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[指南]人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析

2017-11-13 6页 doc 17KB 27阅读

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[指南]人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析[指南]人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析 人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号:CSB-E12779h 最低检测限:1 ng/ml 特异性:本试剂盒可同时检测人cANCA (IgM),且与其他相关抗体无交叉反应。 有效期:6个月 预期应用:ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中cANCA (IgM)含量。 说明 1(试剂盒保存:-20?(较长时间不用时);2-8?(频繁使用时)。 2(浓洗涤液低温保存会有...
[指南]人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析
[指南]人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析 人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号:CSB-E12779h 最低检测限:1 ng/ml 特异性:本试剂盒可同时检测人cANCA (IgM),且与其他相关抗体无交叉反应。 有效期:6个月 预期应用:ELISA法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中cANCA (IgM)含量。 说明 1(试剂盒保存:-20?(较长时间不用时);2-8?(频繁使用时)。 2(浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 3(中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。 4(刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造 成任何影响。 实验原理 用中性粒细胞胞浆包被酶标板,制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应,然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgM进行反应,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的cANCA (IgM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品中抗体的效价(抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价)。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板(Assay plate ):一块(96孔)。 2. 样品稀释液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。 3. 辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液 (HRP-anti-human IgM Diluent):1×10ml/瓶。 4. 辣根过氧化物酶标记抗人IgM(HRP-anti-human IgM):1×120μl/瓶(1:100)。 5. 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。 6. 浓洗涤液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 7. 终止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N HSO4)。 2 需要而未提供的试剂和器材 1. 规格酶标仪 2. 高速离心机 3. 电热恒温培养箱 4. 干净的试管和Eppendof管 5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器 6.蒸馏水,容量瓶等 标本的采集及保存 1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或室温过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即 可检测,或将标本放于-20?或-80?保存,但应避免反复冻融。 2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心 15分钟,或将标本放于-20?或-80?保存,但应避免反复冻融。 3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本 放于-20?或-80?保存,但应避免反复冻融。 注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则: 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。稀释的过程中,应做好详细的。最后计算抗体效价时,稀释了“N”倍,标本中抗体的效价为“N”。 辣根过氧化物酶标记抗人IgM的稀释原则: 临用前以辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM加990μl辣根过氧化物酶标记抗人IgM稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 操作步骤 实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。 1. 加样:分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔加待测样品100μl, 注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶 标板加上盖或覆膜,37?反应120分钟。 2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液 100μl(取1μl 生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小 时内配制),37?,60分钟。 3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩 干。 4. 依序每孔加底物溶液90μl,37?避光显色(30分钟内,此时肉眼可见孔内有明显蓝色, 即可终止)。 5. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量 与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入 终止液。 6. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内 进行检测。 注: 1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。 2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2N HSO4。2 测量时先用此孔调OD值至零。 3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。 4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8?保存。辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作液请 依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人IgM工作 液。 5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。 洗板方法 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。 自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 计算 为检测样品中cANCA (IgM)效价,客户可以采取样品2倍倍比稀释样品计算抗体效价,一般采取以1:40为起始稀释倍数(使用样品稀释液进行稀释)。最大稀释倍数根据客户自身试验要求而定,最终显色与阴性对照孔进行比较,有明显差异的最大稀释度定为抗体的最终效价。 注意事项 1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。 2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。 3. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。 5. 在配制检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。 6. 底物请避光保存。 7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
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