酶标仪快速检测Rh-D阴性血型的方法研究

酶标仪快速检测Rh-D阴性血型的研究 国外医学临床生物化学与检验学分册2005年4月第26卷第4期 SectClinBiochem&LabMedForeignMedSei,April2005,Vol26Jo.4 酶标仪快速检测Rh—D阴性血型的方法研究 曾劲峰李活张红马兰聂冬梅许晓绚 【摘要】目的建立一套快速,高效的Rh—D阴性血型鉴定方法,用于血站系统大批 量Rh—D定 型实验,以便达到快速,准确,高效检测的目的.方法采用全自动样品处理仪完成对 待检红细胞的 稀释,分配及加入抗一D试剂的全过程.采用酶标仪在620nm波长条件下进行批量 比色判读结果.结 在血球稀释浓度为1:8,Rh检测试剂稀释度为1:16时,对果利用酶标仪快速检测, 13800份标 本进行检测,结果符合率为100.结论酶标仪快速检测Rh—D阴性血型的方法操作 简单,快捷,精 确性,重复性较好,对于减少血站系统检验人员工作强度,提高工作质量有较大帮 助. 【关键词】免疫酶技术;Rh—Hr血型系统 Studyonrapidenzyme-readermeasureRh-DnegativetypeofhumanbloodgroupZENGJin—feng,LJ Huo,ZHANGHong,eta1.TheBloodCenterofShenzhenCity,GuangdingProvince,Shenzhen 518035,China [Abstract]0bjectiveToestablisharapid,accuracyandefficientmethodforbatchsampleiden — tificationofRhbloodgroupD-negative.MethodsThewholeprocessincludingdilutionofsa mplee— rythrocyte,itsallocationandaddinganti— Dagentwastreatedwithfullautomaticsampleprocessor. Thecolorimetryofsampleswastreatedwithenzymatic— readerat620nm.ResultsThecorrectrateof RhbloodgroupD-negetiveis100for13800bloodsamplesinconditionof1:8forerythrocyted ilu— tionand1:16forRhassayagentdilution.ConclusionThismethodissimple.rapidforidentific ation ofRhbloodgroupD-negetivewithgoodaccuracyandprecision,whichisquiteusefulforprom oting theworkqualityandreducingtheprofessionalworkloadinbloodstation. [Keywords]Immunoenzymetechinques;Rh—Hrblood—groupsystem 目前,Rh血型筛查及鉴定基本上采用盐水,酶法 及聚凝胺等技术在试管中进行_1].在血站系统日常 工作中,Rh—D(RhbloodgroupD-negative)定型繁琐, 许多血站检验科Rh-D检测基本上采用手 工作量大. 工加样,每天面对数以百计的标本,用手工处理大量 的血型鉴定工作,很容易造成加样错误,从而导致结 果错判.为解决上述问题,本中心检验科于2003年6 月开始对Rh—D检测采用全自动样品处理仪分配样 品,酶标仪自动判读结果的方法进行探索. 资料与方法 1.标本来源及方法:本血液中心献血人员正常标 本13800份.每支试管采集7,8ml全血,加入50tA 23.8%EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid—disodi— umsalt)抗凝剂_2],充分混匀.待血清免疫学试验加 样完毕后,再吸取底层红细胞做Rh—D检测. 2.试剂:Rh—D检测试剂(加拿大DominionBio- logicalsLimited),效价1:256,批号:NDMG03107, NDMGM3203.0.9NaC1水溶液. 3.仪器和设备:瑞士TECAN公司生产Geneisis- RSP一200型全自动加样仪;德国产UNIVEREAL一32 型平板离心机,酶联平板振荡仪;奥地利生产HT-3 酶标仪;空白酶联实验96孑L/U型板. 作者单位:518035广东省深圳市血液中心 ? 论着? 4.应用软件:自动加样系统采用TECANGeneisi RSP控制软件"logic",酶标仪采用奥斯邦公司开发 的"Ausbio"应用软件. 5.统计学方法:卡方检验法. 实验步骤 1.用GenesisRSP-200仪器上的8根加样针快速 分配0.9NaC1水溶液,将待检标本稀释一定比例的 待检红细胞,并吸取已稀释好的红细胞10td到空白酶 联实验96孑LU型板中].每孑L再加已配制好的Rh 定型试剂5otA. 2.经UNIVEREAL一32型平板离心机以1280r/ min,离心lmin,再用酶联平板振荡仪在一定条件下 振荡悬浮.凝集的红细胞呈块状散于孑L底.不凝集 的红细胞呈混悬状态. 3.用HT一3酶标仪在620nm波长状态下进行自 动扫描,获取每孑L的相对透光率值(Tc值). 结果 1.待检标本血球浓度对Tc值的影响:分别抽取 传统试管法已确认的Rh—D阳性标本(呈凝集反应)及 10份Rh-D已确认的阴性标本(呈非凝集反应),离心 后取底部红细胞分别按1:1,1:2,1:4,1:8, 1:16,1:32稀释度做倍比稀释,用酶标仪反复比色 3次,得出每孑L的平均Tc值(见1).从表1中可以 旦垦兰I堕堕生塑堂皇堕堂坌丛曼年4月第26卷第4期SectClinBioehem&LabMedForeignMedSd.April2005,Vol26,No.4 看出,凝集试验平均孔的透光率(Tc值)从1:1到 1:32呈线性关系(P<O.01),非凝集试验平均孔的透 光率(Tc值)从1:1到1:32浓度虽不呈线性关系(P >0.01),但在一定范围内波动,并随着稀释度的升 高,透光率(Tc值)上升.另外,在RBC稀释度为1:8 时,其凝集试验孔平均Tc值与非凝集试验孔平均Tc 值的相差值(Tcl—Tc2)最大.因此,将本次Rh—D试 验的待检血球浓度设定为1:8. 表1凝集和非凝集试验中浓度与透光率(Tc值)的关系 凝集类别(Tc值) RBC浓度 l:ll:2l:4l:8l:l6l:32 凝集试验孔平均Tcl55.167.289.192.898.198.9 非凝集试验孔平均Tc210.512.812.911.419.331.5 Tc1Tc244.654.476.281.478.867.4 2.试剂稀释度对Rh—D试验的影响:将Rh—D试 剂同样按1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64 做倍比稀释,用微孔板法和传统试管法分别检测48 份标本,其中已确认的Rh—D阴性标本1O份,Rh—D阳 性38份.结果显示,试剂稀释度在1:1,1:32时 两种方法均可正确检出相应标本,且结果完全相符, 检出符合率均为100%.试剂稀释度在1:64以后有 1份Rh—D阳性标本微判试验反应出现假阴性.根据 上述结果,本次试验将Rh试剂稀释度设定为1:16. 另外,对原倍试剂作一定的稀释可以防止Rh弱阳性 的漏检. 3.凝集反应,非凝集反应临界值的设定:随机抽 取8O份Rh阳性标本和1O份Rh阴性标本,按本次设 计试验方法进行检测.通过酶标仪比色后分别统计 Rh阳性标本和Rh阴性标本的透光率(Tc值),其各 项指标结果见表2.从表2中可以看出,如果Tc? 5O.5%即可判为Rh阳性,Tc?17.0%即可判为Rh 阴性.17%<Tc<50.5%判为可疑,需用试管法做确 认实验. 表2Rh-D阳性,阴性标本Tc值统计结果 4.溶血标本对本次试验的影响:为了研究溶血标 本对Rh试验的影响,将2O份人为造成的溶血标本采 用上述微板法进行检测.得出的透光率(Tc值)与采 用的正常标本得到的试验数据完全不符,出现Rh阳 性标本的透光率偏低,Rh阴性标本的透光率偏高等 现象.从而使溶血标本的Tc值多处于灰区,即在 17%<Tc<50.5%之间.酶标仪则不能有效,准确地 判断结果.因此可以认定,溶血标本对本试验方法有 极大影响. 5.本次试验方法的准确性:应用本方法对13800 份来自血液中心献血的标本进行RhD检测,共检出 Rh—D阴性72例.用原倍试剂,试管法复检,符合率 达100%.其中弱D阴性标本2例. 讨论 随着输血技术的发展,临床对Rh血型日趋重视. 目前Rh血型阴性者占我国汉族人群的0.2%, 0.5%F4.51.如何进一步提高Rh血型检验技术的准确 性,是目前必须面对的课题.为了解决这个问题,本 中心利用上述方法对大批量献血者的标本进行Rh阴 性血型初筛,实行了检验过程程序化,判读化,结 果数据化,有效地排除了人为干扰,处理9O人份标本 只需25min,极大地提高了工作效率.本方法技术要 点在于,使用高效率的自动化设备快速稀释标本,分 配血样,采用单克隆和多克隆抗D试剂并行的手段, 以保证弱D抗原的有效检出_5;使用统一的操作程 序,要求应用高效价,批间稳定的标准化试剂,并选择 最佳工作浓度,使其在适当稀释度下对较弱抗原产生 良好的凝集效果_6].根据本实验室的仪器确定Rh—D 阳性判读临界值(Tc值)为50.59/6.即Tc>50.5%判 为阳性;Rh—D阴性判读临界值(Tc值)为17.0%,即 Tc<17.0%判为阴性;灰区Tc值在17.0%,50.5% 之间(本文数据供参考).如果标本Tc值在此范围 内,需用试管法确认,同时要注意溶血标本对透光率 (Tc值)有较大影响.将此方法用于大批量标本的常 规筛查,目的在于能及时检出Rh阴性献血者,保留 和利用稀有血型.筛查所得结果以数据形式保留, 并通过计算机网络传送信息.本法与经典试管法相 比,对阴性结果的符合率为100%,与国外资料报道 同类组合式检测系统的准确率相同,基本杜绝了 假阴性错报. 参考文献 l吕鹏,主编.最新输血技术学.北京:人民卫生出版社, l994.395—397. 2中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作. 第2版.南京:东南大学出版社,1997.12. 3安万新,康纬.输血检验学.辽宁:大连出版社,2002.102一 l03. 4赵桐茂.人类血型遗传学.北京:科学技术出版社,l987. 103一l09. 5邵超鹏.RHD研究进展和中国人RHD研究现状.中 国输血杂志,2003,16(5):354—358. 6常缨,葛红卫.石家庄市及周边地区无偿献血者Rh血型筛 查分析.中国输血杂志,200l,14(6):379. 7JonesJ,ScottMI,VoakD.Monoclonalanti—Dspecificity andRhDstructure:criteriaforselectionofmonoclonalan— ti—Dreagentsforroutinetypingofpatientsanddonors. TransfusMed,l995,5(3):l7l—l84. (收稿日期:2004—08—3i) (本文编辑:张卡琳)