应用多个X-连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异常综合征进行克隆性检测的研究

应用多个X-连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异常综合征进行克隆性检测的研究 应用多个X-连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和 骨髓增生异常综合征进行克隆性检测的研究 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学 位论文 博士学位论文 学校代码: 10023 学 号: B2008397 第一部分 应用多个X.连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和骨髓 增生异常综合征进行克隆性检测的研究 第二部分 骨髓增生异常综合征有核红细胞糖原染色的意义 所 院: 血液学研究所血液病医院 姓 名: 刘柳 指导教师: 肖志坚 学科专业: 内科学 研究方向: 髓系肿瘤基础与临床 完成日期: 二零壹壹年五月 目 录 舢JIJJIJJJJJ删?JlfJJJIJJIJJJjJJIJjj?删 \1985871 第一部分应用多个x连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和骨髓增生异 常综 合征进行克隆性检测的研究??3 中文摘要?4 英文摘要?5 前言.6日U舌??.O 材料和7 实验方法..11 统计学??..20 实验结果。20 讨论25 结论??..27 参考文献..27 第二部分骨髓增生异常综合征有核红细胞糖原染色的意义??30 中文摘要..31 英文摘要..32 前言??..33丹U舌??..33 病例和方法??..33 结果??。35 讨论??一40 参考文献?42 论文综述骨髓增殖性肿瘤发病分子机制研究进展一43 附录一常见英文缩写?53 附录二在学期间发论文和会议54 致谢??..55 独创性声明??。56 学位论文版权使用授权书??..57 2 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 第一部分 应用多个X.连锁基因多态性位点对骨髓增殖性肿瘤和骨髓 增生异常综合征进行克隆性检测的研究 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 摘 要 研究目的 探索X连锁基因P55、G6PD、BTK、FHL.1多态性位点在中国正常女性中 的分布状态,以及应用4个多态性位点对骨髓增殖性肿瘤MPN和骨髓增生 异常综合MDS征进行克隆性检测的临床价值。 研究方法 共收集446例中国正常女性外周血标本提取基因组DNA,应用等位基因特 异性聚合酶链式反应ASPCR或聚合酶链式反应.限制性片段长度多态性 PCR-I心LP方法分析X连锁P55、G6PD、BTK、FHL.1基因多态性位点的杂 合基因型频率。以上述基因杂合性位点作为克隆性检测的标记,提取具有杂 合性 位点的患者骨髓单个核细胞mRNA逆转录,应用X染色体失活的克隆性检测方 法.转录检测法TCA,检测24例临床疑诊为MDS或MPN的患者骨髓单个核 细胞的克隆性。 结果 、 446例中国正常女性P55基因杂合基因型频率为29.4%131/446例,G6PD 基因杂合基因型频率为12.8%57/446例,BTK基因杂合基因型频率为52% 232/446例、FHL.1基因杂合基因型频率46.4%207/446例。具有4个多态 性位点中1个或1个以上杂合性位点的正常女性占81.4%363/446例。应用X 染色体失活的克隆性检测方法,16例原发性血小板增多症患者中11例检出单/ 寡克隆造血。8例血细胞减少症患者中,5例检出单/寡克隆造血,其中4例已临 床确诊为MDS。 结论 基于X染色体失活的克隆性检测TCA可用于约80%的中国女性患者的克隆 性分析,有助于MPN、MDS与其他血细胞增多/减少症的鉴别诊断。 关键词:X连锁基因;多态性;克隆性检测;骨髓增殖性肿瘤;骨髓增生异常综 合征 4 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 Cionalityassayformyeloproliferativeneoplasmsnd myelodyspIasticsyndromeusingXchromosomeinactivation pattern objective Toexplorethefrequenciesofh terozygosityinG6PD.P5s.BTK,andFHL.1 polymorphiclocinChinesewomena dtoinvestigatetheclinicalv ueofX chromosomebasedclonalityassayfortestingtheclonalityofpatientswithclinical suspectedMPNorMDS. Methods GenomicDNAwasextractedfromperipheralbloodf446Chinesehealthywomen. Allele-specificPCRASPCRwasappliedfordetectingG6PDandP55 exonic polymorphisms.TheBTKandFHL-JgenotypingwereperformedbyPCR?restrictionenzyme digestionmethod.Fordetectionofclonality,thetranscriptionalclonalityssaysweredone uponthebonemarrowm nonuclearellsBMMCsof24patientswhoweresuspectedtob MPNorMDS. ’ Results Amongthe446Chinesefemaleg nomicDNAsamplesanalyzed,thefrequenciesof heterozygosityinG6PD,乃只BTK,andFHL一 1lociwere12.8%,29.4%,52.O%and46.4% respectively.Whena lociwereconsidered,81.4%wereheterozygousateitherlocus.Among 16ETpatients,theBMMCsweremonoclonaloroligoclonalinlIeases,polyclonalin5 cases.5casesweremonocionaloroligoclonaloutof8patientswithcytopenia,inwhom4 patientshabeendiagnosedMDS. Conclusion About80%ofChinesefemalesw reinformativeforX.chromosomeinactivationbased TCAwhichwereusefulforthedifferentialdiagnosisfMPNorMDS. KeyWords:X?linkedgen s;polymorphism;clonalityassay;mye oproliferative neoplasm;myelodysplasticsyndrome 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 ?埠?1’ 日U 舌 血液病的克隆性检测是应用特定的实验方法,区分单克隆性造血与多克隆性 造血,为疾病的认识、诊断、鉴别诊断、治疗策略的选择以及疗效评估提供 有利 的工具。常见的克隆性检测方法【l】包括:1疾病相关体细胞突变检测,如临床 常用的细胞遗传学、分子遗传学检查;2免疫球蛋白重链、轻链及T细胞受体 基因重排,其主要用于淋巴系统疾病的研究;3免疫表型检测,多使用流式细 胞术;4基于X染色体失活的克隆性分析。前两种方法检测疾病固有标志,为疾 病相关的DNA序列改变,属于基因型检测;后两种方法检测一些持家型基因表达 模式的改变而非基因序列突变,为表现型检测。由于多数疾病缺少特异性克隆性 标记物,且随着多态性X连锁基因的不断发现以及杂合率的不断提高,使得基于 X染色体失活的克隆性检测成为应用最为广泛的克隆性检测方法。 基于X染色体失活的克隆性检测只适用于分析女性患者,根据其理论依据 “Lyon假说"【2】,认为所有女性体细胞的2条x染色体中的1条在胚胎发育早期 随机失活,另l条保持遗传活性,因此所有女性个体约为50%的体细胞是父源性 X染色体Xp失活,另外50%的体细胞是母源性X染色体Xm失活,正常女 性体细胞构成的组织都是上述两类细胞的嵌合体。肿瘤组织是来源于单个细 胞克 隆性增生组织,肿瘤组织中所有的瘤细胞只有一条失活的X染色体Xp或111; 而正常组织或反应性增生病变是多克隆细胞群体,其中失活的Xp和失活的III 都存在,二者约为l:l。根据这一特征,可区分肿瘤性增生和非肿瘤性增生。 X染色体失活的克隆性分析经历了从有核细胞到无核细胞,从蛋白、DNA到 RNA水平的检测,方法更加简单,技术更加稳定,新的标记物的发现,使约90% 的女性患者可用此法检测,故可应用范围最为广泛,但因其固有的缺陷,如X染 色体失活偏颇、低敏感性,使其临床应用受到一定限制。 经典的BCR/ABL阴性的慢性骨髓增殖性肿瘤MPN,包括真性红细胞增多 症PV、原发性血小板增多症ET、原发性骨髓纤维化PMF,是一组起源 于多能造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,临床表现为髓系细胞一系或多系过度 增殖,进而外周血粒细胞、红细胞、血小板一系或多系增多,有形成动静脉血栓、 髓外造血、骨髓纤维化及转化为急性白血病的趋势。2005年多个研究组发现在约 90%的PV、50%.60%的ET及IMF患者中存在获得性基因突变JAK2V617F,该突 变成为诊断BC刚ABL阴性MPN的重要分子遗传学标志I引。随后包括JAK2基因12 号外显子、MPL、TET2、ASXLl等多个基因突变被发现,成为MPN克隆性分子 标志。但是仍有极少数PV患者和约'40%ET、MF患者缺乏同非克隆性血细胞增多 症鉴别的克隆性标记物。 MDS是一组起源于造血干细胞的克隆性血液系统疾病,由于其极大的异质 6 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 性,部分早期阶段的MDS往往缺乏恶性克隆的临床和实验室表征,如骨髓涂片原 始细胞比例增高、特征性染色体核型改变及演进以及很快进展为急性髓系白血病 等等。这部分病人往往需要同包括再生障碍性贫血、继发性血细胞减少在内的其 他疾病相鉴别。 自二十世纪六十年代【4】以来,研究者一直致力于应用X染色体失活的克隆性 检测对各类血液系统疾病进行克隆性分析的研究。基于转录的克隆性检测方法始 于二十世纪90年代【5】,目前可应用于该法检测的X一连锁多态性位点共5个,包括 P55基因G/T,cdsNO.358、G6PD基因C/T,cdsNO.1311、BTK基因C/T,cds NO.1899、FHL一1基因G/A,cdsNO.1958、IDS基因C/T,cdsNO.438,仅P55、 G6PD、BTK、FHL-1等4个基因多态性位点在亚洲女性中存在一定的杂合率16J。 本文首先研究4个X.连锁基因多态性位点在中国女性中的杂合性状况,其次 联合应用上述4个杂合性位点,应用基于X染色体失活的克隆性检测方法,对临 床疑诊为MPN或MDS的患者进行克隆性检测,评估该检测方法的临床应用价值。 材料和方法 1.研究对象 446例我国正常女性标本取自2008年我院在职及退休职工健康体检外周血 标本。血液病患者为2010年9月至2011年5月就诊于我院的疑诊为MPN或 MDS患者共24例。MPN或MDS诊断分型标准参考WHO2008诊断标准[31。 2.试剂 2.1.试剂盒 血液基因组DNA提取试剂盒购白天根生化科技北京有限公司。 2.2. 重要试剂 TaqDNA聚合酶PCRMastermix、2000bpDNAMarker、50bpDNAMarker 购自天根生化科技北京有限公司。限制性内切酶PstI、AlwNI购自 EB公 司。NaCl、KCI、Na2HP04、KH2P04、Tris碱、硼酸、异丙醇、乙醇、EDTA等 购自天津市化学试剂二厂。琼脂糖购自BIOWEST公司。 2.3.主要溶液配制 ’PBS:800mlddH20中溶解89NaCI、0.29KCI、1.449Na2HP04、0.249KH P04, 用HCI调PH至7.4,加水定容到1L。TBE:Tris.硼酸浓贮存液5×800mlddH20 中溶解549Tris碱,27.59硼酸,20ml0.5mol/LEDTAprig.o,加水定容到1L。 7 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 3. 引物与合成 参照文献合成引物吲。具体序列见表1、表2: 引物由上海生工生物有限技术公司合成,PAGE纯Q_,,均稀释为10“M备用。 4. 主要仪器 细胞培养箱:Steri-Cycle02Incubator,购自美国Thermo公司。 PCR扩增仪:GeneAmpPCRSystem9700,购自美国PE公司。 低速冷冻离心机:Beckman,购自德国Heraeus公司。 低温台式离心机:Biofuge,购自德国Heraeus公司。 台式离心机:TGL.16G,购自上海安亭科学仪器厂。 电泳槽:DYY-IIl38A,购自北京六一厂。 低温循环水浴箱:2219,购自美国LKB公司。 ~ 电热恒温水温箱:HH.W21,购自上海医用恒温设备厂。 超净台:SW-CJ一2FD,购自苏州安岳空气技术有限公司。 双恒电泳仪:BDF.1600,购自北京东方特力科贸公司。 紫外分光光度计:DU.70型,购自美国Beckman公司。 凝胶成像系统:KodakDC290,购自美国Kodak公司。 8 t?HH??’??_ _?“‘?“-~一?_??’??_‘j?卜????寸?t?r QDN价一QDo价一厶D?NN~ cID?NN cID口NN。 乱cIQ寸卜 AD一?一一AD??'【~厶。心Nn;| 厶Dn一心厶Dcl岭cID卜”甙 星oUoU《o卜oUU卜Uo《《o卜oEUo《卜UooU《o卜UUU卜Uo《《o卜。卜UUo《UU卜UeUooo昌Uooo?UoooUUo《《o《《UU《套。卜室UUoU《o卜UUo卜Uo《《o卜oEUU《一UUoU《o?UUU卜oo《《o卜。卜U《H?玎1《《《o卜oooo卜o《Uo《Uo卜~】Lv?U卜UU卜oo卜oUoo《Uo-^IboU《U疑《ooo疑UUUo《o《U??v卜卜U《U工v《ooo疑UUUo《o《U?Unv卜ULOUooU瓷U卜H?U卜一卜ooJ^_Ib《《o毫Uo工vooU童。卜Uoo《o《UoU《U疑《ooo《U卜卜.H?_卜HUUoU.一互H. 一 卜u《o宅《ooo《u一卜-瓤H b?uuon工 ~ 上v《u《uo《u《《uu卜。普o《u卜uu? ~ 卜o《亭100uo卜oo《oo《U《ooo《《U卜 一 卜寸-Jo‰?甲匣pn山o‰啦时i匣配N.o醋.配.【-Jo‘& 一寸-Jo‰?甲Q~ ~ Un-Jo‰的乎Q 一 幺MA.o配。Q。比卜-Jo‰.Q~ Q厶?o oN-Jo臣哦甲酲 ~ ?H-Jo‘?甲g ? g量?.o幺。幺一吼山o‰.酲 nX n-Jo‰?宁Q-k'【-Jo臣器.Q .Io?. +,一 粤I-Q。,?-Jo皿.Q n价山 鄙女嚣钆配u厶 ^‘c.邑舔世器不 一 藩婶S不 武世器而g《避越谗蚺因郴Qd90 Z价山嚣辑趟匣uds《.H懈 议袋牮扑划妖富书蛙避扑凼冥拳谣菩篮扑凄扑盥皿哥 cII?clQD?n?cIDNclcI心2 Uo卜UULrqU毫亭10卜Uo卜o《Uob?o《《U毫ooo《《Uv儿oo普UUo卜Uo工vo?工v《《o卜oo卜o《oo卜卜o《《U毫ooo《《U蛋oUv工Uo疑oU疑UEU卜工voo《U卜Uoo-b,『QU《《o卜Uo卜U《o《o卜oo-b?o《?o《《oppo-?蓍Uo~oJ^H?U《U《《o卜oo?U《o《o卜o ?蛊.醒~’lo‰.《o名。Q.Io‰.Q~?星.醒Jo‰.匣!|??配。Q~.Io‰.Q ~。,l窭‰音目 毯半鄙t霉扎幺u厶 ‘C。邑民世霉而 藩婶霉幂 避尽霍翅备嘏醛赵最世霉而g《迥拳桶蚺函醐Hj山,回b?器蜒趟长山J臣&u厶N琳 议秘牮扑删状奄_千啦篮扑凼娶盎佞菩龌扑藻貅凼哑七b 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 实验方法 1. 血液基因组DNA提取 参照血液基因组DNA提取试剂盒天根生化科技有限公司说明书,提取基 因组DNA- ?取患者骨髓液或正常人女性外周血250“1,加入201al蛋白酶K溶液,混匀; ?加2201.tl缓冲液GB,充分颠倒混匀,56"C放置10分钟,每隔2分钟颠倒混匀数 次; ?加220I.tl无水乙醇,充分颠倒混匀; ?将上一步所得混合溶液加入吸附柱,12,000rpm离心30秒,弃掉废液; ?加入5001al去蛋白液GD,12,000rpm离心30秒,弃掉废液; ?加,K.700pl漂洗液PW,12,000rpm离一L,30秒,弃掉废液。将吸附柱放回收集管 中12,000rpm离心2分钟,去除残余的漂洗液PW; ?将吸附柱放入一干净的离心管中,JJfl,N.80p,l经60。C水浴预热的洗脱缓冲液TB, 室温放置5分钟,12,000rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中。将提取的DNA 经紫外分光光度计检测浓度与纯度。 2.基因型分析 4个待测基因G6PD、P55、FHL.1、BTK多态性位点基因型分析反应条件如 下: 2.1 G6PD基因多态性位点基因型分析 采用等位基因特异性聚合酶链反应ASPCR法进行检测 第一步扩增目的片段:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20I-tl反应体系 模板DNA 2ul 2xPCRMasterMix l0u1 正向引物790.2ul 反向引物99R0.2ul 去离子水 7.6ul 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95?变性40秒,55? 退火40秒,72?延伸1分钟;最后一个循环72"2延伸lO分钟。扩增片段为749bp。 第二步等位基因特异性扩增:取第一步PCR产物作为模板,分别在2个0.2ml EP管中进行如下反应,每管中加入不同的等位基因特异性正向引物,反向引物 及其他条件均相同。 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 第一轮PCR产物4ul 2×PCRMasterMix 10ul 等位基因特异性正向引物3C/4a3 0.2ul 反向引物99R0.2ul 去离子水 5.6ul 反应条件:95。C预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性30秒,69。C退 火30秒,72。C延伸30秒;最后一个循环72。C延伸10分钟。扩增片段为226/228bp。 取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统照相鉴定。第 一步PCR产物作为内参,若两管PCR产物均在226/228bp处显带提示待测位 点 为杂合子图1。 7sobp 250bp N1 N2 N3 M C T C T C T 图2.G6PD基因型检测结果 N1、N3为纯合型C/CN2为杂合型C厂r +一749bp ?一226bp 2.2 P55基因多态性位点基因型分析 采用等位基因特异性聚合酶链反应ASPCR法进行检测 第一步扩增目的片段:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20I,tl反应体系 模板DNA 2ul 2×PCRMasterMix l0ul 正向引物6J0.2ul 反向引物8Gr0.2ul 去离子水 7.6ui 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性1分钟,56 ?退火45秒,72?延伸1分钟;最后一个循环72?延伸lO分钟。扩增片段 为 957bp。 第二步等位基因特异性扩增:取第一步PCR产物作为模板,分别在2个0.2ml EP管中进行如下反应,每管中加入不同的等位基因特异性正向引物,反向引物 及其他条件均相同。 12 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 第一轮PCR产物 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 等位基因特异性正向引物19T/39G0.2ul 反向引物80r0.2ul 去离子水 7.6ul 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95?变性45秒,64? 退火30秒,72?延伸50秒;最后一个循环72?延伸10分钟。扩增片段为 613/615bp。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统照相 鉴定。第一步PCR产物作为内参,若两管PCR产物均在613/615bp处显带提示 待测位点为杂合子图2。 looobp 500b0 Nl N2 N3 N4 N5 M T G T G T G T G T G 图2.P55基因型检测结果 N1、N3、N4为纯合型TT;N2为纯合型GG:N5为杂合TG 2.3 BTK基因多态性位点基因型分析 采用聚合酶链式反应.限制性内切酶片断长度多态性PCR-RFLP方法进行 分析。 ?PCR反应体系:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20山反应体系。 模板DNA 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 正向引物B10.2ul 反向引物B20.2ul 去离子水 7.6ul ?PCR反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性30秒, 55?退火30秒,72"C延伸30秒;最后一个循环72?延伸10分钟。扩增片 段为156bp。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定图3。 ?酶切反应及酶切图谱:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成201xl反应体 系。 生学位论文 150bp_?+ 1001ap??+ 8ul 2ul 0.5ul 9.5ul KodakDC290凝胶成像系统 带,杂合型C/T可见68bp、 1条带图3。 M N1 N2N3N4N5N6N7 156b0 88/68bp 图3.BTK基因型检测结果 N1、N6为纯合型TT;N2、N4、N5为纯合型CC:N3、N7为杂合型CT 2.4 FHL.1基因多态性位点基因型分析 采用聚合酶链式反应.限制性内切酶片断长度多态性PCR?RFLP方法进行 分析。 ?PCR反应体系:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20111反应体系。 模板DNA 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 正向引物L30.2ul 反向引物F20.2ul 去离子水 7.6ul ?PCR反应条件:95。C预变性10分钟后,开始35个循环:95"C变性30秒, 55?退火30秒,72"C延伸30秒;最后一个循环72?延伸10分钟。扩增片 段为131bp。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定图5。 ?酶切反应及酶切图谱:向0.2mlEP管CN*TN成分,配成201xl反应体系。 PCR产物 6ul 10xNEBBuffer 2ul BSA 0.2ul 内切酶Pstl0.5ul 14 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 去离子水 11.3ul 37。C酶切4小时后进行3%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定。纯合型G/G可见131bp处1条带,杂合型G/A可见131bp和lllbp2 条带,纯合型A/A可见lllbp1条带图4。 M NlN2N3N4 N5 N6N7 搠韶 图4.FHL--I基因型检测结果 N1为纯合型GG;N3、N6、N7为纯合型AA;N2、N4、N5为杂合型GA 3. 总RNA提取和eDNA制备 3.1总RNA提取 ?向收集有细胞的无RNA酶1.5mlEP管中加入200p,lPBS,吹打成均匀的细 胞悬 液,加入10001.dTrizol,轻柔吹打,充分混匀,室温静置10分钟; ?加入2001.d三氯甲烷,轻柔吹打,充分混匀,室温静置5分钟后,4。 C12,000rpm 离,tM5分钟; ?吸取213.3/4上层水相,约500p.1,置于新的无RNA酶1.5mlEP管中,加入 50091.20?预冷的异丙醇,轻柔吹打,充分混匀,室温静置10分钟后,4? 12,000rpm离心lO分钟; ?弃除上清液,留取EP管底部RNA白色团块,加入800u1.20?预冷的75%乙 醇,洗涤白色团块后,4"C8000rpm离心5分钟; ?弃除并吸净乙醇,留取RNA白色团块,室温干燥10分钟后,加入20ul无 RNA酶的ddH20,充分溶解RNA白色团块; ?经紫外分光光度计检测浓度与纯度,A260/A280位于1.8.2.1之间可用。 将所 有样本的浓度用无RNA酶的ddH20调整为500ng/ul,留取适量用于?,余 下置于.80?保存备用; ?将RNA浓度稀释为100ng/ul,取10ul,70"CiJIl热2分钟,冰上冷却,进行 l%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统照相,测定其完整性。 3.2逆转录反应及eDNA制备 ?逆转录体系:向无RNA酶0.2mlEP管中加入下列成分,配成209l反应体系。 RNA500ng/u1 4山 M-MLV200u/u11m OligodT50pmol/u11.51,tl 15 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 dNTP2.5mM 5XBuffer O.1MDTr 无RNA酶ddH20 ?逆转录条件: 29l 4pl 1“l 6.59l 42?60分钟,99?3分钟。将eDNA置于4。C保存备用。 4.克隆性检测 以4个待测基因G6PD、P55、FHL?l、BTK的多态性位点作为克隆性检测 标记,首先取待检患者gDNA测定目的基因的基因型,若待测位点为杂合子, 进一步用同一患者eDNA行克隆性检测;若待测位点为纯合子,则不能用该基 因 进行克隆性检测。四个基因中只要有一个为杂合子即可进行本实验。 4.1应用P55基因杂合基因型进行克隆性分检测 采用等位基因特异性聚合酶链反应ASPCR法进行检测 第一步扩增目的片段:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成209l反应体系 eDNA 2ul 2xpCRMasterMix 10ul 正向引物9J0.25ul 反向引物8mR0.25ul 去离子水 7.5ul 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95?变性40秒,56? 退火30秒,72?延伸40秒;最后一个循环72?延伸lO分钟。扩增片段为326bp。 第二步等位基因特异性扩增:取第一步PCR产物作为模板,分别在2个0.2ml EP管中进行如下反应,每管中加入不同的等位基因特异性正向引物,反向引物 及其他条件均相同。 第一轮PCR产物4ul 2xPCRMasterMix 10ul 等位基因特异性正向引物1T/2G0.2ul 反向引物8mR0.2ul 去离子水 5.6ul 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性30秒,56。C 退火30秒,72?延伸30秒;最后一个循环72?延伸10分钟。扩增片段为 189/191bp。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统照相 鉴定。第一步PCR产物作为内参,若两管PCR产物均在189/191bp处显带提示 16 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 待测患者骨髓为多克隆造血,若仅1管PCR产物显带,提示待测患者骨髓为单 克隆造血。若1条泳道上的电泳条带较另一条明显减低,根据文献资料‘81 该情况 定义为“寡克隆",表明单克隆细胞群和多克隆细胞群同时存在或存在X染色 体 失活偏颇图5。 挈?篇器 2.2应用G6PD基因杂合基因型进行克隆性检测 采用等位基因特异性聚合酶链反应ASPCR法进行检测 第一步扩增目的片段:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成209l反应体系 eDNA 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 正向引物10.25ul 反向引物2R0.25ul 去离子水 7.5ul 反应条件:95?预变性10分钟后,开始35个循环:95?变性30秒,56"C 退火30秒,72?延伸30秒;最后一个循环72。C延伸10分钟。扩增片段为 228bp。 第二步等位基因特异性扩增:取第一步PCR产物作为模板,分别在2个0.2ml EP管中进行如下反应,每管中加入不同的等位基因特异性正向引物,反向引 物 及其他条件均相同。 第一轮PCR产物 3ul 2xPCRMasterMix 10ul 等位基因特异性正向引物3C/4T0.2ul 反向引物2R0.2ul 去离子水 6.6ul 反应条件:95。C预变性lO分钟后,开始35个循环:95?变性30秒,69。C退 火30秒,72。C延伸30秒;最后一个循环72。C延伸10分钟。扩增片段为150/152bp。 17 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统照相鉴定。第 一步PCR产物作为内参,若两管PCR产物均在150/152bp处显带提示待测患者 骨髓为多克隆造血,若仅1管PCR产物显带,提示待测患者骨髓为单克隆造血 图6。 P1 P2 M C T C T t----22?1__8bp50bp 图6.应用G6PD基因外显子多态性位点进行克隆性检测 每两个泳道代表1个患者,P1、P2均为单克隆 2.3应用BTK基因杂合性基因型进行克隆性分析 采用聚合酶链式反应一限制性内切酶片断长度多态性PCR.RFLP方法进行 分析。 ?PCR反应体系:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20I-tl反应体系。 cDNA 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 正向引物B10.2ul 反向引物B30.2ul 去离子水 7.6ul ?PCR反应条件:95。C预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性30秒, 55?退火30秒,72"0延伸30秒;最后一个循环72。C延伸10分钟。扩增片 段为172bp。取5ul进行2.5%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系 统照相鉴定图7。 ?酶切反应及酶切图谱:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成209l反应体系。 PCR产物8ul 10xNEBBuffer 2ul 内切酶A1wNl0.5ul 去离子水 9.5ul 37。C酶切2小时后进行3%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定。产物在172bp及88/84bp处均显带提示患者骨髓为多克隆造血, 仅在 172bp处或88/84bp处显带者为单克隆图7。 18 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 200bp???? 100bp?叶 M Pl P2P3 图7.应用BTK基因外显子多态性位点进行克隆性检测 每1个泳道代表1个患者,P1、P2均为单克隆,P3为多克隆 2.5应用FHL.1基因杂合性基因型进行克隆性分析 采用聚合酶链式反应.限制性内切酶片断长度多态性PCR-RFLP方法进行 分析。 ?PCR反应体系:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成20“l反应体系。 cDNA 2ul 2xPCRMasterMix 10ul 正向引物L30.2ul 反向引物F20.2ul 去离子水 7.6ul ?PCR反应条件:95。C预变性10分钟后,开始35个循环:95。C变性30秒, 56?退火30秒,72?延伸30秒;最后一个循环72?延伸lO分钟。扩增片 段为13lbp。取5ul进行2%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定图5。 ?酶切反应及酶切图谱:向0.2mlEP管中加入下列成分,配成2%1反应体系。 PCR产物 6ul 10xNEBBuffer 2ul BSA ’0.2ul 内切酶PStl0.5ul 去离子水 11.3ul 37。C酶切4小时后进行3%琼脂糖凝胶电泳,用KodakDC290凝胶成像系统 照相鉴定。若产物在131bp和108bp处均显带提示患者为多克隆造血,仅在131bp 或108bp处显带者为单克隆造血图8。 19 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 M P1 P2 P3 150blr叶 一器器100b卜?+图8.应用FHL.1基因外显子多态性位点进行克隆性检测每1个泳道代表1个患者,P1、P2均为多克隆,P3为单克隆 5.对照试验 为排除X染色体失活偏颇对克隆性分析结果的影响,留取患者晨起漱口水, 离心后从富集的口轻黏膜上皮细胞中提取mRNA,方法同3.1。应用逆转录后所 得cDNA进行PCR反应,条件同4.0,若两个等位基因以正常的1:1转录,则克 隆性检测结果真实可信,若两等位基因转录比例明显失衡,则克隆性检测结果不 能真实反应造血系统的克隆性状态,检测结果无判断克隆性价值。 统计学分析 4个多态性位点的基因型频率在中国正常女性中的分布用Hardy?Weinberg equilibrium进行检验。杂合性基因型频率的比较采用X2检验。 实验结果 1.446例中国正常女性P55、G6PD、BTK、FHL.1基因多态性位点杂合率分析 表3 446例中国正常女性中位年龄3918-90岁,P55、G6PD、BTK、FHL.1 基因多态性位点的杂合率分别为29.4%、12.8%、52.0%、46.4%,符合 Hardy.Weinbergequilibrium检验。联合4个位点,446例正常女性中具有1 个或 1个以上杂合位点者占81.4%363/446例,即81.4%的女用该方法进 行克隆性分析。446例女性中仅3.81%17/446例表现为4位点均为杂合性基 因型。 2.中国正常女性P55、G6PD、BTK、FHL.1多态性位点等位基因频率表4 446例正常女性包括892条X染色体,以上4位点等位基因频率见表4。 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 3.应用X连锁多态性位点进行克隆性检测 对74例血液病患者进行以上4个多态性位点的基因型分析,具有1个或1 个以上杂合性位点的患者共62例,杂合率为83.8%,基本和前述结果相符。 排 除X染色体失活偏颇的影响后,资料完整的16例ET患者及8例MDS或疑诊 为 MDS的患者的临床资料及克隆性检测结果见表5。、表6。从表5中资料可以看出, 多数初诊ET患者表现为单克隆或寡克隆造血。表5’中编号为NO.3的患者虽然 综合各项实验室检查后诊断为ET,但JAK2V617F突变阴性,染色体核型14个 分裂相均正常,缺乏常规实验室检查的单克隆性证据,但我们的实验结果证实其 为单克隆造血,肯定了患者恶性肿瘤性疾病的性质,排除了反应性血细胞增多症。 表6中可见部分早期阶段MDS患者亦检测出明显的单克隆性造血。患者NO.5 和NO.6均为就诊时疑诊为MDS的患者,但因为缺乏诊断MDS的必备条件,亦 未发现其他导致血细胞减少的病因,所以未能确立诊断,应用X连锁的克隆性 检测方法亦证实二者为多克隆造血,目前患者NO.5未经特殊治疗,2年来白细 胞波动于3.6?4.5×109/L,无自觉不适症状。患者NO.6血象稳定,未出现HB和 PLT进行性下降。患者NO.7和NO.8近期收治的血细胞减少症患者,骨髓涂片 细胞学分类均表现为增生活跃,但粒红巨核系发育异常不典型,原始细胞比例不 高,骨髓细胞化学染色亦未见明显的环形铁粒幼红细胞,若染色体核型显示 为正 常,缺乏确诊MDS的确定条件,但X连锁克隆性检测结果提示二者为单/寡克 隆造血,在排除了其他导致血细胞减少的克隆性血液系统疾病的前提下,支 持 MDS诊断。 ,鹭 一 ? 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H.,]【H‰ 【0Nn.ov NnN ?u~ ~ || S?N.ov?N? uu一 一 || ^n?I.0v??||-b一 2卜? ~ ^夏N.o一一nH一 ?o ~ ~ ^小No.o-n一 ~ oo一 ;| ~ S.ov No cL-^L:| 箔厶 ~ 8N一.0-&~ 卜u ~ Soo.ov n ~ E。 一 一 ^价崞?.ov崎?n uu Q山岭o;| ~ 务u茸。口p_函 。盘置。葺。o ?皇。o,msd,Qd90世瓤粘旧皿廿奉峪荨.n僻 掣 I 罂l塞量塞昼暑暑喾0鱼磐0磐0鱼主主主主00 0 0 0 0 壹I b 葛 鼍 o o o 厶 A 厶 厶 A r??卜o?『?_?;?l?_”_~:_?!?10;? 薹 吾l。;nl。;;!;!。‘。。;。:。。!。!。。!。!。 d?|_ !?l ; 一; : ; I ;冒 委螽I |璧 !目:翟目’ .: , .饕闫 l怅龌帐职帐瞅粤埕粤求献限献献限毽 茎錾l I|+;l;Ii鎏:+Il+;I;+;I|+:+|+i 整 l至 :互雪F’互 ;旦 ;守至互 翼 l要蓁蕈堇蕈戛堇蓁蕖蓁享羹;堇戛要蓁I导长 导 导 导 导 导长米张 导张 导 导 导长 鼋引 ; 一 ?l +; +; l -I-!+: +!+: +!+‘ + +: -I-!+ l: l; + 一 f +卜” ? 一 ??: ’。 ?: ; ?:??r JI ?一I 暮 麦I蚤:萎 薰 蚤 釜 星 至 蚤 蚕 晷 吾 嚣 浸 浸‘嚣 嚣o v N o n o 心 。 一 n 奠 o 9 奠 魁 嬉 Q 奠^lHHn 卜 卜 H _H oo 岔 卜 ? n In ? ? i?童f'三-三_三。三?ii”三I~:E?三I。三i“三?:三?-。二i’三一三i!’三j?~一?、,一??一”一j?一j?-一!一一?一’??*~?一。?~?一.???一P~一!~一?^ 羞喜l葛;孚!葛’霹|簧:嗣写善葛l式5晕:茜遣;遥j是!s趸 曼l薹:薹 要 娶:萎 娶i景 蚤 薹 吾 莩 墨 漫 里 曩 至J 蓁 l鲣秘;耋秘瘿|秘|鼬;秘|秘;秘;秘;鼬;堇‘秘;$茎I 蠢 I笛墨;曷;晶喜晶宙;宙i葛|墨;墨;器i器;墨墨;墨l 蕃??1一二一;二;二;菩一三;导r』;二i二|?』~”二r二”二i三『?: 『?:f 主1?j二r二;二?二r二二r二”_:~;a1‘三『.三i?一三;~三j』!~』I nN 咪好孱辑越逝恹《葵斌长磐g枢硝?瞄暴崎一.s僻 议秘掣粘州妖摩_千墼篮貅凼冥塞谣菩迟扑痞貅凼圃壬 仪 袋 趔 扑 州 状 奄 书 喧 送 扑 幽 票 盎 饺 菩 篮 扑 痞 扑 凼 陬 廿 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 讨 论 进行X连锁克隆性检测的必备条件是在X染色上有可区别父本和母本来源 的标记物,即杂合性位点的存在,作为检测的靶点。X连锁克隆性检测的第一代 标记物为G6PD蛋白【91,利用3种G6PD同工酶A+、A‘和B不同的电泳迁移率 区分Xxn和xp。仅约30%的非洲女性表现为该位点的“杂合性”,而在其他人种 女性中杂合性极低,进而限制了该方法的进一步应用。随后的克隆性检测为DNA 水平的检测,利用甲基化敏感的限制性内切酶的消化作用鉴别具有转录活性和失 活的X染色体,利用DNA片段长度多态性区别Xm和Xp,以达到克隆性检测 的目的,该法的代表性标记物包括PGK[10l、HPRT[111、M27B 2 和HUMARAtl3】 基因。其中HUMARA基因的应用最为广泛,HUMAtLA基因的l号外显子中包 含1个具高度多态性的三核苷酸CAG重复序列,可以区分Xrn和Xp。距此短串 联重复序列不到100bp处存在同X染色体失活状态相关的npaII敏感的甲基化 位点,失活的x染色体该位点为甲基化状态,有转录活性的X染色体该位点为非 甲基化状态。HUMARA多态性位点在我国及白种女性中的杂合率约90%【l训。杂 合率的提高使得绝大多数女性患者可以应用此法进行克隆性检测,但这类检测方 法存在一系列固有缺陷,如:基因的甲基化状态可能受到一些非遗传性因素和肿 瘤形成过程的影响【15】,因而影响实验结果的可靠性;酶消化不完全可能影响实验 结果的判断【16】;此外,DNA水平的分析不能研究无核细胞,如血小板和网织红细 胞。而第三代克隆性检测方法,也即基于转录的克隆性检测TCA,可以从不 同程度上克服以上缺点,该方法首先在DNA水平上通过X染色体上的多态性位点 区别III和Xp,进而在mRNA水平上应用转录子鉴别出有转录活性的X染色体。鉴 于TCA法的准确率高,且联合多位点后可对多数女性患者进行克隆性检测, 故我 们的实验采取TCA法。目前可应用于该法检测的X一连锁多态性位点共5个,包 括P55基因G/T,cdsNO.358、G6PD基因C/T,cdsNO.1311、BTK基因C/T, cdsNO.1899、FHL-1基因G/A,cdsNO.1958、IDS基因C/T,cdsNO.438。 Liu等【6】对40例亚洲女性进行上述5个位点的杂合性分析,发现IDS在亚洲女性 中杂合率为0%,P55、G6PD、BTK、FHL-1基因多态性位点杂合率分别为28%、18%、 46%、44%,具有1个或1个以上杂合性位点的正常女性占78%。我们对446例中 国正常女性的上述4个位点进行杂合性分析,P55、G6PD、BTK、FHL.1基因多 态性位点的杂合率分别为29.4%、12.8%、52.O%、46.4%,同国外报道比较,无 显著统计学差异。若4位点联合,81.4%女性具有1个或1个以上杂合性位点, 即可用该方法进行克隆性检测的女性患者达到80%以上,成为目前应用最为广泛 最可靠的克隆性检测方法。 中国医学科学院北京协和医学院博士研究生学位论文 经典的BCR/ABL阴性的MPN,是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性髓 系肿瘤。虽然自2005年以来以JAK2V617F为代表的多个基因突变被发现, 仍有 约40%的ET和MF患者缺少证明疾病单克隆性质的异常的遗传学标记物【17】,这 特别对于ET区别于反应性血小板增多症的鉴别诊断造成了一定的困难。 E卜Kassar[18J联合应用P55、IDS、G6PD的rt.PCR法和HUMARA基因的甲基化 。RFLP检测患者粒细胞、血小板的克隆性,28例ET患者中约70%表现为单克隆 造血,而4例反应性血小板增多症均表现为多克隆造血。Liut6】等用XCIP克隆性 检测方法分析患者粒细胞和血小板,证实19例家族性红细胞增多症及家族性血 小板增多症患者为多克隆造血,26例临床确诊的PV或ET患者及1例疑诊为PV 的患者中22例血细胞为单克隆,认为XCIP检测是诊断MPN的有效方法。我们 的实验结果证实了若研究患者的骨髓单个核细胞,多数ET患者在初诊时表现为 单/寡克隆造血,同E1一Kassar的结果相似。我们在1例疑诊为ET且初诊时 JAK2V617F突变阴性、染色体核型正常的患者骨髓中检测出单克隆造血,不但 诊断上排除了反应性血小板增多症,也支持既往研究的观点,即JAK2V617F并 非MPN发病的初始突变initiatingmutation[19,20],可能存在种系germline 的遗传易感性或某种未知的突变在JAK2突变前已经形成了克隆性造血【21,221。 2006年维也纳MDS工作会议提出MDS的最低诊断标准【23】的“确定条件”为: ?骨髓涂片中红系、粒系或巨核系任何一系细胞中至少10%有发育异常,或环形 铁粒幼细胞15%?骨髓涂片中原始细胞占到5%19%?典型的染色体异常。 不符合上述所有确定条件且疑诊为MDS的患者,可考虑是否满足如下辅助条件: ?流式细胞术检测骨髓细胞表型,明确显示有单克隆红系和或髓系细胞组群 主HUIVIARA分析、基因芯片谱型或基因点突变分析显示有单克隆细胞组群的明确 分子征象?cFu检测骨髓和或循环中祖细胞集落形成显著而持久性减少。 Cermak等幽J用X一连锁HUMARA基因的PCR-RFLP法和IDS、P55基因的ASPCR 法,检测36名女性MDS患者的粒细胞、单核细胞及T细胞,11例RA和RARS 患者中仅2例存在单克隆粒细胞及单核细胞,而14例