甘蔗果糖6磷酸2激酶果糖26二磷酸酯酶基因F2KP的克隆及其功能研究（可编辑）

甘蔗果糖6磷酸2激酶果糖26二磷酸酯酶基因F2KP的克隆及其功能研究（可编辑） 甘蔗果糖6磷酸2激酶果糖26二磷酸酯酶基因F2KP的 克隆及其功能研究 甘蔗果糖磷酸,激酶果糖 ,二磷酸酯酶基因 的克隆 及其功能研究 周平 何炜张建福 逯平杰 苏轶 叶冰莹 雷美华 陈由强 陈如凯 福州(国家)水稻改良分中心农业部闽台农作物种质资源利用重点开放实验室福建省作物分子育种工程实验室 福建省水稻分子育种 重点实验室福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地 福建省农业科学院水稻研究所,福州福建 师范大学生命科学学院,福州 农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室,福州 福建省农业科学 院果树研究所,福州 沙县金沙高级中学,沙县果糖 磷酸, 激酶 果糖 , 二磷酸酯酶, ,,是影响生物碳积累和分配的调控关键酶,同时也是一个具有激酶和酯酶两种催 化活性的双功能酶。本研究在已获得甘蔗 蔗叶命名为 的基础上, 以蔗茎 为模板克隆获得不同长度的同源片段,分别命名为 、 和 。 生物信息学结果显示, 的蛋白具有完整的激酶和酯酶结构域, 、 和 所含开放阅读框长度均小于 ,其中 翻译的蛋白只具残缺的激酶结构 域; 翻译的蛋白具完整激酶结构域但缺失酯酶结构域;只能翻译数个氨基酸即终止 翻译。选择双功能域完整的 构建达载体,农杆菌 )介导转化烟草 。 证实, 在转基因植株成熟叶中转录表达。碳水化合物等生理指标 测定结果表明,转基因植株成熟叶片中可溶性总糖 淀粉、还原糖 淀粉、蔗糖淀粉比值均有不同程度 的升高,碳水化合物含量和相关分配比率发生改变。研究结果提示,甘蔗中可能存存不同的转录产 物,并初步证实甘蔗 在光合组织中对蔗糖和淀粉的分配起到一定的调控作用,为进一步研究甘 蔗 基因的功能及为甘蔗分子育种提供参考依据。 甘蔗转基因 烟草 转录产物农业部现代农业产业技术体系建设专项 和国家自然科学基金万方数据 雠物技术铷 。/ ., ,; , , ,; , ,, ; , , ; ,“ , ” ,.. , 一,一/,一 , . .。 .? . , ,. ? , ,? . , , / , , ./, / / . 砣.. , ,, 植物果糖..磷酸,.激酶/果糖..二磷酸酯 外显子 分析表 .,。 明,在植物其他物种中也只有一个基因 酶一,一/一. ., ; ,; ,是~种具有双向催化能力的双 ., 功能酶,具有激酶和酯酶两个功能域 .,。目前已从水稻、玉米、拟南 芥、马铃薯、木榄等高等植物中克隆到砣即 ,能分别催化生物体内重要碳代谢调节信号 片段,预测它们编码的舣功能蛋白质分子量 分子果糖一一二磷酸.,, .,:的合成与降解。研究表明,在植物光合 大约为 ..。不同植物 蛋白结构相近且可划分为个区域:高度保守的激 细胞中,通过调节胞质.,.:浓度影响质 体与细胞质问的碳分配:当光周期启动后,:固 酶与酯酶两个核心结构域以及高度多样性的: 端和端两个调节区域。另外某些植物中还 定形成的光合中间产物磷酸丙糖?,一部分 输出到胞质中合成蔗糖,一部分则留在质粒合成 存在仅具有酯酶活性的单功能酶,例如在绿豆、蓖 淀粉。若此时.,.:过量,则抑制蔗糖代谢路径 麻仔、菠菜以及朝鲜蓟等植物中有发现 中的关键限速酶果糖一,二磷酸酯酶 .,。研究发现与单功能酯酶相比,戳功能 活性,蔗糖合成受阻,使胞质中?大量积累, 酶的酯酶活性与底物一,一,的亲和力更高,是 影响质体中.的输出,滞留在质体中的 前者的 倍 .. 。 ?则被合成淀粉储存。植物体由此通过 迄今为止,采用基因工程手段进行功能 .,.:含量的变化调控光合细胞中淀粉与蔗糖 研究方法主要有两种:一种方法是在植物绸织中表 之间的碳分配 .,。 达改造过从大鼠肝脏克隆的砣即,并有 研究表明在植物中一个基因编码一个 ., 针对性地提高或降低其激酶或酯酶活性 蛋白。拟南芥编码砣即基因全长,包含个; .,; .,;另一 另万方数据甘蔗基因的克隆及其功能研究 麟呲‘?九‘研记讥唧 种方法是通过反义表达或共抑制表达的方法,改变 酶结构域;.蛋白含有完 整的激酶结构域 但酯酶结构域缺失;.只能翻译几个氨基 植物同源蛋白活性 .。; 酸即终止翻译。蛋白质保守结构域预测如图所示。 .,。开展的转基因研究主要集中 在植物光合组织中,研究证实提高激酶活性 .檀物囊达载体的构建 或降低酯酶活性的转基因植物叶组织中蔗糖合成 新的植物表达载体是由取代 含量均减少,己糖不断积累:相应地降低激 , 中的构建而成,大小约 酶活性或提高酯酶活性,蔗糖/淀粉之间的碳分配 带有毋?和 酶切位点。载体质粒经矽 比明显升高,碳分配倾向于合成蔗糖,同时导致淀 ?和 酶切消化,释放插入片段 粉积累延迟。现有的研究均表明在光合组织中双功 约. :释放载体部分大小约 能酶能通过两种催化活性调节.,.的 。琼脂糖凝胶电泳检测表明泳带大小符合 含量,从而对碳分配起到非常重要的调节作用 预期图。测序检测重组质粒,证实目的基因插 .。。本研究首次克隆表达甘蔗 入,序列正确无误。 ,并试图通过对转基因植株生理指标 检测,探讨该基因改变碳分配提高甘蔗蔗糖含量的 .转基因烟草的获得及分子检测 可能性,为甘蔗分子育种提供参考依据。 ..烟草转化植株基因组的检测 结果与分析 农杆菌介导叶盘法侵染烟草,潮霉素筛选抗性 苗。所得代抗性植株移栽入土,???、/ .蔗叶和蔗茎 片段的克隆 光周期培养个月,观察生长状态和植株表型 何炜等首次报道,基于电子克隆, 图。以潮霉素筛选获得的烟草抗性苗基因组 通过拼接序列设计.引物,从蔗叶中 为模板,使用.和砣? 成功克隆先前未知的甘蔗,‘命名为 嘏引物进行扩增,扩增产物琼脂糖凝胶电泳 如眩,登录号。该片段含 检测图。由图可知,扩增产物与预期一致,而 的完整开放阅读框,预测所编码的蛋白含 对照植株中未扩增出相同大小的条带,初步说明目 有保守的激酶结构域和酯酶结构域。 的片段已成功地整合进烟草基因组中。将相应的转 本研究使用相同引物扩增蔗茎,嵇,片 段,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,发现以 蔗茎为模板,可以扩增出长度明显不同于蔗 叶的同源片段图。纯化克隆相 关条带,测序表明这些产物序列除少数位置出现小 片段缺失或增加外,其余序列与基本一 致。根据分子量大小将其分别命名为、 砣卜翻.。 序列比对结果表明图,克隆获得的 砣、勘砣粥、.和. 片段均含有两个高度刚源的区域。预测这两个区域 分别编码激酶与酯酶结构域。但是, 电千 、.莉较 眩 .出现了不同程度的片段缺失或增加,预 测极有可能造成翻译提前终止,故所含的开放阅读 产 物 因 框长度均小于。使用 数据库 在线预测蛋白质保守 结构域,结果显示,.蛋白只有残缺的激 万方数据 柏徽耋淼四眦。。。, ?? ................................................................................................................................................................................... ?? ???.?. ? 芍 ? ......................................................................................................................... .............................................. ? ............,............?..................................... .............................................??..........?........... .................................. ? ................................................................. ...................................................................?. ?........................................ ????.. ??.??..?.??.??.?.??.?.?. ??. ? ? ?.?.?. ? ? ? 螂 ???:一 ? ? ?? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ? ? ? 图甘蔗茎、叶组织中获得的同源片段序列比对图 图甘蔗茎、叶组织中获得 同的源 片 段序列比对图割,.艟线代,足:‘实线代太终:, ;? 万方数据 万方数据淀粉、蔗糖 淀粉比值均显著升高。由于本研究是 万方数据录为、 检测基因转录表达,反应引物 万方数据~ ~ 万方数据