核黄素是什么：枯草芽孢杆菌24A1pMX45核黄素发酵工艺的研究 核黄素是什么

核黄素是什么：枯草芽孢杆菌24A1pMX45核黄素发酵工艺的研究 核黄素是什么 核黄素是什么:枯草芽孢杆菌24A1pMX45核黄素发酵工艺的研究 核 黄素是什么 话题:核黄素是什么 文献综述 授权书 延胡索 核黄素 天津大学硕士学位枯草芽孢杆菌24A1/pMX45核黄素发酵工艺的研究姓名:石悦申请学位级别:硕士专业:生物化工指导教师:班睿20070601摘要重组枯草芽孢杆菌,,,,,,,,,,是一株,;,,缺陷的核黄素生产菌株。由于,;,,的缺陷，破坏了细胞的碳分解代谢物阻遏效应的调节机制，降低了葡萄糖所引起的,,,效应的强度，使该菌株能够在高葡萄糖浓度下进行核黄素发酵。本文在摇瓶发酵条件下，研究了接种量、有机氮源和无机氮源、溶氧、无机离子等因素对重组枯草芽孢杆菌,,,,,,,,,,核黄素发酵的影响，优化了发酵工艺条件。接种量对,,,,,,,,,,核黄素发酵具有重要影响。较低的接种量使菌体生长延迟，核黄素产量达到最高的时间也出现延迟。 提高接种量能够明显缩短发酵时间，并提高核黄素最终产量。使用,,,,,为,(,的种子液，细胞浓度约为,(,,×,,,个,,,，接种量为,,时，发酵周期最短，核黄素产量最高。在,(,,酵母粉为基础氮源的条件下，分别加入尿素或磷酸氢二铵作为补充氮源，都能够提高核黄素的产量。,(,,的尿素和,(,,的磷酸氢二铵共同作为补充氮源，发酵,,,，时，核黄素的产量最高可以达到,(,,,,。各种有机氮源的核黄素发酵实验结果明，酵母粉为核黄素发酵的最适有机氮源，棉籽蛋白粉的效果仅次于酵母粉，其它有机氮源效果较差。以,(,,的酵母粉和,(,,棉籽蛋白粉组成的复合氮源，可以代替尿素和磷酸氢二铵的作用，发酵,,,，时，核黄素产量可达,,,,,,。通过改变摇瓶的装瓶量，研究了溶氧对核黄素发酵的影响。发现发酵,,,:时后，溶氧成为核黄素合成的限制性因素。减少装瓶量能够显著提高核黄素产量，使用,,,,,摇瓶，装瓶量,,,,时，核黄素产量可以达到,(,,,,。而采取发酵,,小时后降低温度改善溶氧的方法，也对提高核黄素的产量有一定作用。硫酸铵对核黄素发酵不利，氯化钙对核黄素发酵有促进作用。关键词:核黄素，发酵，基因菌，枯草芽孢杆菌，培养基,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,, ,,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,),,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,，,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,((,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,(，,;,,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,;,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,;,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,(,,,,,,,(,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,曲,,,(,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,(,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,,,,,(?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,, ,(,,,,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,？,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,也,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,(,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,？,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,(,,,,;,,,,,,,,,,,,,？,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,(,,,,(,,,,,,;,,;,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,。,,,,,,,,:,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,，,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,;,,,,,,,,,,,,,，;,,,,,,,,,,,,,独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导 师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的并表示了谢意。学位论文作者签名:乃,,移签字日期:彻,年多月,,日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解墨鲞基鲎有关保留、使用学位论文的规定。特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名:乃?胁导师虢抄客签字目期:伊,年二月，多日签字日期:办唧年‘月形日第一章文献综述第一章文献综述,(,核黄素,(,(,核黄素的理化性质核黄素(,,,,,,,,,,)是一种水溶性的,族维生素，即维生素,,，其分子式为,,,,,,,,,,，系统命名为,，,(二甲基(,,(,’(,(核糖醇基)(异咯嗪【,】，核黄素的结构式如图,,,所示。,,,,,,,,,,,,,,,,,，了，,,,,,,,,,?,,,,,图,(,核黄素的结构式:,,,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,核黄素是 由一个黄色素(光色素)和一个还原形式的核糖所组成。在奶、鸡蛋、瘦肉、鱼、动物的肝、肾及禾本科植物的胚胎中大量存在。早在,,,,年，,,,;,,首先注意到在酵母提取液中，用热处理破坏了抗神经炎因子后还保留了一个热稳定的抗糙皮病因子，即维生素,,。,,,,等人在,,,,年由鸡蛋中分离得到了核黄素结晶，,,,,年揭示了核黄素的化学结构，并开始了化学合成的研究。核黄素是黄色或橙黄色的细针状结晶，微臭，微苦，加热到,,,?时分解。核黄素微溶于水(溶解度约,,,,,,,,,)，略溶于乙醇，不溶于乙醚和氯仿。其饱和水溶液,,值约为,，呈黄色并有黄绿色荧光。核黄素溶解在,(,,盐酸溶第一章文献综述液时，分别在,,,,,,、,,,,,、,,,,,,和,,,,,处具有最大吸收峰。核黄素易溶于酸碱性溶液，但在碱性溶液中不稳定、易分解，对光和紫外线辐射敏感，但对热和空气中的氧稳定。,(,(,核黄素的功能和用途核黄素在生物体内以黄素单核苷酸(,,,)和黄素腺嘌呤二核苷酸(,,,)的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用，是生命活动中不可缺少的维生素。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。核黄素缺乏会妨碍细胞的氧化作用，使物质代谢发生障碍。核黄素作为常用临床药物，用于辅助治 疗口角炎、眼角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病;核黄素在食品工业中可作为色素和营养添加剂，人体大约每天需要,(,,,(,,,核黄素;在饲料工业中用做饲料添加剂，动物饲料中必须含有,,,,,,,,,的核黄素才能满足其生长需要并提高营养的利用率。核黄素最主要的消费市场是饲料，在医药领域用量较少【,,。,(,(,核黄素的生产现状目前，全球对核黄素的需求为,,,,—,,,,吨，供需基本平衡。核黄素的生产技术主要有两种:一种是半合成半发酵法，另一种是微生物发酵法。由于半合成半发酵法成本过高，污染大，不少生产商逐渐关闭生产线，减产或者转换了生产技术路线。微生物发酵法已经成为生产核黄素的主要技术。目前，核黄素的生产厂商主要是湖北广济药业、荷兰的帝斯曼(,,,)和德国的巴斯夫(,,,,)。它们所采用的方法都是微生物发酵法。湖北广济药业凭借,,,,年超过,,,,吨的产量，成为世界上最大的核黄素生产商，市场份额已经上升到,,,,,,,。未来,,,和,,,,都不会将核黄素作为重点品种，因为它们的产品丰富，这两个公司会适当减少核黄素的产量，甚至有可能退出核黄素市场。,(,枯草芽孢杆菌的核黄素生物合成途径枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的模式菌，革兰氏阳性细菌，长,(,微米，宽,(,—,(,微米，芽孢椭圆形，周生鞭毛可运动，一般为好氧生长。作为传统 的工业发酵菌株广泛应用于蛋白酶、淀粉酶、叶酸、鸟嘌呤、肌醇、,(核糖等的生产菌株，工业发酵技术比较成熟。枯草芽孢杆菌没有内毒素，安全性好，可以用于食第一章文献综述品和药品的发酵生产。具有蛋白质胞外分泌系统，能够用于发酵生产同源或异源蛋白产品。枯草芽孢杆菌在很多方面具有优势，已经成为取代大肠杆菌的较为理想的基因工程菌受体菌，在发酵工业领域具有广阔的应用前景。由于枯草芽孢杆菌的优良特性，被选作基因工程受体茵，通过诱变和基因工程改造成为核黄素的工业生产菌株。枯草芽孢杆菌具有核黄素生物合成途径，从葡萄糖开始经过磷酸戊糖途径合成,(磷酸核糖;,(磷酸核糖一方面经一步反应转化为,(,，,,二羟基(,一丁酮,,,磷酸(,,,,);另一方面，,(磷酸核糖进入嘌呤合成途径，生成三磷酸鸟苷(,,,);,,,,和,,,作为核黄素合成的直接前体物进入核黄素合成途径，经七步反应生成核黄素。,(,(,磷酸戊糖途径葡萄糖被细胞吸收后，一部分进入磷酸戊糖途径(,,)，通过,步反应生成,(磷酸(核酮糖【,】，磷酸戊糖途径和所需的酶如图,(,和表,(,:?嘤，攀,?酸葡萄?,?,蝴葡,拶:,獭燃—业销鬻?,需—二。淼鬈葡萄糖——————一糖酸内酯。,锎稽酸,,,,,酮稆表,,,,,途径中各步反应所需的酶,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,反应 步骤,,,催化各步反应的酶,(磷酸葡萄糖脱氢酶内酯酶,(磷酸葡萄糖酸脱氢酶,,途径的总反应式如下:,,磷酸葡萄糖，,,,,,，，只,,,一磷酸核酮糖，,,幽日，,日，(,,,)第一章文献综述,(,(,嘌呤合成途径,(,(,(,次黄嘌呤的合成,(磷酸核酮糖在磷酸戊糖异构酶催化下异构生成,一磷酸核糖。,(磷酸核糖在磷酸核糖焦磷酸激酶的催化下，由,,,参与，生成,一磷酸核糖焦磷酸(,,,,)，然后进入嘌呤合成途径。从,一磷酸核糖开始到次黄嘌呤的合成途径和所需的酶见图,(,和表,(,:,(氨基咪,(氨莱咪唑核苷酸,唑(,(羧酸,核苷酸:嚣卜卜(,?,删,一,,’，。,,,，,,,御?附,、,口核苷酸次黄嘌呤核苷酸,,—,?),，,，饰,,,,,,甲酰甘氨脒醐胡;酸甘氨酸,,、,,,,,,，,,甘氨酰胺核苷酸删?已,地,。,一)栅,,曲妒，,,蓦州,、,皿甲酰甘氨酰胺核苷酸一卜篡肌“一一凰肿?,』一一(,群馘图,(,嘌呤合成途径,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,(,,第一章文献综述表,(,嘌呤合成途径中各步反应所需的酶,,,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,反应步骤催化各步反应的酶,磷酸核糖焦磷酸激酶,磷酸核糖焦磷酸(酰氨基转移酶,磷酸核糖甘氨酰胺合成酶,磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶,磷酸核糖甲酰甘氨咪 唑合成酶,磷酸核糖氨基咪唑合成酶,磷酸核糖氨基咪唑羧化酶,磷酸核糖氨基咪唑(琥珀酸一甲酰胺合成酶,腺苷酸(琥珀酸裂解酶,,氨基眯唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶,,次黄嘌呤核苷酸还水解酶嘌呤合成途径的总反应方程式为:,一磷酸核酮糖，,谷胺酰胺，甘氨酸，,,,,,,,，,,,，天冬氨酸，?卵，，，?,见,,,谷氨酸，,,,,，延胡索酸，次黄嘌呤核苷酸，,,,,，,,,，删,(,(,(,鸟嘌呤核苷三磷酸的合成次黄嘌呤核苷酸经氧化生成黄嘌呤核苷酸。反应由次黄嘌呤核苷酸脱氢酶所催化。黄嘌呤核苷酸经氨基化生成鸟嘌呤核苷酸(,,,)，以氨为氨基供体，氨基化时需要,,,供能。,,,由鸟苷激酶催化生成,,,，然后由激酶催化生成,,,。鸟嘌呤核苷三磷酸合成的总反应式如下:,御，,么,,—,,,，,,,,，,,,(,(,),,(,(,核黄素的生物合成途径在枯草芽孢杆菌中，核黄素合成的前体物为,,,和,(磷酸核糖，经七步酶促反应，转化为核黄素【【,’,，,，,，,，,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,捌，核黄素合成途径见图,(,:第一章文献综述优即四也一帖,,,七粤等埘,,,,,,?止矿,,(,(,,,，冲,,,,卜,,,,,，,、,,,,,,,,,,,图,,,核黄素合成途径,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,表,—,核黄素合成途径中各步反应所需的酶～垒,～宝～:?宝磐,空宝,呈星,,,,翌坐宝～,,,,巫垒,,,璺?垫反应步骤,,,,,,,催化各步反应酶,,,环水解酶，，脱氨酶还原酶磷酸酶,，,(二羟基(,(丁酮一,(磷酸合成酶二氧四氢蝶啶合成酶核黄素合成酶第一章文献综述表,,,核黄素合成途径中反应物的英文缩写和中文名称～垒?～宝～兰星呈,～,些呈翌坚磐垒,坠,罂宝～曼呈翌些,,望丝～磐～垫星,,,罂坐宝,垄,,生鲤～～呈:垫英文缩写,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,中文名称三磷酸鸟苷,，,(二氨基(,(核糖氨基,,(,,)(嘧啶酮(,(磷酸,(氨基(,(核糖氨基,,，,(,,，,,)(嘧啶二酮一,一磷酸,(氨基一,(核糖醇氨基(,，,(,,，,,)(嘧啶二酮(,(磷酸,(氨基(,(核糖醇氨基(,，,(,,，,,)(嘧啶二酮,，,(二甲基(,(核糖醇基(,，,(二氧四氢蝶啶,(磷酸核酮糖,(,，,(二羟基(,(丁酮,,(磷酸核黄素,,，冲,,,，，,一,(,,,,,，心从,,,合成核黄素的总反应为:,,,,，,,,,，,,,,,,，,日，，,,一,一,一,,,,,,，,,,,，,,,,,,，,,,，,,,，,,(,,,),(,(,核黄素生物合成的总反应,甬自,,,弗毒一,一谚《酸，,宅谳睹,,,,胺，,目专,澉，,,;玛, ,,移，,;,，,嬲，,,,,,，‘从,一磷酸葡萄糖合成核黄素的总反应可以写为:，,,,,，，,,,,,，,,,,—争,谷:氨酸，,，,瓦十,延曰月索酸，,月,四,,,，,，理,彳，,,,,(,,,),,，,,，,,,,,,，,,,,,,，,,,,,，,矿，,,,,，,,料，,,,,,，,,,,由核黄素合成途径可知，生成,分子核黄素消耗,分子葡萄糖(,(磷酸、,分子谷胺酰胺、,,分子,,,、,分子甘氨酸、,分子,,,和,分子天冬氨酸，生成,分子谷氨酸、,分子,,,,,、,分子,,,,、,分子,,,和,,分子,,,。,(,产核黄素,(,,,,,,,,基因工程菌野生型的,(,,,,,,,,不能过量合成核黄素，通过对细胞进行诱变和基因工程改造，获得的工程菌株能够过量合成核黄素。过量合成核黄素的基因工程菌，主要在其嘌呤合成途径、核黄素合成途径、糖分解代谢途径及其调控机制，以及与产能相关的呼吸链等方面进行了遗传改造。第一章文献综述,(,(,嘌呤合成途径的改造,,,是核黄素合成的直接前体物，其在细胞内的合成受到严格调控，通常在细胞内不能过量积累。细胞只有能够过量合成,,,，才能为核黄素合成提供充足的前体物，为核黄素的过量合成提供必要条件。通过诱变手段，选育嘌呤结构类似物抗性菌株，能够获得,,,过量合成的突变菌株。各种抗性突变株以及生理效 应见表,—,【,,，,,,。表,,,筛选药物作用机理,,,,,(，，，，，，，，，，，，， ????????????????,,, ?????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????? ????一,,,地,墼翌堑里坐,呈垒～里兰～塾磐,罂,,兰～,,呈结构类似物抗性菌株的生理效应,一氮鸟嘌呤，,一氮腺嘌呤解除嘌呤合成中的反馈调控德夸菌素增加)(】?,到,,,的合成，阻止,,,至，,，,,的逆反应甲硫氨酸亚砜加强，,,到?,，,的代谢通量阿洛酮糖素增强,,,合成酶的活性块菌素、丰加霉素增强,,,,转酰氨酶活性,,,,等人以,(,,,,,,,,,,,,,,,为出发菌株，使用,一甲基一,’一硝基一,一亚硝基胍为诱变剂，筛选突变株，减少,,,,,,磷酸水解反应的活性，所获得的丑,,,,,,,,,,,,,,,突变株由,,(,,,水解反应减少,,,，而核黄素的发酵单位提高近,倍【,,,。,(,(,解除核黄素操纵子的反馈抑制野生型核黄素操纵子的表达受到核黄素的间接反馈抑制。核黄素在黄素激酶的催化下生成黄素腺嘌呤单核苷酸(,,,)，,,,作为效应分子作用于核黄素操纵子,,,,前导区的,,,元件，使,,,,前导区形成类似终止子的二级结构，提前终止,,,,的转录。通过诱变选育 核黄素结构类似物玫瑰黄素的抗性突变株，或者选育核黄素操纵子的,,,,突变型，都可以有效解除核黄素的间接反馈抑制作用，使核黄素操纵子组成型表达。‘,,,,基因是细胞内主要的黄素激酶编码基因。玫瑰黄素抗性突变株是一种,,,,突变型，其一个点突变使黄素激酶的活性降低到,,，能够极大的减少核黄素转化为,,,，避免过量,,,对核黄素操纵子的转录弱化作用【,,’,,，,,,。编码核黄素操纵子,,,,的,’端非转译区内参与核黄素操纵子转录弱化调控的序列，被称为,,,,。在该区发生的突变，可能影响,,,与,,,元件的结合，第一章文献综述以及类似终止子的二级结构形成，从而解除,,,的转录弱化作用【,引。,(,(,增加,,,操纵子的表达水平,(,(,(,增加核黄素操纵子的基因剂量在解除了嘌呤合成途径和核黄素操纵子表达的反馈调节后，可以获得过量产生核黄素的菌株。这种菌株在固体培养基上呈黄色，在发酵液中能够积累少量核黄素。为了增加核黄素合成量，首选方法是增加核黄素操纵子的基因剂量【,,,。,,,,,,,,等构建了产核黄素工程茵,(,,,,,,,,,,,,,,,,,，该菌携带含有核黄素操纵子的质粒,,聪,。质,立,,,,,在细胞内有两个拷贝，加上染色体上的一个拷贝，细胞内总共有三个核黄素操纵子拷贝。由于基因剂量的增加，,(,,,,,,,,,,,,,,,, ,发酵,,,,,,、时，可产核黄素，(,,,,，对发酵培养基进行优化后，产核黄素可达,(,,,,,,引。陈涛等用带有一,操纵子的质粒,,,,,转化,(,,,,,,,,,,,,，发现核黄素操纵子每增加一个拷贝就会使核黄素产量增加,(,,,,。但是当核黄素操纵子拷贝数超过,时，对核黄素产量和细胞生长不利【,例。,(,(,(,用强启动子表达核黄素操纵子在增加核黄素操纵子基因剂量的同时，可以将核黄素操纵子中的启动子替换为组成型的强启动子以增强操纵子的转录。核黄素操纵子的启动子以,用，一,,,和,,,,,都是比较弱的启动子，,,,,,,,等的研究表明，在完全解除核黄素操纵子转录的弱化调控机制后，,,,,,的转录活性仍然比其它操纵子的启动子要弱。在,，,,;,的转录融合实验中，由以脚控制转录的?一半乳糖苷酶的活性比由,,卯砖空制转录的酶活性低,,倍，这说明一,凹是一个比脚,尸,更弱的启动子。,,,,,,,等以,(,,,疗,,,,,,为出发菌株，通过一系列遗传改造构建了过量合成核黄素基因工程受体菌。在受体菌的染色体上的,(,个位点上分别整合了两个或更多个核黄素操纵子的拷贝。在此基础上，他们进一步改造了核黄素操纵子上的启动子，用噬菌体,,,,的强启动子,,,替换了核黄素操纵子上的两个天然启动子订卯，和,,,,,。获得的菌株,(,,,,,, ,,,,,,::,,,,,,,,,。发酵,,小时后可产核黄素,,?,,,,,，,,小时后达,,,,,【,,,。,(,(,(,增加,,,,的基因剂量,,年代末,,,,,,,,,等人研究发现，,,,,基因编码的,,,环化裂解酶，，和,，,(二羟基,,,丁酮,,,磷酸合成酶双功能酶是核黄素合成代谢途径中的限速酶。他们在,(,,,,,,,,,,,,,,染色体的,,,个位点上整合了多个核黄素操纵子的拷贝，在第一章文献综述此基础上，借助,,,,转导使一个置于中等强度启动子,,,，控制下的,,,,基因插入受体菌的,,;,位点上，构建了菌枇(,,,,,,,,,,,,,,，进一步增加了,,,,基因的表达量，使核黄素的产量提高了约,,,,,,,。,(,(,糖代谢途径和能量代谢途径的改造,,,,,等在,,,,,,,等人构建出的基因工程菌,(,,,,,,,,,,,,::,,,,,,,,,的基础上，在编码,瓶化酶的;,,,,操纵子中插入新霉素抗性基因，敲除了呼吸链中效率较低的末端氧化酶一,瓶化酶，使呼吸链的电子传递效率升高，提高了能量的产率，从而使菌体的维持代谢比原来降低了,,,，而核黄素的产量提高,,,,,,,,。,一磷酸核酮糖是核黄素合成的前体，增加磷酸戊糖途径的通量可以增加,(磷酸核酮糖的供给，有利于核黄素产量的提高。朱英波等在,,,,::,, ,,,,,,中过量表达,,,,基因，使得,,,,,菌株中葡萄糖脱氢酶的活性增加了,倍，增加了,(磷酸核酮糖的产量，使核黄素的产量提高了,,,,,,,。,(,(,最,,,,,,,,,,,,,,,,,,的特点,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,是由本实验室枷(,,,,,,,,,,,,,,,,基础上，通过敲除;;,,基因和恢复,,;,基因，构建的能够利用高浓度葡萄糖进行核黄素发酵的工程菌。,(,,,,,,,,,,经过多重物理、化学诱变，削弱或解除了从葡萄糖到,,,合成途径中对,,,合成的反馈调节，具有嘌呤结构类似物,(氮鸟嘌呤(,(,,)，,(疏基鸟嘌呤(,(,,)和德夸菌素等抗性遗传标记;敲除了,,,,基因，解除了核黄素操纵子转录所受到的调节，具有核黄素的结构类似物玫瑰黄素的抗性标记;,,;,突变，在一定程度上可以提高游离型核黄素质粒的结构稳定性。从枯草芽孢杆菌染色体上分离出带有核黄素操纵子的,,,,左右的,,,片断，未做消减(核黄素操纵子长度为,(,,,左右)和修饰，直接连接到质粒,,,上而构建出重组质粒,,,,,，载体大小,,,,，带红霉素抗性基因。将重组质粒,,,,,转化到丑,,,,,,西,,内构建出,(,,,,,,,,,,,,,,,,。质粒,,,,,在细胞内有两个拷贝，加上染色体上的一个拷贝，细胞内总共有三个核黄素操纵子拷 贝。所含的核黄素操纵子在,,?左右有最大活性。在培养中,(,,,,,,,,,,,,,,,,可使用蔗糖和糖蜜作为碳源。在发酵过程中，,(,,,,,,,,,,,,,,,,可将所合成的核黄素直接分泌到胞外，在发酵液中核黄素浓度超过,,,,即可明显看到核黄素结晶析出，该菌在,,,的自控发酵罐上，发酵单位已达到,,,,,。但是，由于经过多次诱变，,(,,,,,,,,,,,,,,,,生长比较缓慢，传代时间较长;对葡萄糖利用比较缓慢，不适于用葡萄糖做碳源发酵生产核黄素;而且,,;,基因的缺失使其很难在染色体上进行基因的重组、整合和扩增，、