当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选的研究（可编辑）

当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选的研究（可编辑） 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛 选的研究 甘肃中医学院 硕士学位论文 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 姓名:洪秋菊 申请学位级别:硕士 专业:中药学 指导教师:任远 2011-06 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 中 文 摘 要 目的 1通过动物离体平滑肌实验测试系统,观察当归挥发油对兔十二指肠平 滑肌的 作用,并对其作用机制进行探讨;2以正交设计法研究分析当归挥发油不同 组分对兔十 二指肠平滑肌的作用及交互影响,对当归挥发油影响兔十二指肠平滑肌的药 效物质基础 进行研究。 用生物机能信号采集放大系统、生物张力传感器和离体平滑肌灌流装置组建离体平 滑肌实验测试分析系统,研究分析:1 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌自主收缩的影 响;2 当归挥发油对 Ach 诱导兔十二指肠平滑肌收缩的影响;3 当归挥发油对 CaCl2 诱导兔十二指肠平滑肌收缩的影响;4 当归挥发油对高钾诱导细胞去极化致十二指肠 平滑肌张力变化的影响;5 当归挥发油对平滑肌收缩过程细胞内 Ca2+释放的影响;6 当归挥发油对十二指肠平滑肌收缩过程细胞外 Ca2+内流的影响。通过上述指标就当归挥 发油对兔十二指肠平滑肌的作用进行研究,并对其作用机制进行初步探讨。 采用酸碱萃取法,对当归挥发油的不同组分进行分离,按当归挥发油中各组分含量 比,采用 L827正交设计,通过离体平滑肌实验测试分析系统观察当归挥发油不同组分 对兔十二指肠平滑肌自主收缩和 Ach 诱导十二指肠平滑肌收缩的影响,对各组分之间的 交互作用进行分析,对当归挥发油影响兔十二指肠平滑肌作用的物质基础进行研究。 结果 当归挥发油对兔离体十二指肠平滑肌自主收缩具有明显抑制作用,可浓度依赖性压 低收缩张力,在 1.1×10-6 ~ 1.1×10-4 g?mL-1 浓度范围内呈明显的量效关系;当归挥发油 对 Ach 诱导兔离体十二指肠平滑肌收缩具有明显抑制作用,可浓度依赖性压低兔离体十 二指肠收缩张力,呈明显的量效关系,3.5×10-5 g?mL-1 浓度的当归挥发油与 1.0×10-8 mol?L-1 的硫酸阿托品作用相当;当归挥发油对无钙条件下 Ca2+诱导的兔十二指肠平滑肌 收缩过程具有明显抑制作用,可浓度依赖性压低收缩张力,3.5×10-5 g?mL-1 浓度的当归 挥发油与 1.0×10-6 mol?L-1 的盐酸维拉帕米作用相当;当归挥发油对无钙条件下 Ach 诱导 的十二指肠平滑肌的收缩以及 Ach诱导内钙释放基础上 CaCl2 导致的十二指肠平滑肌收 缩呈现明显拮抗作用,3.5×10-5 g?mL-1 浓度当归挥发油作用明显强于 1.0×10-7 mol?L-1 的 盐酸维拉帕米;当归挥发油对高钾去极化诱导的兔十二指肠平滑肌收缩具有明显抑制作 1 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 用,可浓度依赖性压低收缩张力,呈明显的量效关系,3.5×10-5 g?mL-1 浓度当归挥发油 作用明显强于 1.0×10-7 mol?L-1 的盐酸维拉帕米。 以 L82 7正交设计分析当归挥发油各组分对兔十二指肠平滑肌的影响,结果显示, 中性非酚性组分A3是抑制兔十二指肠平滑肌收缩的主要因素,且作用与总挥发油AN 相当;酸性组分A1、酚性组分A2和 A3 对兔离体十二指肠平滑肌的作用无明显交互影 响。 A1、A2、A3 各组分以 1:1:1 比例加药,对各组分影响平滑肌的绝对作用强度进 行分析。结果显示当归挥发油 A1、A2、A3 各组分对兔十二指肠平滑肌收缩均有明显抑 制作用,其中以 A3 作用较显著,但各组分之间差异无统计学意义。 结论 1当归挥发油对兔离体十二指肠平滑肌自主收缩和 Ach诱导兔离体十二指肠收缩具 有明显抑制作用;该作用可能与阻滞受体控制型钙通道ROCC或电压依赖性钙通道 VDCC、影响兔十二指肠平滑肌收缩过程中细胞外 Ca2+内流和细胞内 Ca2+释放过程有 关。 2当归挥发油 A1、A2、A3 对兔离体十二指肠平滑肌均具有明显抑制作用, 各组分 之间的作用强度无明显差异;当归挥发油中以 A3 含量最高,占 72.4%, A3 是当归挥发 油发挥对兔离体十二指肠平滑肌抑制作用的主要因素;对兔离体十二指肠平 滑肌的作用 A1、A2、A3 各组分之间无交互影响。 关键词 当归挥发油;离体十二指肠平滑肌;作用机制;有效组分 2 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 ABSTRACT Objectives To study the effects of Angelica NaphthaAN on rabbit duodenal smooth muscle by biological signal acquisition system and explore its mechanism or the role of law of action. And to study the effects of different components in AN on isolated duodenal smooth muscle in rabbits and discuss whether there is interaction among the different components by orthogonal design; And effective group were screened. Methods Biological signal acquisition system, tension sensor and muscle perfusion system were installed in test systems, we can do: How AN effect spontaneous contraction of rabbit duodenal smooth muscle, How AN effect spontaneous contraction of rabbit duodenal smooth muscle by Ach or CaCl2 or KCl, AN can changes intestinal smooth muscle contraction during intracellular calcium or extracellular calcium influx on intestinal smooth muscle. Wish to discuss its possible mechanism. By acid-alkali extraction, we can get active components in Angelica naphtha by orthogonal design, analys is the effect of the different components in AN on the rabbit duodenal smooth muscle induced by voluntary movement and Ach movement of duodenal smooth muscle contraction, and the interaction between the various groups were analyzed. Results AN had significantly inhibited on the rabbit isolated duodenum smooth muscle contraction, in 1.1 × 10-6 ~ 1.1 × 10-4 dose range was apparent dose-effect relationship. AN can significantly inhibit on the isolated rabbit duodenum contraction of smooth muscle by acetylcholine- induced or alcium- induced, showing a clear dose-effect relationship, 3.5 × 10-5g -1 of non-competitive antagonism. In the non-calcium environment, AN has significantly antagonist for duodenum smooth muscle by Ach, and was inhibite in the Ca2 + induced a significant of smooth muscle contraction, verapamil inhibited the contraction of the isolated rabbit duodenum induced by high K+ depolarization in a dose-dependent manner, and they also decreased the imal responses. 3 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 According to AN by the oil mass ratio of each component, to the orthogonal design and analysis of the three active components effects are different of the rabbit duodenal smooth muscle showed that A3 components can significantly inhabit rabbit duodenal smooth muscle main factors, and the role of the total oil AN rather, A1、A2、A3 components had no significant effect interaction on the rabbits smooth muscle. Conclusions AN obviously inhibited contraction on isolated rabbit duodenal smooth muscle by Ach or not, the effect concerned with inhibiting the Receptor-Operating Calcium Channels ROCC or Voltage-Dependent Calcium ChannelsVDCC 、 and extracellular Ca2+ influx and intracellular Ca2 + release processes on the rabbit duodenum smooth muscle. A1、A2、A3 significantly inhibited on isolated rabbit duodenal smooth muscle, and its effect was no significant difference; But A3 is the highest levels, A1 and A2 is liittle in AN, A3 is to play the major factors inhibit in AN on the isolated rabbit duodenal smooth muscle; A1、 A2、A3 were no interaction between the components on the rabbit duodenal smooth muscle. KEY WORDS Angelica Naphtha; Duodenal smooth muscle;Mechanism of action;Effective components 4 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 缩 略 词 表 缩写 AN A1 A2 A3 Ach Atr Ver 英文全称 Angelica naphtha Angelica naphtha ? Angelica naphtha ? Angelica naphtha ? Acetylcholine Atropine Sulfate Verapamil Hydrochloride 中文全称 当归挥发油 当归挥发油酸性部位 当归挥发油酚性部位 当归挥发油中性非酚性部位 乙酰胆碱 硫酸阿托品 盐酸维拉帕米 GC-MS LIG NMR SCF-CO2 SD VDCC ROCC HPLC Gas chromatography- mass spectrography Ligustilide Nuclear magnetic resonance Supercritical CO2 fluid extraction Steam distillation Voltage-depended calcium channel Receptor-operating calcium channels High performance Liquid Chromatography 5 气相色谱-质谱 藁本内酯 核磁共振 超临界 CO2 萃取 水蒸气蒸馏 电压依赖性钙通道 受体控制性钙通道 高效液相色谱法 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、 观点等,均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外,不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本研究做出贡献的个人 和集体均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 论文作者签名: 签字日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权 本学位论文作者完全了解甘肃中医学院有关保留、使用学位论文的规 定,本人同意学院保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子 版,允许论文被查阅和借阅。本人授权甘肃中医学院可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存、汇 编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 签字日期: 年 年 月 月 日 日 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 前 言 当归为伞形科Umbelliferae植物当归 Angelica sinensis Oliv. Diels 的干燥根,主产 于我国甘肃、四川、陕西、云南等省,越南、日本、朝鲜等国也有栽培。当归味甘、辛, 性温,入肝、心、脾经,具有补血活血,调经止痛等功效。《神农本草经》记载当归“味 甘温。主咳逆上气,温虐,寒热,洗在皮肤中。妇人漏下绝子,诸恶创疡金创”。《景岳 全书-本草正》曰:“当归,其味甘而重,故专能补血;其气轻而辛,故又能行血,补中 有动,行中有补,诚血中之气药,亦血中之圣药也”。中医认为当归为血家之圣药,具 有补血活血、调经止痛、润燥滑肠、生肌健骨的功用,在临床治疗许多疾病时有不可替 代的作用。 现代研究结果表明,当归含有阿魏酸、藁本内酯、正丁基芙内酯、对-甲基苯甲醇、 腺嘌呤、胆碱、谷甾醇、蔗糖、葡萄糖、维生素、钠、钾、钙、镁以及多种氨基酸等多 种成分,具有促进机体造血机能、改善心血管功能、调节免疫系统、保护组织缺血再灌 注损伤、肝损伤、调节血糖、抗氧化、抗幅射损伤、镇痛抗炎、抗肿瘤等广 泛的药理作 用。当归挥发油是当归中的主要有效组分,研究文献报道当归挥发油对子宫平滑肌、支 气管平滑肌和血管平滑肌具有明显抑制作用,但未见当归对胃肠平滑肌作用的研究文献 报道。我们推测当归挥发油可能具有广泛的平滑肌松弛效应,基于此工作假说,我们通 过动物试验对当归挥发油在胃肠道平滑肌方面的影响进行了初步研究,研究结果显示当 归挥发油对小鼠胃、肠平滑肌均具有明显舒张作用。 本课主要以生物机能信号采集实验仪、生物张力传感器和离体平滑肌灌流实验装 置组建动物离体器官实验分析系统,以兔十二指肠平滑肌为研究对象,建立多种因素诱 导的平滑肌收缩运动模型,就当归挥发油对十二指肠平滑肌的影响及其作用规律进行研 究,并对其作用机理进行初步探讨。在此基础上通过化学方法对当归挥发油进行组分分 离,并采用正交设计分析方法,以兔十二指肠平滑肌自主收缩和 Ach 诱导收缩两种模型 对各组分的作用及其交互影响进行了分析研究。目的是明确当归挥发油对兔十二指肠平 滑肌的影响及作用规律,研究了当归挥发油各组分对兔十二指肠平滑肌的物质基础及作 用特点,为进一步开发当归在治疗胃肠道痉挛性疾病方面的潜在药用价值和临床应用提 供试验依据。 6 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 立 题 依 据 文献资料显示国内外对当归及其挥发油已进行了大量的研究。在当归挥发油的研究 方面则主要集中在对子宫和支气管平滑肌方面。根据当归挥发油对子宫平滑肌、支气管 平滑肌的研究结果,我们推测当归挥发油可能具有较为广泛的平滑肌松弛效应。基于此 工作假说,我们对当归挥发油在胃肠道平滑肌方面的影响进行了初步试验研究,初步试 验结果显示当归挥发油对兔离体胃底、胃体、十二指肠、空肠和回肠平滑肌均具有舒张 作用[82],本课题研究内容主要采用动物离体平滑肌实验研究系统,以兔十二指肠平滑肌 为研究对象,建立多种因素诱导的平滑肌收缩运动模型,就当归挥发油对十二指肠平滑 肌的影响及其作用规律进行研究,并对其作用机理进行初步探讨。在此基础上,拟通过 化学方法对当归挥发油进行组分分离,并采用正交设计分析方法,以兔十二指肠平滑肌 自主收缩和 Ach 诱导收缩两种模型对各组分的作用进行了研究,试图明确当归挥发油对 平滑肌作用的药效物质基础。为进一步开发当归挥发油的药用价值和其临床应用提供试 验依据。 当归为伞形科Umbelliferae植物当归 Angelica sinensis Oliv. Diels 的干燥根,具有 补血活血,调经止痛,润肠通便的功效。用于治疗血虚萎黄,眩晕心悸,月经不调,经 闭痛经,虚寒腹痛,肠燥便秘,风湿痹痛,跌扑损伤,痈疽疮疡[1]。当归产地分布较广, 国内以甘肃、四川、陕西、云南等省为主产区,越南、日本、朝鲜等国也有栽培。早在 1500 年前,当归就在宕昌、岷县一带训为家种。《本草纲目》记载,“当归生陇西川谷四 阳五阳今漳县、岷阳今岷县、首阳今渭源、洮阳今临洮”。后来我国一些其它省和地区 相继种植,主要产于甘肃与四川边界的岷山山地。甘肃中部当归主要产于定 西地区的漳 县、岷县、渭源以及临洮、陇西等县,其中岷县、漳县各乡均产,渭源南部的 13 乡、 临洮南部的 8 乡、陇西南部的 4 乡为全国当归重点产区之一和生产基地,约占全国产量 的 70%和全省产量的 80%。其中以岷县产量较多,品质最佳习称“岷归” [2] 。 当归历代被尊为活血、养血,治血病之要药,俗语有“十方九归”之说。历代名家 对其都有评述。《神农本草经》记载,当归,主咳逆上气;温疟寒热洗洗在皮肤中;妇 人漏下绝子;诸恶疮疡、金疮,煮饮之。《证类本草》记载,主咳逆上气,温疟寒热洗 洗在皮肤中,妇人漏下,绝子,诸恶疮痒,金疮,煮饮之。温中止痛,除客血内塞,汗 不出,湿痹,中恶,客气虚冷,补五脏,生肌肉。《本草求真》记载:当归,辛甘温润。 诸书载为入心生血上品。当归气味辛甘,既不虑其过散,复不虑其过缓,得其温中之润, 7 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 阴中之阳,故能通心而血生,号为血中气药。故凡一切血症阴虚。阳无所附。而见血枯 血燥血闭血脱等症。则当此主治。是以气逆而见咳逆上气者,则当用此以和血,血和而 气则降矣;寒郁而见疟痢腰腹痛者,则当用此以散寒,寒散而血则和矣;它如疮疡痈疽, 而见痛苦异常;肌肉失养,而见皮肤不润;并冲脉为病,而见气逆里急;带脉为病,而 见腹痛,腰如坐水。亦何莫不因血虚气无所附之意。得此则排脓痛止,痈消毒去,肤泽 皮润,而无枯槁不荣之患矣。陆明等[3]认为当归能养心,具有除热散湿、消风洗癣、美 容驻颜的作用,古今在临床上应用广泛。如李东垣《兰室秘藏》的朱砂安神丸,《摄生 秘剖》的补心丹,《医宗金鉴》方龙胆泻肝汤,《室明论》中的当归龙荟丸,《外科正宗》 的消风散。李国青等[4]认为,当归主咳逆上气是由于其有和血之功,血和气自降。气之 与血,气为血之帅,血为气之母;气以行血,血以载气。气的运行与敷布有赖于血的运 载。气病可及血,血病亦可及气,故血病亦致气机逆乱,升降出入失其常度,而为咳逆 上气。如《和剂局方》的苏子降气汤在治下虚上实挟痰的咳喘气促之中除用苏子、半夏、 前胡、厚朴降气平喘,祛痰止咳,肉桂温肾纳气外,配伍当归即取其行血通脉,养血润 燥之功。另如《医学入门》在治产后瘀血之咳嗽气喘用加味益母丸,以当归配益母草、 赤芍、木香等活血化瘀,行气通滞。 1 当归现代研究概况 1.1 当归的化学成分 当归的主要化学成分包括挥发油和水溶性成分,主要有藁本内酯类及其异构物、香 豆素类、黄酮类以及有机酸类等。王海燕等[5]从当归根乙醇提取物中分离到 6 个化合物, 鉴定为E-藁本内酯,Z-藁本内酯,Z-正丁烯基呋内酯,棕榈酸,?-谷甾醇和阿魏酸。 化合物E-藁本内酯首次从该植物中分离得到。胡长鹰等[6]从甘肃岷县所产的当归中分 离鉴别出 6 个化合物,分别为 Z-butyli-denephthalide、Z- LIG、8,11-二羟基-藁本内酯、 2,7-羟基-?本内酯、9-丁烯基苯酞、senkyunolide H。路新华等[7]用乙醇提取当归根, 醇提物经色谱分离及波谱鉴定了 8 个藁本内酯二聚体,分别为 levistolide A、川芎酽内 酯 O、3Z,3Z'-6?8',7?3'-双藁本内酯、Tokinolide B、Isotokinolide B、当归双藁本内酯 A、E,E'-3?3', 8?8'-双藁本内酯和当归双藁本内酯 BE,E'-3?3',8?8'-异双藁本内酯。 杨帆等[8]采用高效液相色谱-质谱联用的方法对当归中的化学成分进行研究,分别为阿魏 酸、洋川芎内酯 H 及 I、阿魏酸松柏醇酯、洋川芎内酯 A、丁基苯酞、E-藁本内酯、Z- 藁本内酯、E-丁烯基苯酞及 Z-丁烯基苯酞,以及一个未知的苯酞二聚物的衍生物。刘国 8 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 生等[9]从当归中分离出棕榈酸、邻苯二甲酸、香荆芥酚、当归酮、正丁烯基苯酞内酯等 化合物。S.C. Lao 等[10]采用加压溶剂法提取当归根,提取物经气质联用鉴定了 13 个化 合物,分别为:阿魏酸、Z-藁本内酯、E-藁本内酯、Z-丁烯基酞内酯、E-丁烯基酞内酯、 3-丁苯酞、3-亚丁基-4-羟基苯酞、川芎内酯 A、6,7-环氧藁本内酯、川芎内酯 F、川芎 内酯 H、川芎内酯 I、6,7-二羟基藁本内酯。路新华等[11]从当归根的乙醇 提取物中分离 5 个化合物,经波谱法鉴定其结构均为藁本内酯类化合物:Z-藁本内酯,Z-6,7-环氧藁 本内酯,Z-6,7-反式-二羟基藁本内酯,E-6,7-反式-二羟基藁本内酯以及当归酸 Z-藁 本内酯-11-醇酯,其中当归酸Z-藁本内酯-11-醇酯首次从该植物中分离。蒋伟等[12]从甘 肃省渭源县采的当归根用水提取,分离 9 个化合物,分别为反式阿魏酸,顺式阿魏酸, 川芎内酯 I,布雷菌素 A,五加苷 B1,E-松柏苷,愈创木基丙三醇,淫羊藿次苷 F2,马 鞭草烯酮-5-O-?-D-葡萄糖苷。黄伟晖等[13]将当归根的提取物,应用色谱纯化分离,用紫 外、红外、核磁共振等光谱方法鉴定了 5 个化合物,分别为 Homosenkyunolide H, Homosenkyunolide I,新藁本内酯,6-甲氧基香豆素,次黄苷。刘倩等[14]采用固相微萃 取SPME法萃取富集当归的挥发性有机物,对不同极性的萃取纤维上富集的物质进行 GC-MS 分析,得出相对含量最高的成分有 a-蒎烯和藁本内酯,其次有 3,7-二甲基-1, 3, 6-辛三烯、6-丁基-1,4-环庚烯、6-十一酮、柠檬烯氧化物、?-榄香烯及 1-乙烯基-1- 甲基-2-1-甲基乙烯基-4-1-甲基亚乙烯基-环己烷。宋萍萍等[15]采用硅胶柱层析进行分 离纯化,利用现代波谱技术进行结构鉴定;从大叶当归中首次分离,鉴定得到 1 个简单 香豆素当归醇。何先元等[16]采用超声提取当归多糖,以苯酚-硫酸法测定其含量。得出 当归中多糖含量为 12.45%。邢福等[17]采用分光光度法,测试结果表明:当归中含丰富 的微量金属元素,其中 Fe 元素含量较其它元素高,高达 229.15 mg?kg-1,Zn 元素为 77.54 mg?kg-1,Cu 元素为 35.41 mg?kg-1。 1.2 当归的药理研究 1.2.1 当归对血液系统的作用 张雁等[18]采用外周血白细胞WBC、红细胞RBC、血小板PLT及小鼠骨髓有核细 胞数BMNC计数;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法 MTT和流式细胞术测定当归多 糖对放射损伤小鼠骨髓细胞增殖活性和 Sca-1+BMNC 粘附分子 CD44 和 CD49d 表达、 BMNC 细胞周期的影响。研究结果表明,与正常组比较,各生理盐水组外周血 WBC、 RBC、PLT 及 BMNC 计数明显减少,Sca-1+BMNC CD44、CD49d 表达、骨髓细胞增殖 9 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 活性明显下降,BMNC G0/G1 期细胞比例显著增加;提示当归多糖对放射损伤小鼠造血 功能具有修复作用。王改琴等[19]研究 APS,表明当归多糖能降低其表面黏附分子 ICAM-1 和 VCAM-1 的表达,促进小鼠骨髓基质细胞BMSCs增殖,使小鼠 BMSCs 达 80%贴壁 后消化时间明显缩短,对骨髓单个核细胞的黏附率减弱。张雁等[20]采用流式细胞术和 MTT 法,研究表明 APS 能降低骨髓的 CD49d 和 CD44 及外周血的 CD49d 的表达,且 体内外作用均能降低骨髓和外周血单个核细胞对纤维连接蛋白的黏附率。李静等[21]采用 骨髓造血祖细胞和巨噬细胞体外培养等技术,得出 APS 可以直接和或间接地刺激造血 诱导微环境中的骨髓巨噬细胞,从基因水平和蛋白水平上促进造血调控因子的合成和分 泌,进而促进晚期红系祖细胞CFU-E、髓系多向性造血祖细胞CFU-Mix、粒单系造血 祖细胞CFU-GM的增殖分化。胡晶等[22]通过实验表明:APS 对小鼠外周血造血干细胞 有一定的动员作用,并且 APS 和重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF联合动员的效果 好于单用 APS 或单用 rhG-CSF 的动员效果。 当归中的阿魏酸[23]与当归多糖[24]能够抑制血小板聚集、抗凝血[25]。 当归能改善外周循环,减少血管阻力,增加股动脉血流量,增加外周血流量,改善 局部微循环,扩张皮肤血管。其扩张血管的作用与 a 或 ?受体无关,而与 M-受体及组 织胺 H1-受体兴奋有关[26]。当归能改善脑循环,对急性脑缺血、缺氧有保护作用,其作 用的物质基础可能为丁基苯酞。 1.2.2 抗肿瘤作用 Cao Wei 等[27]应用 MTT 法测试分子量为 5.1 KDa 的单糖类化合物的在 100 mg?kg-1 时抑制率可达 50.7%。曹蔚等[28-29]将当归粗多糖经阴离子交换纤维素柱、凝胶柱色谱分 离纯化,得白色絮状多糖 APS-2a 和淡黄色粉末状多糖 APS-3c。表明在 20、50 mg?kg-1 的剂量里多糖 APS-2a 对肉瘤 S-180 荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用并明显促进荷瘤小鼠 的胸腺指数和脾脏指数的增加;APS-3c 对人白血病 HL-60 细胞、人结肠癌 SW1116 细 胞的增殖有一定的抑制作用。 1.2.3 镇痛作用 乐江等[30]采用醋酸诱导以及己烯雌酚和缩宫素诱发雌性小鼠子宫痉挛,通过测扭体 次数进行研究。实验表明:当归粗多糖显著抑制醋酸所致小鼠扭体反应以及提高热板法 所致小鼠痛觉反应的痛阈,作用强度与剂量有关;当剂量为 0.075 g?kg-1 和 0.25 g?kg-1 时, 可明显减少己烯雌酚和缩宫素引起痛经模型中诱发的小鼠扭体反应次数,延长扭体反应 潜伏期,大剂量显著降低扭体发生率。 10 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 1.2.4 对免疫系统的作用 当归对辐射损伤后的卵巢组织一方面具有保护作用,另一方面能促进卵泡细胞的增 殖和分化[31]。当归能增强单核吞噬细胞系统的廓清功能,增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能, 促进红细胞粘附功能,保护机体免受由环磷酰胺所诱导的突变,对细胞的再生以及染色 体的修复有促进作用[32]。俞发[33]研究得出:当归多糖可显著改善免疫性肝损伤小鼠的胸 腺、肝脏、脾脏系数p0.05;降低血清中丙氨酸氨基转移酶ALT、门冬酸氨基转移酶 AST、总胆红素TB、NO 的含量p0.05以及肝组织匀浆中肿瘤坏死因子 aTNF-a、 白介素 1?IL-1?和干扰素 ?IFN-?的含量 p0.05;提示 APS 对免疫性肝损伤具有显 著的保护作用。 1.2.5 抗氧化作用 龙锐等[34]采用体外实验得出:当归内酯对 1-1-二苯基苦基苯肼自由基DPPH?和?OH 具有良好的清除作用;剂量在 1、4、16 mg?mL-1 的当归内酯对亚油酸的自发氧化和 H2O2 诱导的红细胞氧化溶血均表现出一定的抑制作用,且呈一定的量效关系。Song Zhang 等 [35] 研究表明经当归多糖治疗能明显减少心肌梗死面积,其显著地增大血清中的过氧化氢 酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,呈剂量依赖性;说明当归多糖能够 抑制缺血再灌注诱发的心肌损伤,具有抗氧化作用。南通大学的研究人员[36] 采用双侧颈 动脉夹闭 30 min 造成 ICR 小鼠短暂性前脑缺血模型,腹腔注射 5 mg?kg-1 和 20 mg?kg-1 的?本内酯,氯化四唑染色标记的方法,24 h 后脑缺血梗死面积明显低于单纯缺血再灌 对照组;组织中超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽还原酶-PX GSH-PX水平上升,丙二 醛MDA水平降低, 抗细胞凋亡蛋白anti-apoptotic protein, Bcl-2表达增多、Bax 和 caspase-3 表达降低;结果表明藁本内酯可以通过减轻氧化应激和抗细胞凋亡,从而保护 缺血再灌注的脑损伤。侯永忠等[37] 对川芎和当归按照质量比 1:1的混合物进行处理 获得藁本类提取物,采用 H2O2 处理 ECV304 细胞建立氧化损伤模型;发现所得提取物 可以剂量依赖性地增多 SOD、GSH-PX、触酶CAT,减少活性氧簇ROS的生成;p-ERK 和内皮源性eNOS表达增多,上述结果表明,当归属中的藁本类可以通过增强抗氧化能 力、激活 ERK 和 eNOS 信号通路,减轻缺氧损伤,从而起到保护细胞的作用。 1.2.6 对呼吸系统的作用 谢文利等[38] 观察?本内酯对枸橼酸及氨水诱发的豚鼠及小鼠咳嗽均有明 显的抑制 作用,可显著延长咳嗽潜伏期,减少咳嗽次数,并且呈剂量相关性,说明?本内酯具有 明显的镇咳作用,是当归治疗咳喘的主要成分。 11 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 1.2.7 对心血管系统的作用 Yu Zhui 等[39]在研究当归注射液对日本大耳兔动脉粥样硬化的作用时,得出高血脂 组斑块面积大于当归组,高血脂组和当归组中的血脂水平高于对照组;说明当归注射液 能抑制兔主动脉动脉粥样硬化,通过降低血清甘油三酸酯浓度和它的血液流变学。Jae Soon Eun 等[40]研究表明,当归提取物氧化前胡素能延长动作电位时程的作用,还是一个 开放式 hKv1.5 通道的阻滞剂。因此,它是一种抗心律失常药,可作为治疗心房颤动的 侯选药。 2 当归挥发油的现代研究 2.1 当归挥发油的化学成分 挥发油的提取常用蒸馏法、溶剂提取法、吸收法、压榨法、二氧化碳超临界流体提 取法等方法。而当归挥发油的提取常采用水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、二氧化碳超临界 流体提取法。 董岩等[41]采用水蒸气回流法提取当归中的挥发油,收油率达到 0.4%。采用毛细管 气相色谱-质谱联用GC-MS程序升温方法对当归挥发油化学成分进行分析,共分离出 91 种组分,鉴定了 59 个化学成分,其中相对含量最高的是藁本内酯,占总含量的 57.81%,其次正丁烯基苯酞内酯 7.94%,反式-罗勒烯 4.09%,a-蒎烯 3.38%。刘琳娜等 [42] 用该法提取挥发油鉴别并测定了化合物的含量:藁本内酯54. 3%、 2-乙基-1-己醇、 十三烷4. 8%、9, 12-十八烯酸单甘油酯3.8%、9, 12-十八二烯酸乙酯3. 4%、十七酸 乙酯3. 1%和丁烯基苯酚2. 1%等。刘晖等[43]采用水蒸气蒸馏法SD提取岷县当归地上 枝叶部分和药用根部,挥发油收率为 0.1%和 0.3%,并用毛细管气相色谱-质谱联用技术 分析,地上部分挥发油成分被鉴定为松油烯、基庚酮、双环[4,2,1]壬烷-2,4-二烯-9- 酮、兰烯、?-乙香草烯、d-小豆蔻烯、?-榄香烯、?-草烯等 35 种,药用根部挥发油成分 被鉴定为丙醛、?-松油烯、?-蒎烯、环戊烷、戊基苯、a-松油醇、6-十一酮等 39 种。张 金渝等[44]用水蒸气蒸馏法对云当归进行提取, 大理鹤庆马场和沾益大坡乡 2 个产地云当 归挥发油的得率分别为 0.78%和 0.53%,通过 GC-MS 分析,大理鹤庆马场和沾益大坡 乡 2 个不同产地云当归挥发油中分别鉴定出了其中的 54 和 55 个化合物,得率分别为 0.78%和 0.53%。 方洪矩等[45]用沙氏提取器,己烷浸泡当归根粉过夜,恒温水浴提取 16 h,得到挥发 油为 3.4%,用 GC-MS 分析,结果显示当归挥发油中藁本内酯含量最高,为 48.36%, 12 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 其次为丁烯基苯酞,为 8.1%。谢静等[46]用 50?石油醚回流当归根粉,通过 HPLC 和 GC-MS 分析,挥发油分别 50%和 43%,鉴别的化学成分有顺式罗勒烯、 senkyunolideA、 3-butylidene-4-hydroxyphthalide、 3n-butylphthalide 、十 六 酸、 trans-beta- farnesene 、 hexadecanoic acid,methyl ester 、 ledene 、 senkyunolideF 、 ?-bisabolene 、 butylidene dihydro-phthalide、双环大根香叶烯、匙叶桉油烯醇、 9,12-octadecadienoic acid,methy 、 3-butylidene phthalide 、 Z-butylidene phthalide 、 乙 烷 基 亚 油 酸 酯 、 亚 油 酸 、 4-vinyl-2-methoxy-phenol 、 3n-butyl phthalide 等 23 个化合物。胡长鹰[47]用无水乙醚索 氏抽提器连续萃取当归饮片粉 18 h后,得率为 2.206%。胡长鹰等[48]用石油醚浸提当归 根粉 48h,挥发油中藁本内酯含量为 33.89% ~ 40.46%。 胡长鹰等[49]采用超临界 CO2SC-CO2萃取,用正己烷与丙酮的混合溶剂梯度洗脱硅 胶柱,并通过核磁共振技术Nuclear magnetic resonance,NMR鉴定其结构, 分别为 Z- 丁烯基苯酞、Z-藁本内酯、9-丁烯基苯酞、senkyunolide H。关志宇等[50]采用超临界 CO2 提取当归挥发油,并通过气相色谱-质谱法GC-MS分析,得到 65 个色谱峰,鉴定 62 种 化合物,有 9,12-十八碳二烯酸7.424%、a-蒎烯0.033%、亚油酸0.587%、大?牛儿 烯 B0.362%等,其中藁本内酯含量达到 74.4%。 李菁等[51]用国产 5L-9508 型超临界萃 取装置萃取当归尾粉 3h,挥发油收率达到 1.5%,通过 GC-MS-计算机联用技术分离鉴 定了 38 个成分,主要成分为亚油酸、藁本内酯、棕榈酸和丁烯基酞内酯,其含量分别 为 56.74%,19.82%、14.20%和 6.78%。陈楠等[52]使用 ISCO2-60 型超临界萃取主机提取 岷县当归根粉,挥发油收率为 5%,并通过气相色谱和色质联用等分析,分离鉴定出 41 种化合物,其中 10 种化合物如 a-喜瑞文烯、?-雪松烯等为首次发现;主要成分藁本内 酯含量为 48.16%,其次是正丁基芙内酯12.15%和亚油酸9.10%。朱巍等[53]采用该法 提取当归,并对该样品用 GC/MS 分析,鉴定出 30 种化合物,主要有藁本内酯、丁烯基 芙内酯、亚油酸、棕榈酸、油酸以及萜烯类化合物,其在挥发油中的质量分数为 50. 32%、 13. 15%、 9. 10%、 4. 31%、 2. 67%、4. 32%。李中文等[54]采用该法提取当归,萃取压 力 35MPa,萃取温度 35?,萃取时间 2h,萃取率可达 4.06%。经高效液相色谱分析, 藁本内酯含量为 19.59%。李燕等[55]采用 5L/32MPa 超临界萃取装置萃取甘肃岷县当归中 化学成分,鉴定出的化合物分别为:三甲基苯甲醛、环己烯、苯二酚、十八烯、藁本内 酯、十五酸、丁烯基苯酞内酯、棕榈酸、亚油酸、法尼烯、石竹烯、杜醛、蒿酮、嘧啶、 萘、维生素 E、豆甾醇、阿魏酸、异丁香酚、甲醛呋喃、十六烷碳酸、廿二酸、香豆素、 十三烷,其中藁本内酯为 60.209%,亚油酸为 19.208%,丁烯基苯酞内酯为 2.28%,棕 13 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 榈酸为 5.543%,阿魏酸为 2.937%。 2.2 当归挥发油的药理研究 2.2.1 当归挥发油对子宫的影响 肖军花等[56]采用常规萃取法,将当归总挥发油分离为酸性部位A1、酚性部位A2 和中性非酚性部位A3。采用离体子宫平滑肌张力法,表明 A3 为抑制子宫收缩的最 佳活性部位;1%吐温-80 对正常离体子宫收缩功能无影响,而当归挥发油对正常离体大 鼠子宫收缩功能呈双向作用,小剂量略有兴奋作用,大剂量则明显抑制。Mei Qi-bing 等[57]研究表明:当归挥发油具有“双向性”,能兴奋和抑制子宫平滑肌,其抑制成分为藁 本内酯。刘琳娜等[58]采用离体大鼠肌条,得出当归精油使 CaC12 累积量效曲线右移,最 大效应下降,为非竞争性抑制;在催产素、高钾去极化溶液存在条件下,当归精油对催 产素及高 K+ 去极化液中 Ca2+ 所致的离体子宫平滑肌收缩均呈剂量依赖性抑制;子宫平 滑肌依细胞内、外 Ca2+ 两种收缩成分均呈抑制作用。刘琳娜等[59]实验表明当归精油能 抑制醋酸及催产素所致小鼠痛经模型所引起的疼痛,显示当归精油能提高痛域值而具有 镇痛作用;当归精油还能对催产素所致离体子宫平滑肌的剧烈收缩亦可抑制,并能使其 恢复至正常水平,使小鼠离体正常子宫平滑肌收缩幅度、频率及活动力得到抑制,显示 当归精油对正常和病理性子宫平滑肌均有抑制作用,有较强的抗子宫平滑肌痉挛作用。 王小荣等[60]通过建立痛经模型,观察给药组小鼠子宫重量、子宫组织中一氧化氮和钙离 子水平。与阴性组比较,当归挥发油各剂量组对痛经模型小鼠扭体有显著的 抑制作用, 对小鼠子宫重量无明显影响 p0.05;而小鼠子宫组织中一氧化氮的含量显著升高p? 0.05;而钙离子含量显著降低p0 01。闫升等[61]通过实验得出,当归挥发油对收缩频 率呈双向性影响,小剂量略增加频率p0.05,大剂量却明显抑制收缩频率。剂量依赖 性地抑制收缩幅度和活动力,大剂量时大于 8 mg/100 mL抑制作用尤为明显,还得出 当归挥发油剂量依赖性地抑制缩宫素所致的子宫平滑肌兴奋作用。刘峰林等[62]用缩宫素 模拟制造小鼠痛经模型,以扭体潜伏期和扭体次数为指标,得出当归挥发油溶液 1 (0.06g?kg-1)组及阿斯匹林组与空白对照组比较可延长扭体潜伏期;阿斯匹林、当归挥 发油溶液 1、2 0.03 g?kg-1组与空白对照组比较可减少扭体次数,提示当归挥发油对小 鼠痛经有治疗作用。肖军花等[63]采用 Westernblot 方法和离体大鼠子宫平滑肌张力记录 法。研究表明 A3 活性部位可明显拮抗前列腺素 F2aPGF2a诱发的离体子宫收缩增强作 用;在经吲哚美辛处理,其抑制离体子宫作用明显增强。A3 活性部位浓度为 40、80 mg?L-1, 14 当归挥发油对兔十二指肠平滑肌的作用及有效组分筛选研究 抑制正常和 PGF2a 增高的大鼠子宫平滑肌组织 p42/44 丝裂原激活蛋白激酶 p42/44 MAPK磷酸化水平和间隙连接蛋白 43 Cx43 蛋白表达水平。 2.2.2 当归挥发油对呼吸系统的影响 当归挥发油平喘作用的主要成分是藁本内酯和正丁烯酞内酯。章辰芳等[64]描述藁本 内酯有较强的抗胆碱解痉作用,是当归精油丸的主要活性部分,对51例哮喘患者进行 治疗,总有效率90.2%,无明显副作用。陶静仪等[65]从岷县当归的挥发油中分离鉴定了 藁本内酯,它不仅对豚鼠离体气管条有松弛作用,而且对乙酸胆碱、组织胺以及氯化钡 引起的气管平滑肌痉挛收缩,有明显的解痉作用。吴国泰[66]研究表明,AN 1.0×10-4 mL?mL-1对豚鼠离体静息气管平滑肌有明显的舒张作用,A1 1.4×10-6 mL?mL-1有较弱的 舒张作用,A3 8×10-5 mL?mL-1有明显的舒张作用,AN及A3拮抗气管平滑肌收缩的作用 具有非特异性,均能对抗磷酸组胺、氯化乙酰胆碱、CaCl2、KCl、盐酸普萘 洛尔所致豚 鼠离体气管平滑肌的收缩。王锋等[67]采用正交设计方法,以豚鼠气管平滑肌张力变化为 指标,研究分析当归挥发油不同部位对豚鼠气管平滑肌的作用及交互影响。研究表明: 当归挥发油总油及A3对豚鼠离体气管平滑肌有明显松弛作用p0.01,A1和A2对豚鼠离 体气管平滑肌的作用不明显,A1与A3之间存在明显交互影响。 2.2.3 当归挥发油对心血管系统的作用 肖军花等[68]从当归总挥发油中分离得到 A1、A2 和 A3,对其进行预试,得出 A3 具 有明显减慢心率及抗实验性心律失常作用;并探讨了 A3 活性部位对离体心肌生理特性 和豚鼠心肌细胞动作电位的影响及作用机制,提示当归 A3 部位对心肌生理特性和动作 电位的作用可能与其阻 Ca2+、Na+内流和促 K+外流有关。赵惠茹等[69]采用细胞膜色谱法 cMC筛选、高效液相色谱法分离,在当归挥发油中分离出对主动脉血管有舒张作用的 2 种有效成分。张光毅等[70]采用线栓法堵塞大脑中动脉起始处,造成大鼠局灶性脑缺血 MCAO模型。研究表明当归内酯能够显著减小大鼠的脑梗死面积以及改善大 鼠的神经 症状,降低缺血脑组织中一氧化氮合酶的