盐酸氧阿苯达唑在鲫体内的药物动力学及残留的研究（可编辑）

盐酸氧阿苯达唑在鲫体内的药物动力学及残留的研究（可编辑） 盐酸氧阿苯达唑在鲫体内的药物动力学及残留的研究 密级 分类号 华中农业大学硕士学位论文 盐酸氧阿苯达唑在鲫体内的药物动力学及残留研究 研究生:陈翠兰 指导教师:操继跃教授 研究方向:兽医药理学 专业:基础兽医学 获得学位时间:年月 获得学位名称:农学硕士 华中农业大学动物医学院 二?年六月华中农业大学学位论文独创性声明及使用毒里掣峨醚泌燃 学位论文 如需保密,解密时间 年 月 日 是否保密 否 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料,指导教师对此进行了审定.与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明,并表示了谢意。 研究生签名: 时间: 山/年 万月 /日 惭埤兰 糊黼张障摊名:懒产讫 签名日期: 莎日 签名日期:沣莎月‖日 汐加年歹月 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 目 录 摘要??.. 缩略语表?。 前言 .立题背景与目的意义.国内外相关研究进展..苯并咪唑类药物研究概况. ..氧阿苯达唑理化性质??.. ..氧阿苯达唑药效学研究?. ..氧阿苯达唑的毒理学研究.. ..氧阿苯达唑的临床应用? ..氧阿苯达唑的药物动力学研究进展..氧阿苯达唑的残留的研究 研究内容及目标 .研究内容. .研究目标。 试验方案 .试验动物. .试验药品与试剂. .试验仪器. .所需溶液的配置. .血液及组织中药物含量分析方法??. ..色谱条件? ..样品的预处理纯化 ..血浆标准工作曲线 ..组织标准工作曲线 ..方法学验证. ..鲫血浆及组织中的药物浓度测定. .药物动力学试验设计..动物分组、给药与采样? ..药物动力学分析? .药物残留试验设计??..华中农业人学届硕士学位论文 ..动物分组、给药与采样? ..药物残留分析.数据处理. 试验结果. .定量方法. ..标准工作曲线及线性范围 ..盐酸氧阿苯达唑色谱行为 ..回收率和变异系数考察数据..灵敏度考察数据?. .试验结果.. ..单剂量给药的药动学分析?. ..药物残留数据分析?.. ..休药期的确定.. 讨论. .生物样品处理条件的选择??。 .流动相的选择?。 .柱温的选择??. .药物动力学??。 ..药动学模型 ..药物动力学特征? .残留消除. .休药期结论. 参考文献?. 致 谢附勇之?.. 附录血浆及组织标准曲线 附录血浆及各组织中加样色谱图及空白对照图 附录检测限色谱图 ?盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 摘 要 作者研究了在和。两个水温条件下,盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物阿 苯达唑砜、阿苯达唑氨基砜在鲫体内的药物动力学特征和残留消除规律。样品 用外标法定量,通过液.液萃取、氮气吹干、浓缩等步骤进行前处理,盐酸氧阿苯 达唑及其代谢产物的含量用反相高效液相色谱法?测定。本研究建立 的标准曲线相关性良好,相关系数均在.以上。氧阿苯达唑、 阿苯达唑砜、阿苯达唑氨基砜.的萃取回收率:血浆中均在 %以上,肌肉、皮肤、肝胰脏和肾脏均在%以上。日内变异系数均小于%, 日间变异系数均小于%。 对鲫以/.的剂量单次:灌盐酸氧阿苯达唑进行药动学研究,结果显 示,在血浆中的浓度明显高于,.在血浆中未检测出。 药物动力学特征表明,盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内吸收较快、分布广 泛、消除半衰期长。水温对药物在鲫体内的药动学过程的影响,低温下吸收速度 相对较慢。由房室模型分析表明,在两个水温条件下、主要代谢产物 的药时曲线均符合有吸收一室开放模型,条件下药物动力 学参数为:吸收半衰期,【.;达峰时间觚.;峰浓度一 戤为./;饿.;消除半衰期.; ./ /?酚;药时曲线下面积 表观分布容积/./;清除率. .“?/为.?/;。条件下药物动力学参 。为., 数为:, .;双.;舣../ . .‘/ .;/ /。; ./;;/ ./; 为 .嵋。/。 在药物残留研究中,以/?的剂量单次口灌给药,于给药后、、 、、、、、、、采集肌肉、皮肤、肝胰脏和肾脏样品进行 分析测定。结果显示,主要转化为,在肌肉、皮肤、肝胰脏和肾 脏中均能检测到,.仅在肝胰脏和肾脏中检测到。在低温条件下盐酸 氧阿苯达唑及其主要代谢产物消除较高温条件慢。两个水温条件下, 在组织中消除均较慢,给药后仍能在各组织中检测到药物。皮肤中药物残留 最多且消除最慢,皮肤又作为大部分鱼类的食用组织,建议将其作为盐酸氧 阿苯 达唑及其代谢产物在鲫体内的残留靶组织。华中农业大学届硕士学位论文 残留试验结果表明,若以/?的剂量单次口灌给药盐酸氧阿苯达唑时, 建议休药期在。不低于,在不低于。 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物;药物动力学;药物残留;高效液相 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 ;.... .? . , .., ,一 %? , % ,, . ? % %. /.. ;. ,, ?. .刀皓 . . , /. . . / . 曲 ../ ./.. , ../ ./ .,. . ./ ./. ./? ,. ..。/ .?/, . .‘/. 谢 / , 华中农业大学届硕士学位论文 ,, ,,,,,, ,,. , ,,, 尼 . . , ?, .谢 .’ , ,, ., 、析 / . : ; ;;; 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 缩略语表 华中农业大学届硕士学位论文 ??。?一 月吾 .立题背景与目的意义 近年来随着集约化水产养殖的发展,养殖密度不断扩大,伴随着养殖环境中 的水域污染日益严重,鱼病已逐渐成为国内外水产养殖业发展的制约因素之一。 由细菌、病毒、寄生虫等病原体引起的疾病频繁发生,其中由寄生虫引起的疾病 占很大的比例。几乎每年都有鱼类寄生虫病如线虫病,绦虫病等的发生,引 起鱼类的死亡率严重的可达%以上陈建华等,;林位琅,。唐电明 报道,某水产养殖场,所饲养的越冬草鱼暴发九江头槽绦虫病,病势凶 猛,发病急。每日死鱼数超过百尾,发病率在%以上,死亡率达%。由此可知 由寄生虫引起的鱼类流行病频繁暴发,来势凶猛,对水产养殖业带来了严重的经 济损失。由于我国是世界上的水产养殖业大国,养殖种类众多,养殖产量占全世 界水产养殖总量的%以上,因而我国也自然成为渔药生产和使用的大国。我国 渔药的种类较多,使用范围较广,由于使用不规范或渔药的滥用、错用以及未执 行规定的休药期等问题而带来了诸多问题:水产品的安全、使用者的健康受到了 渔药在水产品中大量残留的威胁,我国水产品的对外出口创汇受到影响;滥 用渔 药对环境的污染妨碍了水产养殖业的持续发展黄艳平等,;熊清明等,。 因此,开展渔用药物代谢动力学的研究、药物在水产动物体内残留消除的研究, 提出渔用药物的合理使用方法,制定产品的休药期,避免盲目使用,节约治疗成 本,提高治疗效率,保护生态环境,保证养殖水产品的质量,对我国水产养殖的 健康、快速、可持续发展具有直接促进作用。 如今淡水养殖鱼类和海水养殖鱼类由于环境的污染极易患寄生虫疾病。寄生 虫病原可分为寄生原虫类、寄生蠕虫类和寄生甲壳虫类。如寄生于鱼鳃、皮肤、 消化道等器官的双鳞盘吸虫、贝尼登氏吸虫、血吸虫病、指环虫、三代虫、棘头 虫、头槽绦虫以及舌形绦虫等寄生蠕虫,隐鞭虫、艾美尔球虫、小瓜虫等寄生原 虫,对淡水鱼及海水鱼的养殖造成严重的障碍,某些以鱼类为中间宿主的线虫如 异尖科线虫、颚口属线虫等,可寄生于人体、鸟类、哺乳类并导致寄生线虫病, . 对人畜直接带来严重危害。 氧阿苯达唑 ,又称瑞可苯达唑, 、阿苯达唑亚砜,属新型苯并咪唑类驱蠕虫药,具有广谱驱虫性质。防治动 物肝片吸虫、线虫、无卵黄腺绦虫、莫尼茨绦虫等寄生蠕虫。对海水养殖鱼类由 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 双鳞盘吸虫、贝尼登氏吸虫和淡水养殖鱼类由指环虫、三代虫、粘孢子虫等感染 引起的寄生虫病具有显著的治疗效果。氧阿苯达唑是阿苯达唑, 在人和动物体内经肝微粒体酶作用产生的活性代谢产物。由于苯并咪唑类药物在 体内代谢后其代谢产物的极性和水溶性增强,且盐酸氧阿苯达唑属于盐酸盐,因 而直接应用盐酸氧阿苯达唑时克服了其他苯并咪唑类驱虫药溶解度低,在肠道内 吸收不好的缺点。黄立信等研究了氧阿苯达唑用于治疗小鼠继发性细粒 棘球蚴病。研究结果表明氧阿苯达唑的治疗效果明显优于阿苯达唑,而临床用量 为阿苯达唑的一半。应用盐酸氧阿苯达唑驱虫可提高对旋毛虫、棘球蚴和一些组 织内寄生线虫、吸虫的效果,同时显著降低用药成本,提高疗效,具有很好的应 用前景和市场前景。因此研究氧阿苯达唑的药动学与残留消除规律在水产养殖中 的应用更具有紧迫性和现实意义。 目前,由于养殖规模的不断扩大,市场上的滥用、错用药造成药物残留问题 日剧严重,对食品安全造成威胁。食品安全问题一直成为世界各国政府和组织所 关注的问题,食品中违禁药物的检出以及合法药物的超量问题逐渐成为热点问题。 然而国内对水产药物的代谢动力学研究尚处于起步阶段,对水产动物组织中药物 浓度的研究尚较薄弱。虽然国内外采用高效液相色谱法测定人体及动物体内阿苯.,; 达唑及其主要代谢产物已有报道 .,;..。由于水生动物与哺乳动物有较大的种属差异,而且同一种药 物在不同动物体内的药物动力学及残留消除规律存在明显的差异。鲫鱼 是目前人工养殖较多的淡水经济养殖鱼类之一,极易患寄生 虫疾病,盐酸氧阿苯达唑对防治寄生虫疾病具有很好的疗效,而目前在不同温度 下盐酸氧阿苯达唑在鲫鱼体内相关研究尚未见报道。 鉴于上述情况,本试验将从不同温度下探讨盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在 鲫体内的药物动力学和残留消除特征,通过试验获得药动学参数和残留消除规律, 为不同季节水产养殖中的合理用药、制定休药期提供理论依据和数据支持。 .国内外相关研究进展 ..苯并咪唑类药物研究概况 苯并咪唑类,化合物药物作为一类广谱、高效、低毒抗 蠕虫药,特别是对胃肠线虫具有较强的驱杀作用,苯并咪唑类药物的发现及种类 的不断增多,这在医学和兽医学寄生虫疾病的治疗上起了主导作用。自从 华中农业大学届硕士学位论文 等报道第一个以来,在全世界范围内陆续合成了数千种化合物 ,。属于苯并咪唑类药物,对人和动物寄生虫具有较强驱杀作 用。该药是目前应用最广泛的广谱驱虫药,可用来治疗钩虫、蛔虫、鞭虫、蛲虫、 旋毛虫、粪类圆线虫感染,还可用于囊虫病和包虫病的治疗。将该药治疗华支睾 吸虫病,亦有良好的疗效。最近新研制的又一类新型苯并咪唑类药物??氧阿苯 达唑 ,,在体内由经肝脏微粒体酶氧化而成, 是主要活性代谢产物,少量的在动物体内在牛、绵羊、鸡等体内居多 缓慢代谢为,随即代谢为.中国兽药典,。 一??。』复卜一一一, 厶 一‘?竺多惫?。一”““~ 。芦~罾正卜一?釜丝譬一~一一‰ ?“ 一州 一~血复卜?型竺乒~卜复卜?, ??’? 蛐毫?????冉咀憎 图.阿苯达唑及其代谢物和降解产物结构式 . ..氧阿苯达唑理化性质 盐酸氧阿苯达唑又称盐酸丙硫苯咪唑亚砜,化学名为.丙基亚磺酰基.. 苯并咪唑..基】.氨基甲酸甲酯盐酸盐;化学式:.,分子量:.。 呈弱碱性、水溶性极低,易溶于冰醋酸,甲醇等有机溶剂,其盐酸盐 易溶于水,通用名为氧阿苯达唑盐酸盐,中文别名为丙硫苯咪唑盐酸盐,类白 色或 淡黄色粉末,微具酸臭味,熔点.?~.?。 【: 图.氧阿苯达唑化学结构图 . 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 ..氧阿苯达唑药效学研究 ...氧阿苯达唑驱虫作用机理 氧阿苯达唑又称阿苯达唑亚砜,是阿苯达唑经体内肝微粒体酶代谢后生成的 主要活性产物。阿苯达唑的抗虫活性主要表现在其代谢产物阿苯达唑亚砜。 其作 用机理主要是与寄生虫的微管蛋白结合进而发挥作用,以能够抑制寄生虫肠壁 细胞胞浆微管系统的聚合,阻断虫体对多种营养成分和葡萄糖的摄取吸收, 导致虫体内源性糖原耗竭,并抑制延胡索酸还原酶系统,阻止三磷酸腺苷的 产生,致使虫体无法生存和繁殖 .,。 .,; ...氧阿苯达唑的驱虫谱 该药具有广谱、高效、低毒、安全等特点,对动物寄生虫具有较强的驱杀作 用。不但对成虫具有强的驱虫作用,对未成熟虫体和幼虫也有较强的作用,还有 杀虫卵的功效,对动物线虫、吸虫、绦虫均具有驱杀作用。该药主要用于猪、牛、 羊、马、猫、犬、家禽等多种动物的胃肠道绦虫、肺线虫及肝片吸虫,;.。等寄生虫的防治。对奥斯特线虫、马歇尔线虫、血矛线虫、 毛圆线虫、细颈线虫、食道口线虫、古柏线虫、莫尼茨绦虫、夏伯特线虫、网尾 线虫、乳突类线虫、捻转血矛线虫、仰口线虫、猪蛔虫、鸡蛔虫均具有驱杀作用。 随着用药范围的不断扩大,该药也普遍应用到水产养殖上,如对淡水鱼的双鳞盘 吸虫鳃部,贝尼登氏吸虫、指环虫、三代虫以及粘孢子虫等均有良好的治疗 作 用。 ..氧阿苯达唑的毒理学研究 毒理学试验表明 .,,苯并咪唑类药物毒性较小,安全性 好。但在苯并咪唑类药物中阿苯达唑属于毒性较大的一种,在使用剂量范围内虽 不会引起中毒反应,但实际应用中由于使用者的连续超剂量给药,仍然会带来严 重的不良反应朱模忠,。同时,由于临床上频繁用药且连续长期使用,引 起蠕虫耐药性的产生,并且有可能产生交叉耐药性朱模忠,。动物试验证 明阿苯达唑具有胚胎毒性及致畸作用,虽然对小白鼠的生殖功能无影响,也无 上,但对妊娠~ 致畸胎的不良作用,而且犬口服最大耐受量在/ 周的绵羊服用阿苯达唑可诱发各种胚胎畸形,大多数为骨骼畸形。因此阿苯达唑 及其代谢产物已成为动物源性食品残留中的监控对象之一李俊锁等,,并 被列入《中华人名共和国动物及动物源食品中残留物质监控》药物之中。 华中农业大学届硕士学位论文 ..氧阿苯达唑的临床应用 ...氧阿苯达唑在水产养殖中的应用 近年来由于水产养殖的规模化和集约化,水产动物的寄生虫疾病日益严重。 为了防治的需要,阿苯达唑也逐渐应用于防治水产养殖疾病中,对控制水产 动物 体内外寄生虫疾病发挥了一定的作用。 韦祖礼用阿苯达唑以/.,且鱼用阿苯达唑拌合饲 料制成药饵,每天早晚各一次,连续投喂,治疗草头鱼和鲤鱼九江头槽绦 虫病中结果得出疗效显著。 张梁在报道大口鲶常见病害与防治中指出阿苯达唑对治疗大口鲶的 绦虫病具有很好的疗效。 林岗等进行了阿苯达唑对秀丽三代虫进行杀灭试验,试验结果表明 阿苯达唑对秀丽三代虫有较强的杀灭能力,有效浓度为/,杀灭浓度为/。 阿苯达唑对鱼苗半数致死浓度为/,安全浓度为./。 ...氧阿苯达唑在家畜中的应用 陈德明等报道了按照一定的剂量对绵羊的捻转胃虫、奥氏线虫、 毛圆线虫。原圆形肺线虫、丝状网胃肺线虫、钩虫、细颈线虫的驱除效果均 为%, /次给药对矛形腹腔吸虫、鞭虫的驱除率分别为.%、.%,对羊 鼻蝇蛆无驱除效果。 王大菊等研究了将直接用于绵羊蠕虫的驱除。口服高剂量组 对毛首线虫的驱除率分别为%和%,中、高剂量组对莫尼茨绦虫的驱除率均 为%。表明该药物对治疗绵羊的蠕虫病效果确实,且具有高效、广谱、作用迅 速、作用强、无毒副作用等特点。 ...氧阿苯达唑在人体内的应用 .,指出成人 应用于人体内寄生虫治疗较多。相关报道 若按照单剂量服一次,对蛔虫病、钩虫病、鞭虫病和粪类圆线虫病的治 愈率分别为.%~%、.%%、%及%。赵慰先按以上同 样的剂量,连服,对钩虫病的治愈率高达%,治疗结果均显示该药的驱虫作 用强,效果佳。 等用治疗人体棘球蚴病,证明该药对治疗棘球蚴具有较好 的效果。孙忠贵等也得出此结论,该药被世界卫生组织推荐为 治疗棘球蚴病的主要药物之一。 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 ..氧阿苯达唑的药物动力学研究进展 ...氧阿苯达唑在猪体内的药物动力学研究 等对猪在饲喂不同日粮下口服的药物动力学进行了研究。 选取试验猪头,给药后采取血样,处理样品后,采用进行检测。 原形药均未检测出,和作为主要代谢产物在给药后、、 血浆中均能检测出,低浓度的.在给药后、每头猪体内均能检测 出。在对饲喂不同饲料的猪经口服后血浆中和的平均血药浓 度差异极显著.。放牧的猪的./?/比饲喂浓缩料的猪 .?/和饲喂乳清谷物料的猪.嵋。/高..倍。 李春明等研究了.%复方伊维菌素注射在猪体内的药物动力学。 测定血浆中有效成分的浓度。盐酸氧阿苯达唑在血浆中的药时曲线符合有 吸收二室开放模型,其主要药物动力学参数为:为..;/为 霹 .士.;为..?/;/为.士./;为 .士./.;戤为.士.:麟为.士./。 ...氧阿苯达唑在牛、羊体内的药物动力学研究 善 谢慧心等研究了成年黄牛/?剂量口后,定时采取 血样和皱胃液,通过乙醚提取药物,用测定血浆和皱胃液中的药物浓度。结 善 果原药在胃液中未能测出,而具有活性的代谢产物和在给药后 .生.和.士.;双分别为 仍可测出。和的戤分别为 .士./和.士./;给药后血浆中原药亦未能测出,而具有活性的 代谢物和在血浆中的药物动力学参数为:的/为.土. ,默为.士.,觚为.士.肛/:的为.., 戡为.士.,瞰为.士./。 等报道了在牛体内的药物动力学研究。以 ./.剂量分别通过静脉注射、皮下注射和灌胃给药。给药后定时采集血 浆样品,血浆样品通过检测。结果表明,静脉注射给药后的药时 曲线符合二室开放模型,皮下注射和灌胃给药后均符合一室开放模型。静脉 注射 给药后血浆中消除快,给药后未检测出药物:皮下注射给药后仍能检测 到药物,驭为.士./:灌胃给药后,血浆中的浓度较高 .士./,给药后分别为.士.、.士.、..。/。华中农业大学届硕士学位论文 及其代谢产物在牛、羊体内的药物动力学的相关研究均有报道.,; .,; .,; .,;.,。 .,; ...在人和其他动物体内的药物动力学研究 .,; ., 在狗体内的药物动力学研究 ., .,; 和在人体内的药物动力学研究 均有报道。除以上相关报道外,国内外许多学者对在动物体内的 药动学研究报道见表.。 表口服或肌注阿苯达唑后不同动物体内的氧阿苯达唑的药动学参数 及相关作者一. ..氧阿苯达唑的残留的研究 ...兽药残留限量 兽药残留 :是指食品动物用药后,动物产品的 食用部分与所有药物有关物质的残留,包括原型药物或/和其代谢产物。 及其代谢产物是我国兽医临床使用广泛的苯并咪唑类药物,是驱虫谱较广, 杀虫 作用最强的抗寄生虫药物之一。反复使用时容易在牛、羊、猪等可食性动物 组织 中残留,动物试验证明及其标志残留物具有胚胎毒性及致畸作用,给人 类健康带来威胁,许多国家及欧盟等都规定了它们动物可食性组织中的最大残留 限量,为保证动物性食品卫生安全,因此必需加强兽药残留监控工作,根据《兽 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 药管理条例》规定,年月号国家农业部公告第号组织修订了《动 物性食品中兽药最高残留限量》,在此公号中制定了阿苯达唑及其代谢产物在牛、 羊体内的最高残留限量。见表.。 表阿苯达唑及其代谢物在牛羊动物性食品中的最高残留限量 一该标准中还规定了其残留标识物为、、及., 日允许摄入量为~/?/。..部颁标准规定羊服用 以~/?/停药期为。 ...苯并咪唑类兽药残留前处理方法的研究 国内外对动物性食品组织样品中的前处理方法的相关报道较多。 陈毓芳等采用碱化的乙酸乙酯提取动物组织中的丙硫苯咪唑、 噻苯咪唑酯、丙苯咪唑及苯硫达唑,回收率较高。 贾丹丹等采用磷酸缓冲溶液和乙酸乙酯混合溶液两次提取黄鳝血浆 中的及其代谢产物,及其代谢物在血浆中的回收率为.%.%, 能得到较好的回收率。对及其代谢产物在羊、牛、猪等动物可食性组织中的 提取方法相关文献报道较多邱银生等,:蔡勤仁等,:.,。 .,; .,; .,; ...苯并咪唑类残留检测方法的研究 及其代谢产物在动物性食品组织中的检测方法,随着各种检测技术的不 断提高,多种检测方法已在国内外均有报道。主要包括高效液相色谱法、 液.质.联用法、气.质.联用法,其中以法应用最为普遍。 柱,以乙酸的甲 薛东红等采用高效液相色潜仪、 醉溶液作流动相,对人血样、猪血样内的及其主要代谢产物、 进行了分离。以甲苯咪唑为内标,测得变异系数均小于%,检测限为./。 等利用离子对萃取法提取牛奶中的几种苯并咪唑类药物。将样 品与倍体积的乙腈混合,离心,取上清液,加正己烷去脂,蒸去溶剂,加入氯仿 和含/辛基硫酸钠的.%磷酸溶液,离心移取氯仿层,浓缩后取上清液,华中农 业大学届硕士学位论文 上高效液相色谱缫外法测定。 等研究了人体血液代谢消除规律,样品通过乙酸 乙酯液.液萃取,采用.色谱柱,以甲醇:乙腈:冰醋酸:水:::, /、,、,,为流动相,荧光检测器,结果显示在血浆中未检测出,、 、.的最低检测限分别为、和/,本方法能满足药物 动力学和残留的检测要求。 等研究了及其代谢产物在虹鳟鱼、罗非鱼及大西洋鲑鱼 体内的代谢和残留消除规律,以/?剂量灌喂后,在不同的时间点采 集样品,经萃取浓缩后,采用高效液相色谱法荧光检测器分析,以乙腈.醋酸 铵缓冲溶液:,/为流动相进行测定。结果显示在未能检测到, 其代谢产物在大西洋鲑鱼体内给药后残留量低于/,而在虹鳟鱼、 罗非鱼体内给药后残留量均低于/;在该三种鱼体内残留量均低 于/,给药后体内残留量低于/。 研究内容及目标 .研究内容 建立盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫血浆、肌肉、皮肤、肝胰脏和肾脏中 的提取和反相高效液相色谱分析方法; 研究两个水温条件下和。盐酸氧阿苯达唑经单次口灌给药后在鲫体 内的药物动力学特征; 研究两个水温条件下和盐酸氧阿苯达唑经单次口灌给药后在鲫体 内的残留消除规律。 .研究目标 确定两个水温条件下盐酸氧阿苯达唑经单次口灌给药后的药动学模型及特 征 参数达峰时间,峰浓度,消除半衰期等,为不同季节该药物的合理用药提供科 学的理论依据; 依据两个水温条件下盐酸氧阿苯达唑经单次口灌给药后盐酸氧阿苯达唑及 其 代谢产物在鲫组织中的残留消除规律,制定不同季节鲫口灌给药的休药期。 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 试验方案 ..试验动物 采用尾体重为:的健康鲫,适应性饲养一周,饲喂不添加抗寄生 虫药物的鲫全价配合饲料并采用循环水养殖,为了维持水中含氧量,试验期 间使 用增氧机以便充气。在不同季节,通过加热棒将试验水温分别控制在:? 和士?。试验前禁食,试验期间不再喂食。 .试验药品与试剂 盐酸氧阿苯达唑原料药含量:.%;批号:购自四川华蜀动 物药业有限公司; 阿苯达唑亚砜对照品:含量:.%;批号:购自四川华蜀动物 药业有限公司; 阿苯达唑砜对照品含量:.%,批号:,阿苯达唑氨基砜对照 品含量:.%,批号:,均购自武汉康隆世纪科技发展有限公司; 乙腈、甲醇、乙酸乙酯为色谱纯,醋酸铵,冰醋酸,氢氧化钠,正己烷,肝 素钠等均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司。 试验仪器 公司生产 型高效液相色谱仪 美国 美国 上海标本模型厂生产 .型高速分散均质机 型液体快速混合器 江西医疗器械厂生产 .型微型涡旋混合仪 上海沪西分析仪器厂生产 .型电子天平 德国赛多利斯天平公司生产 岛津型分析天平 岛津国际贸易有限公司生产 武汉市琴台医疗器械厂生产 型不锈钢电热恒温水浴锅 江苏昆山超声仪器有限公司生产 .型超声波清洗机 .型台式离心机 上海安亭科技仪器厂生产 .型自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂生产 .型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司生产 一次性注射器 武汉恒康医疗器械有限公司生产华中农业大学届硕士学位论 文 .所需溶液的配置 标准储备液:精密称取、、.对照品适量分别加 入棕色容量瓶中,用冰乙酸溶解并用甲醇定容至刻度,混匀即得到浓度为 /的标准储备液,置。冰箱保存。 ., 血浆标准工作液:用甲醇将储备液倍数稀释成下列浓度:,,, ,.,./。 肌肉、皮肤、肝胰脏和肾脏标准工作液:用甲醇将储备液倍数稀释成下列浓 度:,,,,,,./。 盐酸氧阿苯达唑口灌药液:将盐酸氧阿苯达唑原料药用三蒸水配制成 ./溶液。 ./氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠,加水至容量瓶中定容,. 滤膜过滤待用。 肝素钠离心管的制备:先将粉状肝素钠配成%的肝素钠溶液,然后向每支塑 料离心管.中滴.,置于恒温干燥箱中。烘干。 .血液及组织中药物含量分析方法 ..色谱条件 柱 色谱柱: .,; 流动相:乙腈:./醋酸铵溶液:,冰醋酸调节.; 紫外检测波长:: 流速:./ 柱温:。; 进样量:。 ..样品的前处理纯化 以血浆样品为例,筛选样品前处理方法。取具塞离心管,每支为一 组编号。向每支离心管中加入空白血浆。然后向每组离心管中分别加入~ “/四个不同质量浓度的各药物储备稀释液,混匀,制得含药血浆样品。 方法:提取剂为./的氢氧化钠溶液和乙酸乙酯。向含~/的一 组药物血浆中分别加入.乙酸乙酯,涡旋,充分萃取后,/离 乙酸乙酯重 心,吸取上清液移入另一离心管中,残渣再加入. 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 复提取一次,合并上清液,在。~水浴中通氮气吹干。用甲醇?溶解 残渣,混匀,超滤后上检测。 方法:提取剂为乙腈和乙酸乙酯,具体提取操作步骤同上; 方法:提取剂为二氯甲烷,具体提取操作步骤同上; 以上各方法为防止震荡时产生乳化可加无水乙醇并用正己烷去脂。 用流动相稀释各标准储备液,配制成三个不同浓度的储备稀释液上, 做个平行,根据下式计算不同浓度的萃取回收率: 萃取回收率话拿纂鬻需需‰×,。。% 从样品提取的浓缩时间、药峰与杂峰分离情况及萃取回收率三个方面进行综 合评价,比较三种提取剂的提取、纯化效果。纯化结果见表.。通过综合评价 确定血浆样品的处理方法。 表纯化结果 ...血浆样品处理 取血浆样品,准确吸取“血浆于离心管中,加入./的氢氧 化钠,再加入乙酸乙酯,水平振荡,然后以/离心, 取上层有机相于另一离心管,为了提高回收率再加乙酸乙酯重复提取一次, 合并两次上清液在。..。水浴中通氮气吹干。向萃取残渣中准确加入? 流动相使之溶解,以/离心,取上清液进样分析。 ...组织样品的处理 待分析的组织样品包括肌肉、皮肤、肝胰脏和肾脏。样品的处理方法与血浆 样品处理方法相似。将肌肉或皮肤剪成小块,匀浆,称取肌肉和皮肤组织匀浆 于离心管中,为提高萃取回收率,分别加入乙酸乙酯进行两次萃取。 华中农业大学届硕士学位论文 萃取残渣用流动相溶解,正己烷去脂一次,混匀,静置后,吸 下层液体离心,取上清液进样分析。 由于肝胰脏与肾脏.样品按照血浆方法提取后杂质干扰较多, 通过多次摸索后,在血浆样品处理方法的基础上进行了优化,在用乙酸乙酯 提取 后合并两次的上清液中按照:的比例加入三蒸水,涡旋,以/ 离心,吸下层有机相于另一离心管,在~?水浴中通氮气吹干。萃 取残渣肝胰脏样品用.,肾脏样品用此流动相溶解,正己烷去脂两次, 离心,取上清液进样分析。 ..血浆标准工作曲线 向支具塞离心管中各加入肛空白血浆,然后依次加入“.”中的 血浆标准工作液,便得到药物浓度依次为、、、.、.、.、.“/ 的血浆样品。按照“...血浆样品处理方法”处理后,分别取上清液,上 进行测定。以测得的药物峰面积为横坐标,药物在样品中的质量浓度 为纵坐标,建立标准曲线,并求出回归方程及相关系数。 ..组织标准工作曲线 向支具塞离心管中各加入肾脏.组织匀浆,然后依次加入 .中的各组织标准工作液,便得到药物浓度依次为、、、、.、 .、.?的组织样品。按照“...组织样品处理方法”处理后,进样分析, 以药物的峰面积为横坐标,药物在样品中的浓度为纵坐标,建立标准 曲线,求出回归方程以及相关系数。 ..方法学验证 取空白血浆和组织,添加适量盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物,配制成各药物 浓度分别为、.、.肚/的血浆样品和/、、的组织样品, 按照血浆及组织样品的处理方法处理并进行检测,每个浓度设置个样品 以测定日内变异系数,连续重复以测定日间变异系数。所建立方法的萃取回 收 率、精密度以及灵敏度根据以下公式进行计算: 准确度萃取回收率加样提取后进样的药物峰面积/标准溶液进样的峰面 积×%; 精密度日内变异系数、日间变异系数标准差/平均数%; 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 检测限:是以仪器能测定的信噪比/时,药物在样品中的 最低浓度作为; 定量限:是以仪器能测定的信噪比/?时,在准确度和精密 度均符合要求时,药物在样品中的最低浓度作为。 ..鲫血浆及组织中的药物浓度测定 将测得的血浆和组织中的氧阿苯达唑及其代谢产物各药物峰面积代入 血浆和组织标准曲线回归方程,求得血浆和组织中各药物浓度。 .药物动力学试验设计 ..动物分组、给药与采样 将鲫分为和药动组。采样时,将鲫按采血时间点分组,每组尾。 给药时将配制好的盐酸氧阿苯达唑口灌药液按照/?的剂量单次灌, 无回吐者保留试验。正式给药前禁食并采集空白血浆作为对照样品。经口灌 给 药后,药动组分别于.、、、、、、、、、、、、、、 采集血样,每尾鱼尾静脉采血左右,置于经肝素钠处理的塑料离心管中, /离心,分离血浆于.。冰箱保存,待测。 ..药物动力学分析 经过单次口灌给药以后,所得药时曲线经过有吸收一室模型和有吸收二室模 型拟合。药物动力学参数计算用药动学软件分析,根据’ 值与残差平方和最小,判断最佳药物动力学模型操继跃 等,。 .药物残留试验设计 ..动物分组、给药与采样 将鲫分为和残留组。采样时,将鲫按采血时间点分组,每组尾。以 /?的剂量单次口灌给药,无回吐者保留试验。正式给药前禁食并采 集空白组织作为对照样品。于给药后、、、、、、、、、 取肌肉背脊两侧、皮肤、肝胰脏和肾脏组织,置于.?冰箱保存,待测。 华中农业大学届硕士学位论文 ..药物残留分析 在残留消除试验中,药物在体内的经时过程进入消除相之后,基本符合一级 动力学过程,在肌肉等各组织中的药物浓度主要按照指数速率消除:?韶 表示药物浓度,表示初始浓度,表示消除速率常数,经过最小二乘法回归分 析,得出消除曲线方程及消除速率常数,最后可以通过公式,伽./计算盐 酸氧阿苯达唑及其代谢产物在各组织中的,/妇。依据药物在各组织中的、以 及 该药物在相应组织中的,参照以下公式便可计算休药期: ?帅刀 .数据处理 各组织中的药物浓度.时间数据通过最小二乘法回归分析;药时曲线图和消 除 动态图采用软件绘制;方法学验证考察数据采用软件分析处理。 试验结果 .定量方法 ..标准工作曲线及线性范围 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在线性范围内,线性关系较好,相关系数均在 .以上,在各组织中的标准曲线见附录。表 及其代谢产物在鲫血浆和组织中的标准工作曲线 组织 药物 回归方程 相关系数 茹萎麓 ※表示的峰面积表示在各空白组织中的浓度 ..盐酸氧阿苯达唑色谱行为 在本试验建立的色谱条件下,基线平稳,峰形良好,虽有杂峰出现,但盐酸 氧阿苯达唑及其代谢产物之间、药物与杂质之间均能达到较好的分离见附 录, 测定方法简便,重复性好,分析每份样品的时间均不超过,分析效率高。 ..回收率和变异系数考察数据 参照..所描述的方法,在血浆和组织中添加药物,所测回收率及精密度数 据见表.,色谱图见附录。采用本方法,在血浆和各组织中的 萃取回收率分别为:血浆中:.%..%,肌肉中:.%.%,皮肤 中:.%.%,肝脏中:.%.%,肾脏中:.%.%。日 内变异系数均小于%,日间变异系数均小于%。 在血浆和各组织中的萃取回收率分别:血浆中:.%~.%,肌 肉中:.%.%,皮肤中:.%.%,肝脏中:.%.%, 肾脏中:.%.%。日内变异系数均小于%,日间变异系数均小于%。华中农业大学 届硕士学位论文 在血浆和各组织中的萃取回收率分别:血浆中:.%~ .%,肌肉中:.%.%,皮肤中:.%一.%,肝脏中:.%~ .%,肾脏中:.%.%。日内变异系数均小于%,日间变异系数均小 于%。 表.鲫空白血浆中添加氧阿苯达唑的方法学考察结果 伽 ※..标准差以下类同 ※.. .....................................................一盐酸 氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 表.鲫鱼空白血浆中添加阿苯达唑砜的方法学考察结果 伽 %, 嚣?%裔间 嚣盟回收率%,平均回惮 .士. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .::. . . . . . . . . 表:鲫鱼空白血浆中添加阿苯达唑砜氨基砜的方法学考察结果 . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . .华中农业大学届硕士学位论文 表.鲫鱼空白肌肉中添加的方法学考察结果 伽匀 % 回收率% 平均回收率? 箸威祟 裟麓 . . . .士. . . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . . . .土. . . . . . . . . . . 表.鲫鱼空白肌肉中添加的方法学考察结果 研 %, 回收率%,平均回收率? 署驭晶 黧麓 . . .士. . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . .些堕墨堕苎笙些壑基垡塑兰塑垄竺竺堕堕垫塑垫查兰垦塑堡塑窒 一 ???????????????????????????????一??。一一 表.鲫鱼空白肌肉中添加的方法学考察结果? ??????????????????????????????????????????????????????一???? ??????????????????????????????????????????一 盏竺釜 竺竺竺竺:竺 鋈茎釜 . . .:. . . . . . . . . . . . . .:. . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . :.?? .. ???????????????????????????????一一 ? 表.鲫鱼空白皮肤中添加的方法学考察结果 . . . . . . . . . . .士. 。 . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . 华中农业大学届硕士学位论文 表鲫鱼空白皮肤中添加的方法学考察结果 伽 表.鲫鱼空白皮肤中添加的方法学考察结果 . 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 表.鲫鱼空白肝胰脏中添加的方法学考察结果 . 伽匀 平均回收率 精密度..% 回收率% 霎竺药物 一? 士..% 日内 日间 浓度/ .. . 。 . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .士. . . . . . . . . . 表.鲫鱼空白肝胰脏中添加的方法学考察结果 .伽 回蜱%韵臀蜗。‘ 等郧。‰ 溅渤瞒物/ . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 华中农业大学届硕士学位论文 表.鲫鱼空白肝胰脏中添加的方法学考察结果 也回 表.鲫鱼空白肾脏中添加的方法学考察结果 ? 铆习盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 表.鲫鱼空白肾脏中添加的方法学考察结果 . 伽 回收率%平堋惮..% 叫 蓁袈药物 浓度 . .士. . . . . . . . . . . . ??????????????????一? 。士. . . 霉??篓?一 . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 署邸?晶/华中农业大学届硕士学位论文 ..灵敏度考察数据 各药物在血浆及各组织中的和的考察数据见表,色谱图见附录。 表. 及其代谢产物在血浆和组织中灵敏度考察数据 ?? .试验结果 ..单剂量给药的药动学分析 给鲫以/?的剂量单次口灌盐酸氧阿苯达唑溶液后,及其主 要代谢产物血药浓度的数据见表.,药物动力学参数见表.,药物 在血浆中的药.时曲线见图.~.。经房室模型分析,在两个水温条件下, 、血药浓度.时间数据均符合一级有吸收一室开放模型。血浆中的 药物浓度主要以的形式存在,在血浆中以较低浓度出现, .在血浆中未测出。和消除均较慢,尤其是在低温条 件下,给药后仍在血浆中检测到。 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 表? 和条件下单次口灌给药后盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体 内的血药浓度‘ . .. ...士. .士..圭. .. .. .. .::. .. .. .. ., ,士. .: . .. .. .. . 士. .. .土. .. .. .. .. .? . . .. .. .士. .士. .. ... . .. .... .. .七. .. .士. .士. .:. .. .士. .. .. .. . ... ※未检出下同※ 表. 和。条件下单次口灌给药后盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内 的药物动力学参数 阻 . ? 单位 参数。? ? . . . . ./ . / . . . . / . . . . . . . . . . . ,【 . . . . / . . . . 嘣 . . . . 螂 . . . . \壮 . . . . 舭魄舭 . . . . /‘ 华中农业大学届硕士学位论文时间 图在和。两种水温条件下盐酸氧阿苯达唑经口灌给药后的 的血药浓度.时间曲线 . ? 一目盖毯蟥时间 图 和两个水温条件下盐酸氧阿苯达唑经口灌给药后的血 药浓度.时间曲线 . ? 盐酸氧阿苯达唑及其代谢产物在鲫体内的药物动力学及残留研究 ..药物残留数据分析 给鲫以/的剂量单次口灌盐酸氧阿苯达唑后,及其代谢产 物在各组织中的药物总浓度随时间变化的数据见表.表.;消除方程、相 关系数及消除半衰期见表.。两个水温条件下药物在鲫体内的消除曲线见图 图.。试验结果表明:不同温度下药物的消除速率不同,高温条件下的消 除速率明显快于低温条件下的。各组织中主要以的形式存在, 以较低浓度出现,在肌肉和皮肤中均未检测到,仅在肝胰脏和肾脏 中检测出。在两个水温条件下,药物总浓度从各组织中的消除由快到慢依次 为肌 肉、肝胰脏、肾脏、皮肤。与其他组织相比,给药后皮肤中残留药物浓度最 高, 皮肤又作为主要的食品组织,且消除最慢,在给药后的仍能检测到较高的药 物浓度,显示出药物在皮肤中有蓄积的可能。 条件下及其代谢产物在鲫肌肉中的浓度 表. .