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反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究

2017-11-14 8页 doc 40KB 23阅读

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反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究 孙红妹 刘哲伟 张霆 ( ) 【摘要】 目的 针对柯萨奇病毒23 型 CVB基因组重要功能区设计系列反义寡聚核苷酸序列 , 3 通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用 。方法 通过病毒空斑形成试验及致细胞 病变作用 ,了解反义核酸抑制及阻断 CVB病毒感染细胞的能力 。结果 实验所设计的反义核酸中 3 S对感染 HeL a 细胞的 CVB病毒活性抑制作用较强 ,当病毒感染量为 1 MO I 时 ,病毒活性抑制率 CB1 3 高达 90 % ; S和 S均为 75 % ...
反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究
反义寡聚核苷酸抗柯萨奇病毒感染的研究 孙红妹 刘哲伟 张霆 ( ) 【摘要】 目的 针对柯萨奇病毒23 型 CVB基因组重要功能区系列反义寡聚核苷酸序列 , 3 通过实验观察特异性反义核酸对病毒感染细胞的抑制作用 。方法 通过病毒空斑形成试验及致细胞 病变作用 ,了解反义核酸抑制及阻断 CVB病毒感染细胞的能力 。结果 实验所设计的反义核酸中 3 S对感染 HeL a 细胞的 CVB病毒活性抑制作用较强 ,当病毒感染量为 1 MO I 时 ,病毒活性抑制率 CB1 3 高达 90 % ; S和 S均为 75 % ; S有 50 %抑制作用 ;而 S和 S以及非特异性对照序列对 CVBCB4 CB2 CB6 CB3 CB5 3 病毒基因基本没有任何作用 。结论 通过以上实验确定 S、S、S等较好的抗病毒反义核酸序 CB1 CB2 CB4 列 ,为进一步研究反义核酸抗病毒作用提供了重要的实验基础 。 【关键词】 反义寡聚核苷酸 ; 柯萨奇病毒 ; HeL a 细胞 Antisense ol igonucleotides resistance to coxsackievirus Binf ection in HeLa cells S U N Hong mei , L I U 3 Zhew ei , Z HA N G T i n g . Bei ji ng Cent ral L aboratory of I nf ect ion an d I m m u ni t y , Capi t al I nst i t ute of Pedi at rics , Bei ji n g 100020 , Chi n a ( ) 【Abstract】 Objective Antisense oligodeo xynucleotides ODNshold great p ro mise as t herapeutic agent s for t he t reat ment of many human diseases. Oligo nucleotides specifically hybrid wit h a selected () sequence of RNA or DNA and inhibit t he flow of genetic informatio n DNA or RNAto p roteins. In accordance wit h t he p resent st udy , several oligo nucleotide sequences t hat targeted CVBRNA coding Vp, 3 4 ( ) Vp, Vp, cleavage enzyme P2A or unt ranslatio nal regio n were designed for observatio n. Methods 2 1 Antiviral activities of t hese oligo nucleotides were evaluated by plaque reductio n assay and cytopat hic effect () CP E. Cells were also t reated wit h rando m oligo nocleotides as a specificit y co nt rol . Results Original (ODNs , displaying sequence2specific inhibitio n ranging f ro m 50 % to 90 % were identified. Three ODNs at ) ) ( 5 micro M co ncent ratio n, which targeting at t he p yrimidine 2 rich t ract S, st ruct ural p rotein V P CB1 1( ) ( ) Sand initiatio n of t ranslatio n Swere shown to exhibit inhibitio n of viral infectio n 75 % to 90 % at CB4 CB2 1 MO I. There was o nly low antiviral activity in Sand S, and rando m oligo nucleotide were not found CB5 CB3 having antiviral activity. Oligo nucleotides in t his st udy were not to xic at 5 micro M co ncent ratio n. Conclusion A bet ter antiviral antisense oligo nucleotides as Sand S、S, could p rovide candidate CB1 CB4 CB2 antisense oligo nucleotides for t he t reat ment of CVBinfectio n. 3 () 【 Key words】 Antisense oligodeo xynucleotides ODNs; Co xsakievirus ; HeL a cells 柯萨奇病毒是引起人类呼吸道 、心血管及神经疾病 、肿瘤和炎症等疾病治疗中具有诱人的应用前 系统感染等疾病的主要病原之一 ,病情从轻微的上 ,反义核酸治疗 A IDS 和人类巨细胞病 景 。在国外 1 24 ( ) 毒 HCMV感染已进入临床实验阶段。国内也 呼吸道感染到致死性感染不等 。病毒性心肌炎及扩 已经对流感等病毒进行了反义 核 酸 抑 制 感 染 的 初 张性心肌病近 10 年颇为常见 ,而且发病率有不断上 5 ,6。以下重点探讨我们设计的反义核酸序列对探 升的趋势 ,严重危及人民生命健康 。目前对病毒感 柯萨奇病毒感染 HeL a 细胞的阻断作用 。 染尚缺乏特异 、有效的预防和治疗手段 ,研究特异性 抗病毒新药具有重要的现实意义 。反义核酸技术是 材料及方法 利用具有专一顺序的寡聚脱氧核苷酸 ,特异阻断目 1 . 病 毒 及 细 胞 : 实 验 所 用 病 毒 株 为 本 室 通 过 的基因的复制 、转录 、翻译 ,是一种新型的治疗方法 , CVBcDNA 感染性克隆 ,在转染细胞后获得 , 其病 3 具 有特异 、高效 、易人工合成等优势 。在病毒感染性10 毒滴度为 4 ×10pf u/ ml ,经传代后 , - 80 ?低温冰 箱保存 。使用时用无血清 einimum essential medium 作者单位 : 100020 首都儿科研究所 北京市感染与免疫中心实 ( ) M EM稀释病毒 。HeL a 细胞株由本研究所生化免 验室 10 10pf u/ ml 。本实验采用此稀释度的病毒 , 对抑制 疫室提供 ,细胞培养液为含 5 %, 10 %新生牛血清 的 M EM 。结果易于量化 。 表1 病毒空斑形成试验结果2 . 反义核酸 : 针对 CVB病毒基因组的调控序 3 ( )空斑数 均值 病毒稀释度 列 、结构蛋白 、非结构蛋白及非编码区序列等分析 , - 4 > 200 5 ×10 (设计 6 组不同的反义寡核苷酸 由上海 Sango n 生物 - 5> 200 ×10 5 ) - 6 工程公司合成,序列如下 :> 200 5 ×10 - 7 S5′A GTA TA GGAA TAAAA T GAAA 3′ 150,200CB1 5 ×10 - 8 S5′T T GA GC TCCCA T T T T GC T GT 3′ 35 CB2 5 ×10 阴性对照 0 S5′C GT GCC T GACCAA T GGT GA T 3′ CB3 S5′CAAAC GTCA GC TCCA GGTC G 3′ CB4 S5′AA T GC GCCC GTA T T T GTCA T 3′ CB5 二 、反义核酸阻断病毒空斑形成效果 S5′C TCC T GGGGTA GTA T TCAC T 3′ CB6 用病毒空斑形成阻断试验显示反义核酸对病毒 感染细胞的抑制 。应用所设计的 6 种反义寡核苷酸 病 毒 为3 . 病 毒 空 斑 形 成 试 验 : 稀 释 CVB 3- 8(μ) 5 mol/ L 处理 HeL a 细胞 ,然后用 5 ×10 稀释度 - 4- 8 (10 ,10 ,分别加入 6 孔细胞培养板 细胞数 2 × 的病毒感染细胞 。同时设病毒 、正常细胞及非特异 6 μ) 10/ 孔 ,病毒量 200l/ 孔,37 ?,5 % CO孵育 1 h , 2 ( ) 寡核苷酸 rando m对照 。结果见表 2 。 () 加入0 . 7 %琼脂 1 ml/ 孔,再孵育 72 h 。1 %结晶紫 染色 ,观察结果 。 - 8 表2 5 ×10 稀释度病毒空斑阻断试验结果 μ4 . 空斑阻断试验 : 用浓度为 5 、 mol/ L 的 SCB1 ( μ)反义核酸 5 mol/ L ( )空斑数 均值 S、S、S、S和 S分别加入 HeL a 细胞培养CB2 CB3 CB4 CB5CB60 正常细胞对照孔 S1 CB1 孔中 ,37 ? 5 %CO孵育 72 h ,固定 、染色后观察结 2 S5 CB2 果 。 S12 CB3 ( ) 5 . 病毒致细胞病变效应 CP E: 稀释病毒使最 S1 CB4 S6 CB5 ( ) 后细胞的感染量 MO I为 10 、1 、0 . 1 、0 . 01 4 种病毒 S3 CB6 μ稀释滴度 ,分别加入细胞孔中 ,每孔 200 l 。同时设 rando m 25 正常细胞对照孔 。病毒感染 1 h 后 ,洗去病毒加正 35 病毒感染对照孔 常培养基 ,37 ? 5 %CO孵育 72 h 。观察结果 。 2 6 . 反义核酸抑制病毒致细胞病变效应 : 将合成 三 、病毒致细胞病变效应 6 μ的寡聚核苷酸稀释至 5 mol/ L ,分别加入培养板的 根据每个培养孔细胞数为 2 ×10,及病毒空斑 10 细胞孔中 ,每孔 1 ml 。37 ? 5 %CO孵育 6 h 。 2 形成单位 4 ×10pf u/ ml , 可 算 出 从 原 病 毒 液 中 取 7 0 . 01 、0 . 1 、1 . 0 、10 MO I 4 种感染量的 CVB病 3 μμ0 . 5l ,稀释到 200l ,其病毒量为 2 ×10pf u/ ml ,即 分别感染 HeL a 细胞 ,37 ?5 %CO孵育 1 h ,合成的 2 感染复数为 10 MO I 。继续稀释病毒 ,用 4 种不同感 μ6 种寡聚核苷酸分别稀释至 5 mol/ L ,再加入已感 染量的病毒感染 HeL a 细胞 ,培养 72 h 后 ,细胞存活 染不同滴度病毒的细胞孔 ,每孔 1 ml ,37 ? 5 %CO2 情况见表 3 。 孵育 72 h ,观察结果 。 表3 不同滴度病毒感染细胞情况 ( )病毒感染量 MO I 活细胞量 结果 0 . 01 少许 0 . 1 无 一 、病毒空斑形成试验 1 无 7 CVB 感染性克隆的构建 、转化见文献。转化 10 无 无病毒细胞阴性对照全部后 3 日收获成熟病毒 。按表 1 中所列滴度进行不同 稀释 。待细胞在培养板底面生长近 95 %时 ,进行空 斑形成实验 。 3 可见 ,当病毒 MO I 为0 . 01时 ,病毒 RNA由表 - 8 进入 HeL a 细胞仍有部分存活 , MO I 为0 . 1 时 ,培养 由表 1 可见 5 ×10 稀释病毒感染细胞后形成 72 h 细胞几乎全部死亡 。35 个空 斑 , 可 计 算 出 此 病 毒 空 斑 形 成 单 位 为 4 × 和死亡 ,可观察细胞的感染程度 。我们用浓度是 5,反义核酸有明显的抑制病毒感实验结果显示 μ mol/ L 的 6 种 反 义 核 酸 分 别 对 0 . 01 、0 . 1 、1 . 0 、10染细胞的作用 ,但针对病毒不同区域所产生的效果 MO I 感染量的病毒所感染的细胞进行实验 ,观察其 也不同 。由表 2 可见 ,在病毒空斑阻断试验中 , SCB1 保护细胞的效果 ,结果见图 1 。 抑制病毒 感 染 的 能 力 较 强 , S、S和 S次 之 , CB4 CB6 CB2 S、S的抑制病毒能力最差 。在反义核酸对病毒 CB5 CB3 致细胞病变效应的影响中 ,当病毒的感染量为0 . 01 、 0 . 1 MO I 时 S和 S抑制病毒效果很好 ,无死亡 ; CB1 CB4 随病毒感染量逐渐增加至 10 MO I , S对病毒仍有 CB1 较好的抑制作用 ,而 S则随病毒感染量的增加 ,抑 CB4 制病毒的效果逐 渐 减 弱 , 有 一 部 分 细 胞 出 现 死 亡 。 S、S抗病毒效果稍差 ,当病毒感染量为0 . 01 个 CB2 CB6 MO I 时有少许细胞死亡 , 病毒滴度增加时 , 死亡细 胞随之增加 。S和 S对病毒基 本 无 抑 制 作 用 , CB3 CB5 当病毒感染量为 1 MO I 时 ,细胞几乎全部死亡 。 图1 6 种反义核酸的抗病毒效应 根据上 述 实 验 结 果 , S对 感 染 HeL a 细 胞 的 CB1 CVB抑制作用最好 ,S、S和 S的抗病毒作用3 CB2 CB4CB6以上结果显示 ,根据不同区域设计的反义核酸 ,而 S 和 S 以及非特异性对照序列对 CVB稍差 CB3 CB5 3 对病毒的抑制能力不同 ,其中 S、S、S和 SCB1 CB2 CB4 CB6 病毒基本没有作用 。这与作用部位有关 ,我们准备 均显现出对病毒感染的抑制作用 ,结果与空斑形成 在不同病毒复制水平及量效关系上进一步研究 。此 抑制实验显示出一致性 。S的抑制效果 > 90 % , CB1 外 ,我们在反义核酸对细胞的毒性观察中 ,未见明显 S也达到 75 % , S在 0 . 1 MO I 时显示出 > 90 % CB2CB4 的细胞损伤 ,提示了反义核酸的使用安全性 。 的抑制效果 ,而在1 . 0和 10 MO I 时也显示出 75 %和 参 考 文 献 50 %的抑制率 , S抑制率为 50 % 。同时我们设立 CB6 正常细胞对照组 ,设随机合成的寡核苷酸为非特异 1 Stein CA , Chen YC. Antisense oligo nucleotides as t herapectic agent 2 Is t he bullet really magical ? Science , 1993 ,261?100421012 . 性对照 ,结果未发现任何保护作用 ; 此外 ,反义核酸 Wagner RW. Gene inhibitio n using antisense oligo deo xynucleotides. 2 μ对细胞毒性试验的浓度设在 5 mol/ L ,其细胞生长 Nat ure , 1994 ,372?3332335 . 结果与单纯细胞对照组相比未出现明显的细胞损伤 Whit to n J L . Antisense t reat ment of viral infectio n . Advances in 3 Virus Research , 1994 ,44?2672303 . 及影响细胞生长的现象 ,了反义核酸的应用对 Nichols W G , Boeckh M . Recent advance in t he t herap y and 细胞生长没有明显的毒性作用 。 4 p reventio n of CMV infectio ns. J Clin Virol , 2000 ,16?25240 . 裘慕 ( ) 绥. 反义核酸对小鼠腹水瘤病毒 反转录病毒的抑制作用. 中国讨论 5 科学 B 辑 ,1991 ,6?6022608 . 陈忠斌 , 王升启 ,朱宝珍 ,等. 硫代反义寡核苷酸在细胞培养内抗 反义核酸进行抗病毒治疗 ,作用原理主要为阻 6 甲型流感病毒活性. 病毒学报 , 1998 ,14?1932198 . 断病毒基因组的转录与翻译 。从核苷酸水平上寻找 Zhewei Liu , Cart hy CM , Cheung P , et al . St ruct ural and f unctio nal 抗病毒治疗的方法 ,是抗病毒治疗的最佳途径之一 。 7 analysis of t he 5’unt ranslated regio n of co xsackievirus BRNA : In 3 柯萨奇病毒基因组为正链 、单链 RNA , 大约由vivo t ranslatio nal and infectivit y st udies of f ull2lengt h mutant s. 7 400 bp 组成 。CVB RNA 基因组的调控序列 、结构 Virology , 1999 ,265?2062217 . ( ) 收稿日期 :2000203217蛋白 、非 结 构 蛋 白 及 非 编 码 区 序 列 已 基 本 确 定 清 7,本实验在对 CVB较深入的分子生物学研究楚 3
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