壳聚糖在关节软骨组织工程中应用的研究进展

壳聚糖在关节软骨组织中应用的研究进展 壳聚糖在关节软骨组织工程中应用的研究 进展 ? 88?临床骨科杂志JournalofClinicalOrthopaedics2007Feb;lO(I) 壳聚糖在关节软骨组织工程中应用的研究进展 Advancesofchitosaninarticularcartilagetissueengineering 赵广超综述,卜海富审校 ZHAOGuang—chao,BUHai-fu 关键词:壳聚糖;软骨,关节;组织工程Keywords:chitosan;cartilage,articular;tissueengineering 中圈分类号:R977.7;R318文献标识码:A文章编号:1008—0287(2007)01—0088一o4 关节软骨一旦被损伤,因其缺乏自 身血液循环系统,仅靠关节滑液提供大 部分营养.随着年龄的增长,软骨细胞 的合成能力下降,故关节软骨损伤后很 难修复.虽然40多年来许多修复技术 被广泛应用,但是至今还没有一种方法 可以让受损软骨持续再生,从而达到完 全修复的目的.组织工程的兴起在软骨 的再生以及受损软骨的治疗方面显示出 巨大的潜力….支架作为人工细 胞外基质承载种子细胞是组织工程研究 的重要内容之一.近年来,以壳聚糖为 支架的材料及其在矫形组织工程中的应 用正受到越来越多的关注.壳聚糖是一 种理想的高分子生物材料,它具有机体 反应小,天然抗菌性以及具有可任意塑 性如多孔结构的特点,使其能够适合细 胞的内在生长以及骨的传导,在组织工 程中显示出巨大的应用价值J. 1壳聚糖的特性 1.1理化特性壳聚糖为甲壳类动物, 昆虫以及其他无脊椎海洋动物外壳,真 菌的细胞壁中的甲壳素(B.1,4聚-2-乙 酰胺基-D一葡糖)脱乙醇化而制得,含有 p-l,4-2-乙酰胺基?D-葡糖和p-l,4-2-胺 基-D-葡糖的聚合物,后者一般占80%, 分子量为50一l000ku,是自然界中生 物合成量仅次于纤维素的少见的带正电 荷的碱性多糖,其化学性质不活泼.壳 作者单位:安徽医科大学第一附属医院骨科, 安徽合肥230022 作者简介:赵广超,男,硕士生,主要从事生物 力学,创伤,关节外科研究; b海富,男,教授,主任医师,硕士 生导师,通讯作者,主要从事生物 力学,刨伤,关节外科研究. 聚糖在体内溶菌酶,甲壳酶的作用下水 解成低聚糖,降解成对人体无害的N一乙 酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖,最终降解 成HO2和CO2. 壳聚糖为阳离子聚合物,具有可质 子化的氨基,它能与许多水溶性强的阳 离子聚合物如:藻酸钠,葡糖聚糖 (GAGS),糖蛋白,果胶等带负电的生物 活性物质作用生成聚电解质配合物 (PECS),因为壳聚糖电荷密度具有pn 值依赖性,所以这些配合体被转运到一 定的生理环境下导致壳聚糖固定的聚阴 离子的解离.这种性质可用于定位运送 活性聚阴离子如GAGS和DNAJ.壳 聚糖稳定的结晶结构使其不溶于一般溶 剂,在pH<6.3时由于氨基质子化丽溶 解,能与一些负离子相互作用形成交联 水凝胶,进一步的处理后,可以制成胶 膜,多孔支架以及微球等不同形态的制 品,使其符合临床上的需要. 1.2生物学活性近年来,随着人们对 壳聚糖的研究越来越深入,其作为组织 工程生物材料的生物学活性如:生物降 解性,生物相容性,可塑型性等逐渐为人 们所熟知. 1.2.1生物降解性壳聚糖在体内可 被溶菌酶水解,其酶切位点在N.乙酰氨 基葡糖胺残基.Sorbottenetal通过对 运用H-NMR光谱学分离不同分子量的 壳聚糖家族的低聚物研究发现,壳聚糖 是在胞外酶作用于其还原端而降解的. 壳聚糖的生物降解性由其脱乙酰化度 (DD)调控,DD越高生物降解性越高, DD越低生物降解性越低.Tomihataet alL6对甲壳素和壳聚糖薄膜在溶菌酶的 作用下,pH7,37?体外降解和体内鼠 背皮下植入物的降解研究结果表明,甲 壳素和DD73.3%的壳聚糖体内生物降 ? 综述? 解比DD68.8%的快得多. 1.2.2生物相容性免疫学的研究表 明,移植物的免疫原性主要是由表达组 织相容性抗原的细胞引起的,而细胞外 基质(ECMs)的抗原性极小,植入后避免 了排斥反应,具有良好的组织相容性和 亲和性.壳聚糖结构中的N一乙酰基葡 糖胺也存在于构成ECMs的透明质酸以 及GAGS中,这说明壳聚糖也具有与 GAGS和透明质酸相类似的生物活性. Maoetal研究发现,DD越高,细胞在 其上的黏附能力越强.已有许多学 者研究壳聚糖及其复合支架植入机 体后的排斥反应,研究显示,材料植入机 体后尽管有较多的嗜中性粒细胞聚集在 移植物区,但这些细胞很快就消失,材料 本身的炎症反应较小,不会引起慢性炎 症,也无大量纤维组织增生. 1.2.3可塑型性通过一些途径如相 分离,溶液浇注,纤维连接等方法,可将 壳聚糖制成不同的微观和宏观形状.目 前,已有支架,纤维,薄膜,微球等结构制 成.Zhangetal应用冻干燥技术制得 壳聚糖支架,并由相位分离加入B.磷酸 三钙(13-TcP)和磷酸钙转化玻璃对支架 进行再构建.对其显微结构,机械表现, 生物降解度,生物活性的研究显示.此复 合支架具有微孔结构且植入的2种材料 形成的孔径结构不同,压缩系数与抗压 力均有显着提高,而且还可以对其微结 构进行再造. 1.2.4其他活性壳聚糖分子链上的 - NH2基团活性很强,如对壳聚糖上的 - NH:和-OH:进行化学修饰以及采用壳 聚糖与其他高分子材料混合等方法可改 变其机械性能.N一乙酰化的壳聚糖降低 了溶解性并可在烷基链>5个碳的时候 形成胶束团簇,而硫酸化反应则赋予壳 临床骨科杂志JournalofClinicalOrthopaedics2007Feb;lO(1)?89? 聚糖阴离子特性和水溶性,同时获得凝 血性….另外,壳聚糖还具有抗菌,无 毒等生物活性. 2壳聚糖在软骨组织工程中的应用 2.1壳聚糖作为自体,异体软骨细胞的 载体Xuetall131研究发现,低强度的磷 酸钙水泥(CPC)支架在加入壳聚糖和水 溶性的D.甘露醇后当把混合物压缩成 为液体率为2时,其曲折力为(136? l.2)MPa,显着高于未加入壳聚糖的 CPC的(3.2.4-0.6)MPa.另外Xiaet al用冻干燥法制得壳聚糖/明胶复合 物支架.将从猪软骨分离的自体软骨细 胞种植在此复合支架上植入猪腹部皮下 组织,植入后l6周,此弹性软骨不仅保 持正常的组织学形态和生物化学特性, 还具有机械性能,软骨细胞在支架的间 隙中增殖与自体软骨相似.合成的弹性 纤维通过Vehoeff和免疫组化染色证实 了存在着?型胶原,另外GAGS的含量 达到了自体软骨的9o%,生物力学分析 植入软骨强度为自体软骨的85%. 组织培养时常常受到传质因素限 制,因为组织块内部的细胞得不到足够 的营养,其代谢废物也不能及时排出,常 致生长缓慢甚至死亡,形成组织"空化" 效应.经冻干技术制得的壳聚糖支架具 有三维立体结构,并且多孔类似海绵结 构,孔隙率在80%以上,从而具有很大 的内表面积,这样一方面有利于细胞的 植入,黏附,另一方面有利于细胞营养成 分的渗入与代谢产物的排出.Nettleset al用壳聚糖的溶液经冻干法制得其 立体多支架,然后将猪软骨细胞植入再 水合的这种壳聚糖支架上,放入旋转壁 式生物反应器中28d,细胞能很好地黏 附在支架上并能保持其圆形的形态学特 征,再经18d后,植入细胞的支架开始 合成细胞外基质,甲苯胺蓝着色和免疫 组化显示有GAGS及?型胶原生成. Shietal将制备的脱乙酰化88%溶解 于0.2mmol/L的醋酸溶液中的壳聚糖 与溶解于0.5mmol/L的醋酸溶液中的 高纯度的猪的?型胶原按4:l(wt/wt) 的比例混合,运用冻干法制得一种三维 复合支架,此种支架具有多孔类似海绵 状的结构,孔隙直径力100,250ttm. 再加入1.乙基.3碳化二亚胺(EDC)以 及N.羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联其结 构.当被交联后其抗张强度增加.植入 兔的皮下后,其在兔体内具有良好的生 物相容性以及可降解性.同时通过此种 复合支架的体外细胞联合培养,发现其 具有让软骨细胞在其上生长以及合成的 能力,并能维持软骨细胞的球面状表型 结构,免疫组化显示其能合成?型胶原. 另一些学者的研究也发现经壳聚 糖诱导连接等的修饰后,其他一些支架 材料如藻酸盐以及聚.L-乳酸(PUA)等 的表面更适合于软骨细胞的黏附,增殖 和更具活性.另外,形态学分析显示当 植入软骨细胞后,细胞可保持原有的圆 形形态,且合成的EMCs中有?型胶原 存在. 2.2壳聚糖可以控制细胞的增殖和生 长壳聚糖为天然高分子材料,其机械 性能较好,具有很好的细胞黏附性,而且 其本身就是细胞生长因子,可以控制细 胞的增殖和生长.Yamaneetal_l制成 一 种壳聚糖(c)/透明质酸(HA)的合成 聚合纤维(HA0.o4%,0.07%),再将 软骨细胞种植其上,结果发现软骨细胞 在增殖过程中除保持自身的三维形态外 还含有丰富的细胞外基质.Wanget al研究发现壳聚糖与羟基乙酸 (PGA)的复合物(PGA20%)具有较高 的机械强度和多孔率,种植在这种材料 上的成纤维细胞增殖良好,同时具有较 好的细胞沉淀率,显示壳聚/~/PGA复 合物具有很好的生物相容性能提供细胞 生长的环境.Hoemannetal_2设计了一 种壳聚糖溶液,明胶充填几分钟,将这种 壳聚糖明胶在体外分为含软骨细胞和不 含软骨细胞培养,然后植入裸鼠背部皮 下,对体内外软骨细胞的mRNA和蛋白 表达进行组织学集中分析,结果显示增 殖的软骨细胞的组织结构和组化,生化 以及机械性方面与体外软骨细胞在2% 琼脂糖中培养的相当.同时将这种复合 物注射进外科手术造成的兔关节软骨的 完全缺损ld后,以及骨关节软骨缺损l 周,结果这种复合物溶液在体内外生成 了软骨的细胞外基质.Hsuetal设计 了一种壳聚糖(C)/藻酸钠(A)/透明质 酸(HA)复合支架,其中C:A含量为l :l或l:2,HA占2%.复合物被设计 成薄膜状或纤维状支架,表面加入RGD (EMCs中的蛋白质纤维连接素的一部 分),将鼠的永生细胞(IRC)及兔来源的 关节软骨细胞种植其上,在体外植入兔 缺损的关节.组织相容性测试显示 RGD能使细胞黏附在c-A或c-A-HA复 合物进行增殖,复合物c.A.HAR(C:A =l:l并包含HA和R)的表现变化优 于另一种复合物,细胞在c-A和c-A- HA复合物保持原有的形态学特征,体 外实验显示cA.HAR复合物最适于3D 植入,高含量的黏多糖以及足够多的胶 原表明了细胞在其上生长良好.软骨支 架植入缺损的兔关节软骨1个月后 c.A.和c.A.HAR都出现了部分修复,6 个月后cA.HAR植入的缺损完全修复, 表明C.A.HAR是潜在软骨重建的组织 工程材料. 2.3壳聚糖负载生长因子众所周知, 生长因子可调节细胞的生长增殖和表型 表达,利于细胞的识别和黏附.因此,将 生物材料负载一定的生长因子,以便向 种子细胞持续定量地释放这种因子,有 利于细胞的识别黏附,生长调节和分化 增殖,壳聚糖在这方面的研究已有报道. Leeetal将含有l0ng的TGF.Bl壳聚 糖控释微球植入明胶/壳聚糖/葡糖聚糖 复合支架上,再将兔软骨细胞种植其上, 体外培养了3周,细胞的扩增率和 GAGS的生成都显着高于不含微球的复 合支架,番红木O和免疫组化染色显示 EMCs中含有的?型胶原含量明显提 高.Choetal_24将MSCs体外种植在壳 聚糖一PNIPAAM上,活化荧光细胞排序 分析,生存能力测试,细胞能很好地黏附 在其上增殖生长,且有X,I,?型胶原 生成. 2.4壳聚糖作为外源基因的载体最 新研究是将壳聚糖作为一种非病毒的基 因传递载体把外源性基因导入原始软骨 细胞中治疗关节疾病.通过一种凝聚法 将亲阳离子的pEGFP与壳聚糖合成制 得壳聚~/pEGFP毫微粒,在不同的pH 值转染介质,不同分子量的壳聚糖以及 不同的质粒剂量条件下转染原始软骨细 胞.FACS(荧光激活法)显示转染达到 很高的水平.此结果显示壳聚糖/DNA 临床骨科杂志JournalofClinicalOrthopaedics2007Feb;10(1) 毫微粒具有良好的将非病毒载体基因转 染软骨细胞的能力[251.Gaoetal将 从TGF.ssl中提取的质粒DNA编码导 入从壳聚糖和明胶中提取的二维和三维 的基质中,合成为一种具有基因活性的 基质(GAM),将这种基质与具有生物活 性和能分泌活性蛋白的原始软骨细胞体 外培养,然后植入兔的膝关节软骨缺损 处,结果证实缺损处有正常的软骨再生. 为软骨的缺损修复提供了一种便宜,简 单,有效的方法,揭示了关节疾病基因治 疗的前景. 软骨损伤修复的方法很多,如:磨削 成形术,软骨下骨钻孔技术,微骨折技 术,自体或异体软骨细胞植入技术 等,但实际应用中却存在着缺点和不 足.组织工程被认为是最有希望达到软 骨完全再生的方法.壳聚糖是一种资源 丰富,性能优良的生物材料,非常适合作 为软骨细胞的三维载体.目前其作为软 骨组织修复的体外体内研究非常多见, 已被证实有良好的应用价值和可行性. 尽管其作为支架材料力学强度仍有限, 降解速率与新组织的生成速率不匹配, 材料表面缺乏特异性等不足之处,但这 些都是可被解决的.同时伴随着其他相 关学科的发展,以壳聚糖为原料的复合 物开发的更多,也就更加促进了软骨修 复这一难题的解决. 参考文献: [2] [3] [4] SuhJK,MatthewHW.Applicationofch- itosan-basedpolysaccharidebiomaterials incartilagetissueengineering[J].Bioma— terials,2000,21(24):2589—2598. DiMartinoA,SittingerM,RsibudMV. Chitosan:Aversatilebiopolymerfor0r. thopaedictissueengneering[J].Biomate— rials,2005.26(30):5983—5990. MolinaroG,LerouxJC,DamasJ,eta1. Biocompatibilityofthermosensitivechi- tosan—basedhydrogels:Aninviveexperi- mentalapproachtoinjectablebiomaterials [J].Biomaterials,2002,23(13):2717 — 2722. RoyK,MaoHQ,HuangSK,eta1.O— ralgenedeliverywithchitosan??DNAn~fflo?- particlesgeneratesimmunologicprotection inamurinemodelofpeanutallergy[J]. NatMed.1999,5(4):387—391.[15] [5]SorbottenA,HornSJ,EijsinkVG,et a1.Degradationofchitosanswithchitinase BfromSerratiamarcescens.Productionof chito??oligosaccharidesandinsightintoen?? zymeprocessivity[J].FEBSJ,2005,272[16] (2):538—549. [6]TomihataK,IkadaY.Invitroandinvivo degradationoffilmsofchitinandits deacetylatedderivatives[J].Biomateri- als,1997,l8(7):567—575.[17] [7]MaoJS,CuiYL,WangXH,eta1.A preliminarystudyonchitosanandgelatin ployelectyolytecomplexcytocomptibility bycellcycleandapoptosisanalysis[J]. Biomaterials,2004,25(18):3973一[18] 3981. [8]ElicmYM,DixitV,LewK,eta1.Xeno transplantationoffetalporcinehapatocytes inratsusingatiusseengineeringapproach [J].ArtifOrgans,1999,23(2):146— 152. [9]VandevordPJ,MatthewHW,DesiwaS[19] P,eta1.Evaluationofthebiocompatibili. tyofachitosanscaffoldinmice[J].JBi. omodMaterRes,2002,59(3):585— 590. [10]ZhangY,ZhangM.Synthesisandchar-[20] acterizationofmacropronschitosan/calci— amphosphatecompositescaffoldsfortis— sueengineering[J].JBiomodMater Res,2001;55(3):304—312. [11]NishimuraSI,KaiH,ShinadaK,eta1.[21] Regioselectivesynthesisofsulfatedpoly— saccharides:specificanti—HIV一1activity ofnovelchitinsulfates[J].Carbohydrate Res,1998,306(3):427—433. [12]SubrrmanianA,LinHY,VuD,eta1.[22] Synthesisandevaluationofscaffoldspre. paredfromchitosanfibersforpotentialuse incartilagetiusseengineering[J].Bj. omedSciInstrum,2004.40:117—122 [13]XuHH,SimonCGJr.Fastsettingca1. ciumphosphale-chitosanscaffold:rile一[23] chanicalpropertiesandbiocompatibility [J].Biomaterials,2005,26(12):1337 一 l348. [14]XiaW,LiuW,CuiL.eta1.Tissueen- gineeringofcartilagewiththeuseofchi- tosan—gelationcomplexscaffolds[J].Bj一[24] omedMaterResBApplBiomater,2004, 71(2):373—380. NettlesDL,ElderSH,GilbertJA.Po- tentialuseofchitosanasacellscaffold materialforcartilagetissueengineering [J].TissueEng,2002,81(6):1009一 l0l6. ShiDH,CaiDZ,ZhouCR,eta1.De- velopmentandpotentialabiomimeticchi- toan/typeIIcollagenscaffoldforcartilage tissueengineering[J].ChinMedJ(En- d),2005,1l8(17):1436—1443. CuiYL,QiAD,LiuWG.Biomimetic surfacemodificationofpoly(L?lactic acid)withchitosananditseffectsonar- ticularchondrocytevitro[J].Biomate- rials,2003,24(21):3859—3868. 1wasakiN,YamaneST,M~imaT,et a1.Feasibilityofpolysaccharidehybrid materialsforscaffoldsincartilagetissue engineering:evaluationofchondrocytead- hesiontopolyioncomplexfibersprepared fromalginateandchitosan[J].Biomacro- molecules,2004,5(3):828—833. YamaneSJ,1wasakiN,M~imaT,eta1. Feasibilityofchitosan—basedhyaluronic acidhybridbiomaterialforanovelscaffold oncartilagetissueengineering[J].Bio- materials,2005.26(6):611—619. WangYC,LinMC,WangDM,eta1. FahricationofanovelPGA.chitosstnhy. bridmatrixfortissueengineering[J]. Biomaterials,2003,24(6):1047— 1057. HoemannCD,SunJ,LegareA,eta1. Tissueengineeringofcartilageusingan injectableandadhesivechitosan.based cell-deliveryvehicle[J].Ostearthritis Cartilage,2005,13(4):318—329. HsuSH,WhuSW,HsiehSC,eta1. Evaluationofchitosan—alginate—hyalur- onatecomplexesmodifiedbyanRGD—con. tainingproteinastissue—engineeringscar- foldsforcartilageregeneration[J].Artif Organs,2004;28(8):693—703. LeeJE,KimKE,KwonIC,eta1. Effectsofthecontrollod.releasodTGF-be. talfromchitosanmicrospheresonchon. drocytescuhuredincollagen/chitosan/gly- cosaminoglycanscaffold[J].Biomateri. als,2004,25(18):4163—4173. ChoJH,KimSH,ParkKD.Chondro. genicdifferentiationofhumanmesenchy- realstemceHsusingathermosensitivepo- 临'#骨斟杂志JtJh'rltll/e/rIlmJ411)rrvr/2007…-:10 I:\iI|T…ll?nI…?i.If……ldh1?'…lR?l.2LX)6.II2I2l:223一:2827P池 ?IlI.1lit…1?.I1:,—rJIll(??1.1I川"T.1\.1J,…I【.1.cl|?ill= I,if)4.2526r:57.=3jlT,ille.Ill1.AiticI…JIr.Ht'1-: ZIl-,,I,1;.lIfI?1.1Il'utn~一:…li1?】IiI?lJAIfL)nl_.【H161q "lIm?"11["11}『,?h-…tj一,h,IT"l_1t:6^12^I -iii-l】?-卜1II-l……IIIJL1JrllI— 肘关节前侧入路治疗肱骨小头l型骨折 AnteriorapproachIelbowioinlforthetreatmen10fcapitellumfra~'ture .了寸.臣l码茹I.壕如 {|\lh,,I,1)I,ij{}一i}.h,,iI_}1m一}}.t/H,'t…-…trG, 芙键词:'.一;川;L-J.I91f1.K'.~ards 中匪分类号:II{?;f{6974文赫标识码:l1文章编号:?l一 f】?【】5II-2(X~65JJ琶 I1Jq是竹前00^rJ1K舒小,I阿 折忠rIvi.6削.报通f【_=】下 材料与方法 II病例资料4,m6恻,4恻.女2 例,年龄I3—20删2.侧4 削均为闱台性骨折后均有驸关节 仲胀.屈盈隈.x线驶s(T检查均提】 啦骨小女冠献丽骨折伴滑芈骨折,刘泣 I蹙『'j下求_lJ删3—7 2治疗方法f:L赴止Il苛 生1tlj)【约^??J,"I睁:f 芙转?j把圳叫 ,?l厶n??}_3j 方法与应用? 『-l'fui.elI'r"'iI11Iiiii)IIllI]1'_l】':rIIl-?i?…Ill1]111.lI…?】_1I~lil'j2r| 7I2CK17II}IIM1qIII2 111|』臂圳'例.lI1-;.rl川一Iii【0l_ 州s.1睦幢.f;总f,抒离侥{l.I静Hl 量婴静脉搏?量一ilILq~L雌闻侧幸{. 肌.卅啦?L纤维外饨r蔓计离行 向讣轻拉11艟冀聪r剥离..?n簖d 艾曲戈挺艘裂的戈婕. 清rf_鲁*竹FL]Jn【l童垌小的无血运的 胃脾块.口fI可露吐同.,J,头骨折J鱼.消埋 时沣意保护骨折蚨附荷的芙鞋J立辜}=? I,临肟l芰址嚏头肌挫驰,有利于 觅舒暴野幸|.足幢.封指irl~;l 嚏忖rri;~!iOlJ;Il而下准折随jL 剐砭忙牡川k拇指定.然_上11f『…I j=j也0『彳L刚椿头器F孔.打I 一 砬I.地k蝉?,挥JlI}f轼 埘卜.L,'JI旅辩II'll衄小ii'ij扯 觅J?洗援豫出jI流.lI旨拔 际】l"竹I能.1tl; go)竹托仆.-3j服『l『f 45定l削.懿0"l}ff…ii,苞l川 5x线梳骨蹰'l-K1即一拆 除膏托.fr肘关节敞曲话划 2结果 O洲也抟lrlnl曹,忡妤 皤.1l,北均I【J刊 3啦【b1,lJ,5.^倒均 目愈,'II4,^二一阳】垃时r 圈,术后,线正,侧位片示:左肱骨小头已解剖复位图4术后2个月复查正恻位片示: 骨折对位好,骨折线消生,己选骨性愈合 吼什:幢.坼I75I,H:}.掉州j6c11 '自?兽.."lt-::ffP~E掣lu,剖怔竹f蝌