凝胶层析综述

凝胶层析技术的研究及应用 本文综述了凝胶层析的原理及其相关的参数和类型,以及在实际操作过程中的注意事项。并讲述了凝胶层析的一般应用。 凝胶层析( gel chromatography )又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤的等。它是以多孔性凝胶填料为固定相,按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱。 1959 年,Porath 和 Flodin 首次用一种多孔聚合物-交联葡聚糖凝胶作为柱填料,分离水溶液中不同分子量的样品,称为凝胶过滤。1964 年,Moore 制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶,能够进行有机溶剂中的分离,称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂)。随后这一技术得到不断的完善和发展,目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 1、凝胶层析原理、 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。 比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,经历的短,流动速度快,先流出;而较小的分子可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,最后流出;分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透,渗透的程度取决于它们分子的大小,所以它们流出的时间介于二者之间,分子越大的组分越先流出,分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后,各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出,从而达到了分离的目的。 2、凝胶层析相关系数、 2.1 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积,也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积,凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。 而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。 2.2 分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析,分配系数实质上示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 2.3 排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部,直接从凝胶颗粒外流出,它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量,大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。 2.4 分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围,对于分子量在这个范围内的分子,用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如 Sephadex G-75 对球形蛋白的分级分离范围为 3,000-70,000,它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过 Sephadex G-75 得到较好的分离。应注意,对于同一的凝胶,球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。 2.5 吸水率和床体积吸水率是指 1g 干的凝胶吸收水的体积或者重量,但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g 干的凝胶吸水后的最终体积。 2.6 凝胶颗粒大小层析用的凝胶一般都成球形,颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(m)来表示。颗粒大,流速快,但分离效果差;颗粒小,分离效果较好,但流速慢。 3、凝胶的类型、凝胶的种类很多,常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶(dextran)、聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide)、琼脂糖凝胶(agarose)以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。 3.1 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子-葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。 3.2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺(acrylamide)与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度,就可以得到不同交联度的产物。3.3.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖,它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由 D -半乳糖和 3,6 -脱水半乳糖交替构成的多糖链。它在 100 C 时呈液态,当温度降至 45° C 以下时,多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖,经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。 3.4 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。有较高分辨率,又有较高的机械稳定性,可以使用较高的洗脱速度 3.5 多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、 104 塔板×多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义,它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。。 4、实际操作时注意事项、 4.1 装柱时要注意凝胶的流速,不宜过快,同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀。 4.2 凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同,否则由于更换溶剂,凝胶体积会发生变化而影响分离效果。 4.3 样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大,但大分子物质的浓度大时,溶液的黏度也随之变大,会影响分离效果,要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好,加样量一般为柱床体积的 1%-2%,制备用量一般为柱床体积的 20%-30%。 5、凝胶的应用、 5.1 生物大分子的纯化凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的,由于它的这一分离特性,以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点,使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段,例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。 5.2 分子量测定在一定的范围内,各个组分的 Kav 以及 Ve 与其分子量的对数成线性关系。通过对已知分子量的标准物质进行洗脱,作出 Ve 或 Kav 对 分子量对数的标准曲线,在相同的条件下测定未知物的 Ve 或 Kav,通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单,所需样品量也较少,是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。但其测量结果的准确性却受很多因素影响。 5.3 脱盐及去除小分子杂质利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法,它比一般用透析的方法脱盐要快得多,而且一般不会造成样品较大的稀释,生物分子不易变性。 5.4 去热源物质热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质,所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质,凝胶层析是一种简单而有效的方法。 5.5 溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。 参考文献: [1] 严希康.生化分离技术[M].上海:华东理工大学出版社,1996.49-54 [3] 李建武等编.生物化学实验原理和方法[M].北京大学出版社.1994 [4] 刘国诠.生物工程下游技术[M].北京.化学工业出版社.2003 [5] 孙彦.生物分离工程[M].北京.化学工业出版社.2005 【6】白颖, 李建伟. 凝胶色谱法测定高聚物的平均分子量及分子量分布[J]. 塑料科技, 2007,(04) [2] 赵永芳.生物化学技术原理及其应用[M].2版,武汉:武汉大学出版社, 1994:113—146.