【doc】新生鼠缺氧缺血性脑损伤凋亡基因的变化及神经节苷酯的治疗作用

【doc】新生鼠缺氧缺血性脑损伤凋亡基因的变化及神经节苷酯的治疗作用 新生鼠缺氧缺血性脑损伤凋亡基因的变化 及神经节苷酯的治疗作用 中国儿童保健杂志2005年02月第13卷第1期CJCHCFeb.2005,Vol13?No.159 文章编号:1008—6579(2005)01—0059—03【基础科研论着】 新生鼠缺氧缺血性脑损伤凋亡基因的变化及神经节苷酯的治疗作用 刘华,郭萍,濮海平,于晓燕(青岛市解放军第401医院儿科,山东青岛266071) 中图分类号:Q95—33文献标识码:A 摘要:【目的】探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (hypoxic-ischemiabraindamage,HIBD)后Bcl-2,Pax基因表 达与细胞凋亡的关系及神经节苷酯(gangliosides,GM1)对其的影响.【方法】建立新生鼠HIBD动物模型,用 TUNEL法和免疫组化法观察缺氧缺血和GM1干预后不同时间点细胞凋亡情况及凋亡基因Bcl-2,Pax的变化. 【结果】缺氧缺血组随时间延长脑组织中Bcl-2,Pax的表达增加,Bcl-2/pax的比值下降,同时凋亡细胞数增加,表明 Bcl一2,Pax两者比值的降低促进凋亡的发生.GM1干预组Bcl一2表达增加显着,降低了Pax的表达,凋亡细胞减少. 【结论】GM1可能通过改变凋亡基因的表达而抑制神经细胞的凋亡 过程. 关键词:神经节苷酯类;脑缺氧;脑缺血;Bcl-2基因;凋亡 StudyonthechangeofapoptoticgenesandtreatmenteffectofGM1inhypoxicischemicbraindamageofneonatalrats. LIUHua.GUOPing.PUHai-ping,yUXiao-yan(DepartementofPediatrics.the401ndHospitalofPeople’SLib— erationArmy.Qingdao.shandong266071.China) Abstract:【0bjective】TodiscusstherelationshipbetweenexpressionofBcl一2.Baxandapoptosisofneonatal ratsaftercerebralhypoxi~ischemiaandeffectsofgangliosides(GM1)onthem.【Method】Ananimalmodelofneo— natalhypoxic-iSChemiabraindamagewasestablished.Terminal—deoxyn ucleotidytransferasemediatednickendlabeling (TUNEI)andimmunohistochemicalwereusedtOdetecteapoptosisandBcl-2.Paxindifferenttime.【Results】A shiftinratioofBcl一 2tOBaxmightcontributetoneuronalapoptosisafterHI.0verexpression0fBcl一2protectedthecell fromapoptosis,butBaxmightbefunctionedasthecelldeatheffectoiverprotein.Thestudyshowedthatimmunostain— ingpositivecellsofBcl一 2ptoteinwasincreasedwhiletheBaxproteinweredecreasedwiththetreatmento fGM1after HI.GM1decreasedtheapoptosisofcerebralcells.【Conclusion】GM1maydecreasetheapoptosisbyhavingan effectonBcl一2andPaX. Keywords:gangliosides;hypoxic-ischemia;cerebralischemia;bcl-2gene;a poptosis 目前.缺氧缺血性脑损伤(hypoxic—ischemiabrain damage,HIBD)是新生儿窒息的主要并发症,病情严 重,死亡率高,常引起新生儿死亡和神经系统发育障 碍,寻求有效治疗途径是新生儿研究的主要课题之一. 有研究显示外源性单唾液酸四已糖神经节苷酯(gan— gliosides,GM1)可以透过血脑屏障,模拟内源性GM1 减轻缺氧缺血性脑损伤,对缺血引起的细胞凋亡有拮 抗作用].已知在新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic— ischemiaencephalopathy,HIE)时有凋亡的参与,凋亡 是一基因调节的主动过程.本实验在新生大鼠HIBD 模型基础上动态观察Bcl一2,Bax基因蛋白在脑组织中 的表达变化,通过给予外源性GM1,分组比较,以进一 步探讨GM1的治疗作用机制. 1材料和方法 1.1材料生后7日龄SD仔鼠108只,雌雄不分, 体质量(14.5+2.2)g.GM1由香港精优公司提供, Bcl-2兔IgG多抗,Bax兔IgG多抗,均购自北京中山 作者简介:刘华(1965一),女,主治医师,硕士在读,研究方向为新生儿 疾 病 生物技术有限公司.为SantaCruz公司产品. 1.2方法 1.2.1动物分组及模型的制备|2将108只动物随 机分为三组:A组假手术对照组36只(只游离不结扎 动脉),B组缺氧缺血组36只(结扎左颈总动脉),C组 GM1治疗组36只(结扎左颈总动脉,术前30min及 模型制成后立即腹腔注射GM1).各组动物在模型制 成后1,6,12,24,72和168h不同时间各用6只.所 有动物用乙醚麻醉(3,5min),将鼠仰面固定,行颈正 中切口,分离左颈总动脉,A组只游离不结扎,B组用 0号线结扎右侧颈总动脉,C组于术前30min及模型 制成后立即腹腔注射GM1(30mg/kg).术后立即置 于缺氧仓内,持续输入0.08/0.92氧/氮混合气体,氧 浓度检测仪监测使氧浓度维持在8,缺氧2h,术后 人工喂养. 1.2.2标本制备三组动物分别于模型制成后1,6, 12,24,72和168h各处死6只,取出脑组织置于40g/ I多聚甲醛中固定24h,自丘脑中1/3平面行冠状切 片,依次脱水,浸腊,包埋,切片(4,6p.m厚). 6O中国儿童保鲣杂志2005年O2月第13卷第J期CJCHCFeb.2005,Vol13,No.1 1.2.3细胞凋亡染色采用TUNEI法(TUNEI试 剂盒购自武汉博士德公司),方法:取各组新生鼠1,6, 12,24,72和168h缺血侧脑组织做冠状切片及 TUNEI染色,具体操作按说明书进行.光镜下见胞核 中有棕黄颗粒者为阳性细胞.在400倍光镜下记数 TUNEI细胞阳性数.每样本取15个视野以上,皮层 记数3000个.海马记数1000个. 1.2.4免疫组织化学染色将各组仔鼠于模型制成 后1,6,12,24,72和168h取脑,作冠状切片,按免疫组 化SP染色方法,行Bcl一2,Bax染色,免疫组化染色的 Bcl一2,Bax切片置于摄像显微镜下,放大1OO倍,在观 察部位随机取5个视野,在图像分析仪下测定Bcl一2, Bax灰度值. 1.3统计学方法实验数据以?s表示.均数问的 差异采用f检验,P<O.05时有统计学意义. 2结果 2.1TUNEI阳性细胞的变化B组在缺血后不同 时间凋亡细胞数仍显着高于A组(P<0.01),C组凋 亡细胞数水平显着高于A组(P<0.01).且于缺氧缺 血后24,48h达高峰,以后逐渐下降,C组比B组的凋 亡细胞数明显减少(P<O.01),表明GM1治疗明显减 轻了脑细胞凋亡. 表J生后不同时间各组细胞凋亡数的比较(?5) 注:与A组比较:P<C0.01;与B组比较;t1直为5.06,36.?18?P<O.0l. 2.2Bcl一2,Bax表达的变化免疫组化染色及图像分72h有所下降.表2显示缺氧缺血后1hBcl一2/Bax 析结果:在正常新生大鼠脑的较多部位均有Bcl-2,Bax比值较大.6h后比值呈下降趋势.以Bax表达为主. 阳性的表达,在皮质的?一?层,海马,丘脑均可见到2.3治疗24h,168h后Bcl一2,Bax的灰度值变化 Bcl一2,Bax阳性细胞,B组在缺氧缺血后1h,6hBcl-2由于Bcl-2,Bax在调节细胞凋亡中的作用相反,且在脑 免疫强度表达增加更明显.与对照组比较差异有显着损伤后表达均有增加,本组计算了GM1治疗前后两组 性(P<O.05),随缺血时间延长,Bcl一2仍呈强阳性表Bcl-2,Bax值.从表3可以看出GM1治疗后不同程度 达.再无明显增强,而Bax表达逐渐增强,于24h,48h地提高了Bcl一2的灰度值,降低了促凋亡基因Bax的表 达高峰.与对照组比较差异有非常显着性(P<0.01),达,提高了Bcl一2/Bax比值,与B组比较差异显着. 表2大鼠HI后不同再灌注时间Bcl一2,Bax蛋白表达及两者比值的变化(?s) 注:与A组比较:’t值为2.00,2.90,P<0.05;t值为3.31,8.96,P<0.01. 表3GM1治疗后Bcl?2Bax的灰度值变化(?s) 注:与B组比较:(P<0.05),(P<O.01). 3讨论 3.1细胞凋亡在HIBE后神经元死亡中的作用近 年来的研究表明迟发性神经元死亡即凋亡在HIBE后 的神经元死亡中具有重要地位.本组织实验结果发现 损伤组大鼠脑组织中Tunel阳性细胞数与对照组差异 有显着性(P<0.01),表明细胞凋亡确实参与了缺氧缺 血性脑损伤后神经细胞病理改变过程,在缺氧确血性 脑损伤后1h脑组织中即有神经细胞凋亡增加,48h神 经细胞凋亡数最多,持续至少7d以上. 3.2细胞凋亡过程受凋亡促进因子和凋亡抑制因子 的共同调节细胞凋亡是严格基因凋控的细胞程序性 死亡,其过程受凋亡促进因子和凋亡抑制因子的共同 调节.细胞凋亡是在某些诱导因素作用下启动有关调 控细胞死亡的基因.最终使细胞按一定的程序控制自 我破坏和死亡.Bet一2基因家族是一类基因结构相似 参与细胞凋亡调节的基因,它们通过相互作用,正向或 反向调节细胞凋亡,其中Bcl一2,Bax基因是目前较明确 的功能相互对立的细胞凋亡调控基因,凋亡抑制基因 Bcl一2及其蛋白过量表达能够抑制或阻断多种因素引 起的细胞凋亡,而Bax基因与Bcl一2有相反的生物效 应.在体内Bcl一2,Bax蛋白可形成异质二聚体,两者之 间可能存在一种平衡关系,两者剂量的比率决定细胞 中国儿童保健杂志2005年O2月第13卷第1期CJCHCFeb.2005,Vol13?No.161 凋亡的敏感性,当Bcl一2/Bax增多则细胞存活,反之则 易凋亡一.研究表明Bcl一2基因过度表达可抑制由于 钙超载,氧自由基等所致的神经细胞凋亡发生?.本 研究应用免疫组化法,对Bcl一2家族在实验性缺氧缺血 损伤脑组织中的表达进行了动态观察,表明Bcl一2蛋白 在正常新生鼠脑的各个部位都有表达,免疫染色主要 分布在细胞浆内,HI后再灌注早期Bcl一2的免疫强度 明显上升,呈较强阳性,随时间延长呈下降趋势,但仍 高于正常水平,认为机体在损伤后通过Bcl一2蛋白表达 的增强来抑制病理性细胞凋亡的发生.Bax在正常新 生鼠脑内也广泛存在,一般认为它是易为缺血和兴奋 性神经介质所致死亡的种群,提出Bax基因表达的增 加有助于神经细胞凋亡,HI后随时间延长Bax表达逐 渐增强,48h达高峰.而且Bax表达的增加显着高于 Bcl一2,原来的平衡被打破,促进细胞凋亡.近年研究提 示Bcl一2及Bax调节细胞死亡,不仅取决于自身表达的 高低,还与Bcl一2/Bax比率有关,Bcl一2与Bax的比例在 凋亡高峰时下降,认为此比例的改变对缺血后脑细胞 凋亡的激活是必须的l_3].本研究Bcl一2/’Bax比值明显 下降在6h以后,且随时间延长呈降低趋势,细胞凋亡 高峰在24~48h. 3.3GM1减轻神经细胞的凋亡与改变凋亡基因表达 有关实验证明GM1谷氨酸受体过度激活拮抗剂,选 择性地抑制谷氨酸受体过度激活所致的各种病理生理 改变,有明显清除自由基,降低内皮素,防止缺血区血 管及微小血管强烈痉挛所造成的脑组织持续损伤,减 少细胞凋亡,因而有明显的脑保护作用j,而GM1能 否调节新生鼠HI过程中凋亡基因的变化还未见报道. 本研究结果显示,GM1治疗后可提高脑组织中保护性 基因蛋白Bcl一2的表达,促使凋亡基因蛋白Bax的表达 明显降低.逆转了两者的比值,显着减少了细胞凋亡数 量,证实GM1减轻神经细胞的凋亡与改变凋亡基因表 达有关. :1] 2] [3] [4] [5] [6] [7] [参考文献] 范海虹,汪华侨.刘存领.等.新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后神经 节苷脂的保护作用[J.实用儿科临床杂志.2000.15(6):3l1 3l3 张红爱.王玲.冷钦,等.缺氧缺血新生鼠海马磷酸化环磷酸腺苷 反应元件结合蛋白的变化及神经节苷酯对其影响J.实用儿科 临床杂志.2004.19(4):283—285 KRAJEWSKIS.TANAKAS.TAKAYAMAS,eta1.1nvestiga— tionsofthesuhcellulardistrilmtionofBcl一2oncoprotein:resi denceintheunclearenvelope.endoplasmicreticulum.andouter mitochondrialmembrance[J:.CancerRes.1993,53:470卜4703. 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