均值 81 88.5 86 79 68.5 68 菌液加入量 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 5.4计数培养基的适用性检查 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、各50～100cfu分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，立即倾注不高于45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，30～35℃培养3天。取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿，立即倾注不高于45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约15～20ml，20～25℃，培养5天。 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。结果记录见表5.2 表5.2计数培养基的菌落数（1ml）   菌种名称 培养基 名称 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌     菌种名称 培养基 名称 白色念珠菌 黑曲霉 胰酪大豆胨琼脂培养基 平皿1 85 82 90 沙氏葡萄糖琼脂培养基 平皿1 81 83 平皿2 87 84 87 平皿2 78 80 平均值 86 83 88.5 平均值 79.5 81.5 对照培养基 平皿1 92 90 95 对照培养基 平皿1 94 91 平皿2 93 89 91 平皿2 90 94 平均值 92.5 89.5 93 平均值 92 92.5 菌回收率 0.93 0.93 0.95 菌回收率 0.86 0.88 根据表5.2结果判定培养基的适用性检查是否符合规定。 5.5供试液制备 本品为抑菌型药物，需氧菌、霉菌和酵母菌采用薄膜过滤法，取供试品10g(10ml)，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液 ，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液 。若需要，调节供试液pH值至6〜8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。 5.6需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法验证 5.6.1试验组： 取供试品上清液1ml加0.1%无菌氯化钠-蛋白胨水溶液至100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜2次（100ml/次），最后一次冲洗液加大肠埃希菌液1ml，将滤膜贴至相应琼脂培养基平板上，培养。 5.6.2菌液组 取上述各菌液1ml用相应的培养基倒平板，每种菌液平行两皿。 5.6.3供试品对照组 取供试液1ml，加入0.1%无菌氯化钠-蛋白胨水溶液100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，过滤两份，滤膜过滤面向上分别置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，作为需氧菌菌和霉菌计数样品对照。 5.6.4稀释剂对照组 取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，过滤，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗两次，每次100ml，最后一次加入试液菌液，分别置于相应培养基平板上培养。 5.6. 5培养温度 胰酪大豆胨琼脂培养基培养温度30〜35℃，培养时间3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20〜25℃，培养时间5 ~7天。 5.6.6验证结果（回收率） 计数方法适用性试验中，采用薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照 组菌落数的值与菌液组菌落数的比值应在0.5〜2范围内。结果记录见表5.3 5.6.7结论 根据上述各试验菌的回收率结果，最终判定检查方法是否适合供试品的需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法。 5.7控制菌检验方法验证 5.7.1控制菌检查用培养基的适用性检查 菌液制备：同5.2项下制得菌液的方法。 控制菌检查中所用培养基的适用性检查结果记录见表5.4 表5.4 培养基名称 促生长能力 抑制能力 指示能力 麦康凯琼脂培养基 分别接种不大于100cfu大肠埃希菌液于麦康凯琼脂培养基和对照培养基中置30～35℃培养18～72小时，观察结果。   用涂布法接种不大于100cfu大肠埃希菌于麦康凯琼脂培养基和对照培养基平板上置30～35℃培养18～72小时， 观察结果。 检验 结果 麦康凯液体培养基 分别接种不大于100cfu大肠埃希菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中置42～44℃培养24～48小时，观察结果。    分别接种不少于100cfu金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中置42～44℃培养24～48小时，观察结果。 检验 结果   根据实验结果判定以上培养基的适用性检查是否符合规定，是否可用于测定本品的控制菌检查。 5.7.2控制菌检查方法验证 5.7.2.1试验组 取供试液1ml，加入0.1%无菌蛋白胨水溶液100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，最后一次加入大肠埃希菌菌液1ml，取出滤膜接入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。 5.7.2.2阴性对照组 取稀释液1ml，加入0.1%无菌蛋白胨水溶液100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，取出滤膜接入100m胰酪大豆胨液体培养基中。 5.7.2.3阳性对照组 取大肠埃希菌菌液1ml，加入0.1%无菌蛋白胨水溶液100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，取出滤膜接入100m胰酪大豆胨液体培养基中。 5.7.2.3培养 取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时，若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。结果见表5.5 表5.5  大肠埃希菌检查结果 试验组 阴性对照组 阳性对照组 大肠埃希菌 + - + 根据表5的实验结果，判定试验方法是否可用于本品的控制菌检查。 6试验结论 按照《中国药典》2015版要求我们对  诺氟沙星胶囊  的微生物限度检查法进行了方法学验证。结果各项指标    符合        规定，证明本方案适合本品的微生物限度检查。 7偏差 验证过程中如果出现偏差，应立即通知验证小组并对偏差进行详细记录，偏差产生的根本原因并提出解决方法。所有偏差得到有效处理后，验证方可进 入下一步骤。 7.1偏差报告 偏差报告 偏差号 偏差描述及建议的纠正措施 验证人员签名 日期 纠正措施的审核和批准 QA主任签名 日期 结果跟踪 QA主任签名 日期 纠正措施产生积极的效果？ 是 否 确认 质量管理部 年    月  日 验证小组 年    月  日 8验证评价及建议 验证评价：在整个验证工作中严格按照验证方案进行了验证，中间未对验证方案进行修改，通过对诺氟沙星胶囊三个不同批次的微生物限度检查法验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对本品进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数是可行的，按照验证的方法检查大肠埃希菌也是可行的。这次在整个验证过程中，较详细地填写了各种记录。 建议：以后在本品检验过程中，须加强偏差的发现和分析，以便及时采取纠正和预防措施。         评价人：                          日期：    年    月    日 9验证报告： 在验证领导小组的组织下，对诺氟沙星胶囊微生物限度检查法进行了验证，于    年  月  日开始按照验证方案实施了验证并于  月  日结束了验证工作。按验证方案的验证，对诺氟沙星胶囊的三批（批号： 160101、160102、160103     ）分别进行了需氧菌、霉菌和酵母菌计数验证以及大肠埃希菌检查法的验证，通过对验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对诺氟沙星胶囊进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查是可行的。在整个验证过程中，较详细地填写了各种记录。 报告人：　                        日期：    年　  月　  日 10验证证书 验证证书 编号：TY-JSB-YZ（06）-013-04  验证报告名称 诺氟沙星胶囊微生物限度检查法验证 验证项目 按照验证方案所设计的标准，对产品的需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查方法分别验证。 验证要求及目的 按验证方案的验证标准，对诺氟沙星胶囊三批（批号：160101、160102、160103、）分别进行了需氧菌、霉菌和酵母菌计数验证以及大肠埃希菌检查法的验证，通过对验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对诺氟沙星胶囊进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查是可行的。 结论 该验证项目及报告已经审核无误，予以批准，特此证明。 再验证周期：本品在产品处方、生产工艺或检验方法变更时，需再做本品的微生物限度检查法的方法学验证。 质量总监签名 :                      年  月    日 表5.3                                        表5.3      诺氟沙星胶囊试验菌回收率测定 试验菌 供试品 菌落计数结果（CFU/ml） 回收率 试验组 菌液组 　 供试品对照组 　 1 2 平均 1 2 平均 1 2 平均 试验组 金黄色葡萄球菌 1 2 3 铜绿假单胞菌 1 2 3 枯草芽孢杆菌 1 2 3 白色念珠菌 1 2 3 黑曲霉 1 2 3