一例低纤维蛋白原血症家系基因缺陷研究（可编辑）

一例低纤维蛋白原血症家系基因缺陷研究（可编辑） 中图分类号 密级 一例低纤维蛋白原血症家系基因缺陷的研究一 一 一 一 一 张洋 计:学位论文:页 表 格: 个 插 图: 幅 指导教师:闰金松教授 申请学位级别:硕士学位 学科专业:内科学 培养单位:大连医科大学附属第二医院 完成时间:二。一三年四月 答辩委员会主席:独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作 及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的 地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为 获得大 连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 学位论文作者签名: 孑长;每 签字日期: 珈一年丫月。日关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借 阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于请在以下相应方框内打“?”: .保密口,在一年解密后适用本授权书。 .不保密团。 作者签名: 日期:如;年 月 日 弘琴 日期:钞哆年月弓。日 导师签名:目 录? 一、摘要? 一中文摘要 二英文摘要 二、正文 一前言? 一,日舌??““??“” 二资料和? .资料? .材料和仪器? .对象? .方法.家系成员外周血纤维蛋白原测定? . 分离外周血单个核细胞? .外周血单核细胞提取基因组 .引物设计及合成 . 扩增. 产物纯化? . 基因测序 三结果 .实验检测结果? .基因检测结果四讨论 五结论 六参考文献 三、综述? 一综述 二参考文献? 四、附录? 五、致谢大连医科大学硕士学位论文 一例低纤维蛋白原血症家系基因缺陷的研究 硕士生姓名:张洋 指导教师:闰金松教授 指导小组:康志杰 主治医师 专业名称:内科学 摘要 目的:遗传性低纤维蛋白原血症 是纤维蛋白 原,显减少的一种遗传性疾病,由编码纤维蛋白原的基因、 、的杂合突变导致,突变类型包括错义、无义、剪切位点、启动 子、 的加工,翻译, 小的插入和缺失。这些突变可以影响转录, 翻译后加工,肽的折叠,链的组装,肝细胞的分泌,成熟蛋白的稳 定性。遗传性 低纤维蛋白原血症是一种罕见的疾病,常发生于欧洲地区。目前 已发现的、导致 中国人遗传性低纤维蛋白原血症的基因突变屈指可数,如、 、、和丫。我们发现了例低纤维蛋 白原血症中国家系,其原因未明。故本文目的是研究此例低纤维 蛋白原血症家系 的基因缺陷,进一步揭示遗传性低纤维蛋白原血症的发生机制。 方法:采集家系外周血,检测活化部分凝血活酶时间 ,、凝血酶时间 ,、凝血酶原时间 ,、.二聚体.、纤维蛋白降解产物 ,、抗凝血酶,活性用凝固法进行检测。抽提外周 个基因、和所有外显 血基因组,通过设计引物,、法扩增 子,产物纯化,直接测序法进行测序以寻找突变基因。 结果:先证者及其妹妹、个哥哥的水平均明显减低,分别为./, ./,./。先证者及其妹妹有、延长,分别是.,. 正常范围..,分别是,.正常范围.,.二 聚体、、抗凝血酶?为正常范围。先证者的女儿、儿子及其外甥 女水平正 常。先证者基因分析显示在先证者的、、基因区发现个纯合突变: .; .; .,而在家系的其它患者及正常 个体中也发现此种突变。另外又发现了个杂合突变: .; .; .。 结论:在家系的其他患者和正常个体中都发现了这个纯合突变, 故纯合突大连医科大学硕士学位论文 变不是致病突变。而发现的个杂合突变可能为致病突变,有待进 一步的全基因 组测序及功能试验。 纤维蛋白原 基因突变 关键词:遗传性疾病 低纤维蛋白原血症 肋 :? ? :. : : , : , ,,. . ,,,, ,,, , , .,. : , ,, , ,,. , ,. . : , ,?, , . ,. ,, ., . : , .‖,. /,.‖,. . , . 大连医科大学硕士学位论文?, . .。,,. .., . , ’ ,,:.. ., .,.. ., .,.:? , ., , . : 大连医科大学硕士学位论文 , 一例低纤维蛋白原血症家系基因缺陷的研究 硕士生姓名:张洋 指导教师:闰金松教授 指导小组:康志杰主治医师 专业名称:内科学 .?? 刚 吾 纤维蛋白原是一种含个氨基酸残基分子量为.的大分子糖蛋白。 纤维蛋白原是由两个相同组分、、组成的六聚体,链间以二硫键相连。 、和 个氨基酸残基,分别被个独立但 条多肽链,,各包括 是连续的基因,,编码,这些基因集中于号染色体.约 的区域【之。基因是由.的个外显子组成, 基因是由的 个外显子组成,基因是由.的个外显子组成,位于和 之间。条多肽链在肝脏内由多核糖体合成其前体蛋白,后独立地转位到肝细胞的 粗面内质网,通过链间的相互作用,分子伴侣的协助,质量监控机制的监控,组 装一步一步的进行。首先形成【吖,吖二聚体,后来第个链加入,最后【.吖 半分子聚合形成六聚体。这个六聚体分子由个链间及链内的二硫键连接,然后 通过高尔基体,连寡聚糖的成熟,特异边链的羟基化,硫酸化,磷酸化后,成 熟蛋白被分泌到循环中。在凝血的共同途径中,凝血酶通过从,链的端 去除纤维蛋白肽和,使纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白。凝血因子导 共价交联使纤维蛋白凝块变得稳固【】。 遗传性异常纤维蛋白原血症包括型和型缺陷。型缺陷即量的异常无 纤维蛋白原血症和低纤维蛋白原血症,有减低或者无法测量的免疫活性蛋白。 型缺陷即质的异常异常纤维蛋白原血症和低异常纤维蛋白原血症,表现有 正常或异常的抗原水平,和减低的凝血活性【】。遗传性低纤维蛋白原血症大多为常 染色体隐性遗传,导致其发生的突变大多是杂合突变【】。患者出血症状轻微甚至不 出血,在外伤、手术时可发生出血倾向。异常纤维蛋白原血症分子机制及晶体结 构的研究,让我们认识了纤维蛋白原的重要功能区,同样地,导致 低纤维蛋白原 血症的突变也逐渐被阐明,并强调结构对纤维蛋白原组装、分泌、稳定的重要性, 例/区和丫区在组装及分泌中的重要作用。 尽管传统上认为纤维蛋白原缺乏仅有凝血的异常,然而在一些低纤维蛋白原 血症患者中,还会出现肝脏、肾脏、血栓等病变。例如/ ,大连医科大学硕士学位论文 ?,纤维蛋白原蓄积于肝脏形成包涵体,最终可导致肝硬 化。另外,在遗传性肾脏淀粉样患者中,发现了影响链碳末端的突变,这些突 变被认为是使此肽的自然折叠变得不稳定,以致纤维蛋白原聚集于肾脏的淀粉纤 维中,导致循环中纤维蛋白浓度减低,同时造成了肾脏损害【。纤维蛋白的形成可 反馈性抑制凝血酶的产生,故遗传性无或低纤维蛋白原血症又被称为“抗凝血酶 【】突变的病 缺乏”。 .【引, 人中即有血栓形成,表明低纤维蛋白原血症有助于血栓形成倾向的产生,尤其伴 随其它血栓危险因子,如 和凝血酶原突变。 突变分散于纤维蛋白原的个基因,很少有突变热点。遗传性的纤维蛋白原量 的缺乏呈现了高分布及高水平的等位基因异质性,突变分布于,,个 基因,除了在 突变发生率为%以外,引起遗传性低纤维蛋白原 血症和无纤维蛋白原血症的频发突变是极少的,可能反映了高比率的自发突变。 基因测序为定位疾病、易感基因和探索其作用机制提供了线索,突变分析还能帮 助确定基因组的高突变区域。近年来,为迅速获得基因突变位点,国外常采用全 基因组测序的方法,但此法价格高昂,且大多数的点突变涉及到编码区或者是剪 切位点,很少涉及到启动子或者内含子内部。故国内常选择扩增的、、 个基因所有外显子,产物纯化后直接测序进行基因分析,如未发现突变 点,再行全基因组测序。当一个氨基酸突变被推测为低纤维蛋白原血症的原因, 进一步的蛋白或表达研究是需要的。纤维蛋白原的构成可以被.、、 等电聚焦法或者质谱检测出来。另外,如果以上分析法不能确定, 质谱肽图分析 可以选择,它可以准确描述变异和正常肽链的/,得出关于表达水平的明确结 论。 通过分子机制的研究,有助于对该病进行精确的分子诊断,从而能更好地揭 示基因型和表型的关系,也有助于早期发现携带者及预测并发症,更为通过分子 靶药物来治愈本病打下坚实的基础,具有深远的意义。本文主要是对发现的遗传 性低纤维蛋白原血症的家系进行基因缺陷的研究,在基因水平发现突变之后,再 进一步行功能试验。 研究思路:明确诊断:血凝仪检测家系外周血活化部分凝血活酶时间 、凝血酶原时间、凝血酶时间、纤维蛋白原等; 测序:抽取患者外周血提取全基因组,设计引物,扩增基因、 和的所有外显子,纯化产物,用直接测序法进行测序以寻找基因突 变,对有突变的序列正反向测序证实。 大连医科大学硕士学位论文 资料和方法 .资料 .材料与仪器 ..主要试剂 ,胎牛血清,,淋巴细 胞分离液购于天津灏洋生物制品科技有限公司,基因组提取系 统购于公司 ,反应试剂购于公司,琼脂 糖纯化试剂盒购于公司,、、、的凝固法检 测所用的试剂均为法国公司配套提供,.二聚体检测所用试剂由 上海太阳 公司提供,及抗凝血酶?检测所用试剂由日本一化公司提供。 ..主要仪器与设备 .全自动血凝仪法国公司、仪美国.、基因测 序仪公司型、低温高速离心机德国型、 普通离心机北京京立公司.型、倒置光学显微镜上海长方光学仪 器有 限公司、电泳系统上海天能、超净工作台阿尔滨实验设备有限公 司。 ..主要溶液的配制 配制 以新鲜去离子水充分冲洗于洁净烧杯内,用磁力搅 拌器充分搅拌使其完全溶解;称取.~. 加入溶液内充分混合,以 调值至.,以去离子水定容至 。液体经.岬孔径的无菌滤 膜分装于无菌血清瓶,.?保存。 溴化乙锭 用双蒸水配置成 ,存于棕色瓶,避光。 电泳缓冲液×储存液 .,用去离子水补至 碱,. .,冰乙酸 。 .%琼脂糖凝胶 称取.琼脂糖于三角烧杯中,加入“的,微波炉中加热 至完全溶解,冷却至。时加入终浓度.“/,混匀,充槽,室 温冷却 后即可用于电泳。 .对象 先证者,岁女性。既往体健,无出血及血栓病史,无流产及月经过 多史, 无肝肾疾病、恶性肿瘤病史,无高血压、糖尿病、冠心病病史, 无药物过敏史, 大连医科大学硕士学位论文 无手术、外伤输血史,无父母近亲婚配史。单位体检时查血常规、 尿常规、肝肾 功能、血糖、血脂、肿瘤标志物、肝胆胰脾肾彩超、子宫附件及乳腺彩超、胸部 均未见明显异常。血流变提示纤维蛋白原.玑,并于此次检测后的个月、 个月、个月分别进行纤维蛋白原测定,数值波动于...之间。进一步行,弥散性血管内凝血测定,包括、 、、.二聚体、及抗凝血酶?等,以明确出凝血功能状况,结果提示、 延长,正常,.二聚体、及抗凝血酶?正常。家系成员无出血、血 栓史,无流产、月经过多史,无肝炎、肝硬化、肾脏病史,无肿瘤病史等。家系 图谱见图。 :正粉生死亡口:正粉眭:常性?患者/:先证者 图先证者家系图 .方法 .家系成员外周血纤维蛋白原测定 采血前告知家系成员本实验的目的及意义,家系成员表示理解及同意,并签 定知情同意书。采集家系外周静脉血标本标本信息详见表以./枸 橼酸纳:抗凝。标本分份,份用于凝血指标检测,小时内检测完毕;另 份用于提取单个核细胞,.。冻存,以备抽提基因组。将用于凝血 测定的每 个家庭成员.外周血立即置?环境下, 后吸取上层血 离心 浆。法国.全自动血凝仪及配套试剂检测、、。用凝固法法国 .全自动血凝仪及配套试剂盒检测活性。用发色底物法日本一化试剂, 法国.全自动血凝仪测定抗凝血酶。用免疫比浊法上海太阳试剂,法 国.全自动血凝仪测定一二聚体。用免疫比浊法日本一化试剂,法国? 全自动血凝仪测定。 大连医科大学硕士学位论文 表:家系成员外周血标本详细信息 注:每个冻存管含个单个核细胞。 . 分离外周血单个核细胞 .生物安全柜/细胞超净工作台中,室温下操作 取 淋巴细胞分离液至无菌离心管中,然后用吸管吸取骨 髓液沿着管壁慢慢滴至液面上,不要晃动,保持血一之间清晰的分界面。 注意: 。存放的液体要拿到室温下、恢复到室温再使用。 液体:血液:体积比 当天采集的骨髓,可以先。暂时存放,但是最好当天全部处理完。 。 .室温下, 离心 .生物安全柜/细胞超净工作台中,室温下操作 离心完毕后,用吸管伸入第一层液面上,吸取第二层含有单个核 细胞的 液体,可以适当过量吸,以保证吸取到全部的单个核细胞。 将吸取的含单个核细胞的液体,放入另外一个无菌的 离心管中 已 预先加入 的培养基中。 混匀, 。 离心 .生物安全柜/细胞超净工作台中,室温下操作 倒去上清液,加入 胎牛血清,枪头吹打均匀,使用细胞计 数板计数,计算细胞密度。 再加入适当的,将细胞密度调整至×个/。 .生物安全柜/细胞超净工作台中,冰上操作 将混合液体积比:培养基:。细胞悬液和 细胞冻存管置于冰上。 大连医科大学硕士学位论文 将含有的细胞悬液分装至细胞冻存管中, /管,也即每个冻存管 冻存×个细胞。 往每个冻存管慢慢滴加 混合液也即混合液:: 体积比,一滴一滴的加,防止产热破坏细胞。 最后枪头吹打混匀。 .将分装好的含和的细胞悬液,先。放置,然后放置在 .?冰箱。在.?冰箱中放置天后,转移至液氮罐中长期存放。 .外周血单核细胞提取基因组 按照公司基因组提取试剂盒操作。步骤如下: 。 .开启恒温水浴锅,将温度调节在?,取一个离心管,加入 .取出冻存管含单核细胞,立即放入水浴锅中快速摇晃,让冻存液 迅速 融化。 .打开冻存管,将冻存液小一移到预先加入有培养基的离心管中, 离 心分钟。 .小心弃掉上清,加入 液,重悬。 .加? 蛋白酶或者蛋白酶至.微型离管管底。 .加步骤中的溶液至微型离心管。 如果样本体积不够 ,加适当体积的,当和同时存在于样本 中时,微型离心柱可以同时纯化两者。可以抑制一些下游酶促反 应, 但不会影响。 .的 酶储存液 /至样本中。 向样品中加入蛋白酶或者蛋白酶时,可能样本已经分装至微型 离心管中,如果出现这种情况,加入酶之后应适当混匀。 .?山 至样本中,涡旋秒。 为确保充分溶解,样本和 混匀是很重要的。 如果样本体积大于 ,应适当增加蛋白酶或者蛋白酶和 的量。例如: 样本需要“ 蛋白酶或者蛋白酶 。 和, 如果样本体积大于 ,建议使用 . 它们可以分别处理 样本。 。 注意:不要直接将蛋白酶或者蛋白酶直接加入 .温育。 细胞溶解后温育可以使产量达到最大,延长温育时间不会提高 产量。 大连医科大学硕士学位论文 .短暂离心. 微型离心管,使盖子内侧液体下移至管底。 .加入 乙醇%.%, ,混匀后,重复步骤一次。 如果样本体积大于,适当增加乙醇的量,例如:一个肛的样本将需 要 的乙醇。 .小心把步骤的混合液分装入微型离心柱个收集管,不要弄湿边 缘。关上盖子,离心 。将微型离心柱放在预先准备好的干净 的收集管上,扔掉包含滤液的管。 关上每一个微型旋转柱以避免离心时气溶胶形成。 离心是为了减少噪音。 全速离心将不会影响产量和纯度。如果离心后溶解产物没有完全 通过离 心柱,可以更高的速度离心,直到微型离心柱是空的。 注意:当从单核细胞中提取时,建议全速离心以避免堵塞。 .小心打开微型离心柱,加入 不要弄湿边缘,关上盖 。将微型离心柱放在预先准备好的收集管中,丢弃含 子,离一 滤液的收集管。 如果原样体积大于 ,增口 的体积是没有必要的。 小心打开微型离心柱,加入 ,不要润湿边缘。关上盖子, 全速离心, 。 .将微型离心柱放在一个新的收集管,丢弃有滤液的旧收集管。全 速离 。 。 这个步骤帮助消除残存的 .将微型离心柱放在一个干净的.微离心管上,丢弃含滤液的收集 管。 小心打开微型旋转柱,加入 或者蒸馏水。 温育,离心 。 .引物设计及合成 引物按序列、、、、应 用 . 软件设计并由公司合成。 引物设计及合成如下表:大连医科大学硕士学位论文 . 扩增 分别扩增以上外显子,扩增体系如下表: 大连医科大学硕士学位论文注: 包含. . ; 扩增条件:预变性。 ;变性。 ,复性。 ,延伸。 ?延伸;。 ;共。 . 产物纯化 产物经琼脂糖凝胶电泳、割胶后。应用公司的凝胶回收试剂盒回 收并纯化产物。 开始前注意事项: . .。 缓冲液的黄色提示 .使用前 缓冲液中加入%的乙醇。 .准备%异丙醇,将水浴锅调至。 .所有的离。步骤都是使用传统的桌面的微型离心机以, 拘转速 离 心。 步骤如下: .切出含有目的的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时 应注 意尽量切除不含目的的琼脂糖凝胶,尽量减小凝胶体积,提高回 收率。 .在无色试管中称量胶块重量,计算胶块体积。计算胶块体积时, 以 进行计算。 .向体积的胶块中加入体积的胶块融化液 。 .。温育 或直到凝胶片已经完全融化,每.分钟涡旋试管次以 帮助胶的融化。注意:胶块一定要充分融化,否则将会严重影响的回收率。 .在胶块完全融化后,观察混合液的颜色为黄色类似于没有溶解琼脂糖胶 的 的醋酸钠至 。如果混合液的颜色是橙色或者紫罗兰色,加入 .,混匀。混合液的颜色将会变成黄色。 .向胶块融化液中加入凝胶体积的异丙醇,混匀。 .将试剂盒中的离心柱安置于预先准备好的收集管上。 .为了结合,将上述操作中的溶液转移至离心柱中,离心分钟,弃滤 大连医科大学硕士学位论文 液,将离心柱放回原收集管上。 .向离心柱中加入. ,离心分钟,弃滤液,将离心柱放回原收 集管上。 .为了洗脱,向离心柱中加入. 洗脱液,使柱静置?分 钟后离心分钟,弃滤液,将离心柱放回原来的管上。 .再次离心分钟以去除残存的洗脱液。 .将离心柱放在一个干净的.微型离心管中。.为了洗脱,向离心柱 膜中央加入“ 洗脱液 ?, .,离心分钟。为了增口的浓度,向离心柱膜中央加入“后,使 柱静置分钟,然后离心分钟。在向离心柱膜中央加入 后,增加温育时间至分钟,可以增加纯化的产量。 . 基因测序 应用末端标记双脱氧法对纯化后的产物进行测序公司 澳序仪,使用软件将测序结果与美国基因库所公布的序列进行 比对,正、反向测序验证。 结 果 .实验检测结果如下表: 化验 耐 苴 儿子 外甥女 哥哥 哥哥 先证者 妹妹 女儿 扯常 . . . 悼乏 . 撕 . . . . . . . / 一二聚体 ?, . . / ?; . . ,/ 份 抗凝血酶 % .基因检测结果 经过测序分析,一共在先证者的、、个基因区鉴定个纯合 的突变,如下图: 大连医科大学硕士学位论文 删? ?川 二、、 毒棚叭一 .: ,渊孙 , 。 图::基因发现的个杂台突变 在家系的其它患者和正常个体上都发现了这个位点的纯合突变, 以 .为例,见图。 必逝巡拙. . 图:家系中其它患者及正常个体的纯合突变测序图谱 大连医科大学硕士学位论文 讨论 年遗传性低纤维蛋白原血症首次被报道,直到年, 等【】 才首次发现了低纤维蛋白原血症的基因缺陷,即杂合的 ?,此突变破坏了二硫键,进而影响组装及分泌,导致了低纤维蛋白 原血症的发生。目前引起低纤维蛋白原血症的突变多数为杂合突变。通过搜集大 量文献,发现了引起该病的个基因突变位点。这些突变可以通过影响转录, 的加工,翻译,翻译后加工,肽的折叠,链的组装,肝细胞的分泌,成熟蛋白的 稳定性这些过程,导致低纤维蛋白原血症的发生。该先证者平时无出血、血栓症 状,实验室检查提示活性用凝固法检测为.,、延长,.二聚体、、 抗凝血酶为正常范围,故表型诊断为低纤维蛋白原血症。基因分析显示在先证 者的、、基因区发现个纯合突变,而在家系的其它患者及正常个体 中也发现此种突变,说明这种纯合突变不是致病突变。另外又发现了个杂合突 变均分布于,其是否为致病突变,目前还不清楚,但通过查阅年. 年国内外关于遗传性低纤维蛋白原血症基因突变的篇文献,这个杂合突变 均未曾报道过。目前我们正在行全基因组测序,如测序结果中亦 存在这个杂合突 变,我们可以进一步检测家系中的其它患者和正常个体的基因序列,如果家系其 它患者和正常个体不存在这个杂合突变,说明它们可能为致病突变,可进行功能 试验以明确是否这些突变直接导致了低纤维蛋白原血症的发生,如果家系其它患 者和正常个体存在这个杂合突变,则这个杂合突变不是致病突变。 本实验扩增了的、、基因的外显子,但没有扩增启动子及 内含子与外显子的边界区,导致低纤维蛋白原血症的原因除了外显子区域基因突 变以外,还可能是启动子区域基因突变或者内含子突变。 即为目前发现的唯一导致低纤维蛋白原血 . 症的启动子区域杂合突变。使用质粒和中国仓鼠卵巢细胞进行荧 光素酶实验,结果显示在合并有.质粒的转录活性是合并有.的/,转 录活性的减低,进而导致纤维蛋白原合成的减少。另外作者还发现在人肝 癌细胞中.的活性比细胞高倍,提示在正常肝细胞纤维蛋白原合成的 调控明显不同于细胞株。 内含子基因突变可以导致前体发生剪接错误,其后果无非是以下种: .激活潜在的剪接点,导致其取代了发生突变的剪接点。.不能识别相应的外显子, 导致剪接时略过了其后的外显子;.不能识别相应的内含子,导致其保留在成熟 ,】, 中。导致遗传性低纤维蛋白原血症的供体剪切突变 应用构建小基因的方法发现其转录本有链号内含子的滞留,其可使该内含子 大连医科大学硕士学位论文 ,,而 位提前产生终止密码子 带有的一般会在体内降解【孓】,即无义突变介导的降解 ,,本结论已经过大量试验证实。 等【】人在甘油激酶基因的研究中发现了一个剪切位点突变 ?,也没有检测到异常转录本,他们用解释这种现象。混合杂 。,涉及 的个核苷酸的缺失个, 合突变 个;.和一之间和 .~。来自 的? 产物显示包含号和号内含子的异常转录本,来自 。的显示个异常 转录本,个包含号内含子,个由于激活了位于号外显子的潜在剪切位点,号 内含子被剪切。作者猜测在翻译成为蛋白质前,异常的转录本可能会被降解,或 者被翻译的变异链受到质量监控机制的监控而降解于细胞质中。导致的遗传性低 纤维蛋白原血症? 博突变导致阅读进入内含子,阅读了 下游的个残基后遇到终止密码子,据推测新的会包含脯氨酸之后的个 氨基酸,位之后残基被截断,使得其比正常的链缩短了%,质谱证实被截断 的那部分链没有分泌到血浆中,推测可能是被降解了。 大连医科大学硕士学位论文 结论 基于低纤维蛋白原家系的发现,我们拟通过提取基因组、扩增外显子区 域、进行基因测序的方法来发现家系患者的基因缺陷。虽发现了纯合突变,但非 致病突变。患者还发现存在杂合突变,其是否为致病突变目前还不清楚,分析低 纤维蛋白原血症的原因可能是:已发现的杂合突变、启动子区域突变或内含子突 变导致的前体剪切错误,已行全基因组测序,有待进一步研究。目前遗传 性低纤维蛋白原分子机制逐渐被阐明,通过分子机制的研究,有助于对该病进行 精确的分子诊断,从而能更好地揭示基因型和表型的关系,也有助于早期发现携 带者及预测并发症,更为通过分子靶药物来治愈本病打下坚实的基础,具有深远 的意义。大连医科大 学硕士学位论文 参考文献 】 , , . . .;:? , , , , , , ., ; . . ; ?: . 】 ,, . . ? ;: . ,? . . ;:? : , , , , . .. . ;:? . 【 ., , , , , .. ;: 【 , , ,. , , . ;:? : , 【 , : . .;:? , 】 , , , , :... ;: , , . . .;:, , , , . 大连医科大学硕士学位论文 ? 一 ..;: , , , , , , , , , . .. ;: .,:, ., :, , , , , ,. . ,,:仁, , . ,? . ,,:.. , , , , ,, ., , , : ? ? . ,,: , ,, , , , ., ;. . ; : .,,.. ;: 大连医科大学硕士学位论文 综述 遗传性低纤维蛋白原血症的分子机制 张洋综述 闫金松审校 摘要:遗传性异常纤维蛋白原血症包括型和型缺陷。型缺陷即量的异常 无纤维蛋白原血症和低纤维蛋白原血症,有着低或者无法测量的免疫活性蛋 白。型缺陷即质的异常异常纤维蛋白原血症和低异常纤维蛋白原血症,表 现有正常或异常的抗原水平,和减低的凝血活性【】。遗传性低纤维蛋白原血症是功 能性和抗原性纤维蛋白原水平的降低. ,自年以来,目前已发现的 导致遗传性低纤维蛋白原血症的基因突变有种见表,主要包括错义、无义、 剪切、插入和缺失、启动子等种突变,这些突变是通过影响肝脏分泌成熟纤维蛋 白原的过程而导致低或无纤维蛋白原血症的,这些过程包括影响转录,的加 工,翻译,翻译后加工,肽的折叠,链的组装,肝细胞的分泌,成熟蛋白的稳定 ?眭【】 关键词:纤维蛋白原 低纤维蛋白原血症 突变 表达 .纤维蛋白原的基因、蛋白结构、生物学功能 .纤维蛋白原的基因 纤维蛋白原的三个链,,分别被三个独立但是连续的基因,, 编码,这些基因集中于号染色体.约的区域【引,基因是由 .的个外显子组成,基因是由的个外显子组成,基因是由. 的个外显子组成,三个基因由’至’的排列顺序为、、。 .纤维蛋白原的蛋白结构 纤维蛋白原,是一种含个氨基酸残基相对分子量为 的大分子糖蛋白。它是由两个相同组分、、丫组成的六聚体,通过个 链内和链间的二硫键相连。三条多肽链,,各包括、和个氨基酸 残基,分别被三个独立但是连续的基因,,编码。、、这三 条多肽链在肝脏由独立的多核糖体合成其前体蛋白,然后转位到粗面内质网,通 过链间的相互作用、分子伴侣的帮助、质量监控机制的监控,一步步的进行组装, 即首先形成.,.聚体,后来第个链加入,最后.丫半分子聚合形成 六聚体。然后通过高尔基体,连寡聚糖的成熟,特异边链的羟基化,硫酸化,磷 大连医科大学硕士学位论文 酸化后,成熟蛋白被分泌到循环中。 在成熟的纤维蛋白原二聚体分子中,两个外围区区由链和链的羧基端 .端及部分链组成,中央区区由条多肽链的氨基端.端组成,而 链的.端折回参与区结构。区与区之间由?区带状结构相连, 链形成的【螺旋结构,大约由 .区为、、 个氨基酸残基组成, .区两端的二硫键对纤维蛋白原分子成熟二聚体结构的形成至关重要见 图 。链和丫链的区均包含个部分:区即.端区域,是由股薄片折叠成为 一个短螺旋;区即中心区域:由股薄片和个螺旋组成;区.末端:有极少 的二级结构,但包含聚合位点,钙离子结合位点见图。~ 图: 显示了纤维蛋白原分子的主要结构区域。黑色代表链,深灰色和浅灰色分 别是和,链。两端的区和中心的区通过带状区连接。 显示和丫链.末端球状区域的重叠丝状图。此图包含链残基?黑色和, 链残基?灰色,表明了这两个区域之间总体结构的同源性。钙离子结合位点为球形。 氨基和羧基末端分别被称为.端和一端。末端区域、股薄片、末端区域分别被标记为、 和。 .纤维蛋白原的功能 人类纤维蛋白原是一种急性反应蛋白,半衰期为天,血浆中的浓度为.. ‖。在肝脏内合成,纤维蛋白原分子在凝血级联反应中起着关键的作用,并且在 纤溶过程中也起到重要作用。血管损伤时,凝血酶先后裂解链端. 键和链端.键,分别释放矛,的释放匕早且速度快, 足以诱导血凝块的形成【。的释放暴露了聚合位点,然后.、.区及边.边 的非共价结合,形成了不稳定的可溶性纤维蛋白。通过凝血因子介导共价交联 使纤维蛋白凝块变得稳固,形成止血血栓。纤维蛋白原还可通过血小板膜结合位 大连医科大学硕士学位论文 点,介导血小板的聚集反应,起到协同止血的作用。 .遗传低纤维蛋白原血症的临床表现 一个有趣的突变群体【、等,它们不仅导致低纤 维蛋白原血症,而且与肝脏疾病有关。原因在于突变影响了纤维蛋白链的分泌, 使其蓄积于肝脏内质网中,造成循环中纤维蛋白原水平下降及肝病的发生,严重 时可导致肝硬化。另外,在遗传性肾脏淀粉样患者中,发现了链.端的突变, 作者认为该突变使肽的自然折叠变得不稳定,以致纤维蛋白原沉积于肾脏的淀粉 纤维中,导致循环中纤维蛋白浓度减低【』。 纤维蛋白原缺乏可致出血的发生。无纤维蛋白原血症通常在出生时即因脐带 出血而被发现,自发的脑出血和脾破裂可以发生在一生当中,其它的出血如齿龈 出血,鼻衄,胃肠出血也是常见的【。低纤维蛋白原血症主要是温和性出血,创伤 及外科相关的出血与自发性出血的比例为%:%【。低纤维蛋白原血症与无纤 维蛋白原血症都与反复的流产及分娩前后流产有关。另外,纤维蛋白的形成 在凝血过程的凝血酶下调中起重要作用,故遗传性无或低纤维蛋白原血症又被称 为“抗凝血酶缺乏”。 .【】, 【 突变的病人即有血栓形成,表明低纤维蛋白原血症有助于血栓形 成倾向的产生, 尤其伴随其它血栓危险因子,如 和凝血酶原突变。 .遗传性低纤维蛋白原的分子机制 遗传性低纤维蛋白原血症首次被报道于 年。直至 年, 等【】 首次发现了低纤维蛋白原血症的基因缺陷,即杂合的 ,此突变破坏了二硫键,进而影响组装及分泌,导致了低纤维蛋白 原血症的发生。引起低纤维蛋白原血症的突变多数为杂合突变。通过搜集大量文 献,迄今为止,人们发现引起该病的个基因突变位点见附表。这些突变可 以影响转录,的加工,翻译,翻译后加工,肽的折叠,链的组装,肝细胞的 分泌,成熟蛋白的稳定性这些过程,导致低纤维蛋白原血症的发生。 .遗传性低纤维蛋白原血症的突变热点及分布 引起遗传性低纤维蛋白原血症的突变分散于纤维蛋白原的个基因,很少有突 变热点,可能反映了自发突变的高比率【 。在分布上,已报道的突变中,亚洲人 种比例约为%,大多数为欧洲人种。 .遗传性低纤维蛋白原血症基因缺陷和基因表达的关系 纤维蛋白原主要在肝细胞内表达,通常我们将含突变点的基因克 隆至表达载 体,然后转染哺乳动物细胞后,观察其体外表达情况。 ..启动子突变与基因表达 即为启动子区域杂合突变,使用质粒 . 大连医科大学硕士学位论文 口中国仓鼠卵巢细胞进行荧光素酶实验,结果显示在合并有一 质粒 的转录活性是合并有.的/,转录活性的减低进而导致纤维蛋白原合成的减 少。 ..剪接突变与基因表达 的剪接是指去除初级转录产物上的内含子,把外显子连接成为成熟 的过程。大多数内含子都以为’端的起始,而其末端则为?一’。 ’?..’称为剪接接口或边界序列。剪接位点突变可使前体发生剪 接错误,出现以下种结果:?潜在的剪接位点被激活,替代发生突变的剪接位 点;?相应的外显子不被识别,致使剪接时略过了其后的外显子;?相应的内含 子不被识别,被保留于成熟中【。 对于突变【】,作者没有发现蛋白水平的异常,然而在细胞 中的突变转录产物证明突变激活了潜在的剪接位点,导致剪接时略过了外显子的 前 个核苷酸,链。末端%缺失,继而出现低纤维蛋白原血症。这个突变是 发现的第一个外显子剪切突变,强调了同时在蛋白和水平分析潜在致病核苷 酸的重要性。对于 】突变,剪删,导致阅读 进入内含子,阅读了下游的个残基后遇到终止密码子,导致肽链缩短了%。 专,剪接供体,导致链号内含子的滞留,终止密码子 提早出现,而通常带有的会在体内降解。 突变则出现了内含子滞留及潜在剪接位点激活。 ..基因缺陷和蛋白质表达 ...突变影响细胞内的加工 在内质网,信号肽将三条链的末端的肽去除,然后在高尔基体,蛋白酶将 链.端的肽裂解,羧肽酶修饰,形成有着.末端的成熟蛋白【’】。在纤维 蛋白原中,暴露的【心....遵循二碱价规律,防止其裂开。 ,位点处的被天冬氨酸替换,消除了这个保护作用,导致 在 了在高尔基小泡内链前位氨基酸的移除。 ...突变影响细胞内的组装【之引。突变影响了二硫键丫 . 此突变在中国仓鼠卵巢细胞中的瞬间表达证明了突变链可以合成,但是在培养液 中未发现突变链。脉冲追踪试验表明没有唧和阱的组装,在细胞中的成熟纤维蛋白 原不表达变异的链。这就表明了低纤维蛋白原血症是由链内二硫键的断裂导致 的,而且这种断裂影响了组装。类似的通过影响二硫键而导致低纤维蛋白原血症 的突变还有趴,引,,‘捌。 大连医科大学硕士学位论文 ...突变导致内质网的滞留 正常的才可以分泌,而异常的除了被降解,还可以被滞留于肝细胞内质 网中,进而导致低纤维蛋白原血症,以下四种突变就是这种情况。 第一个, 陋】,发生在一个意大利妇女,在腹部手术中 首先发现肝硬化。肝脏活检发现纤维蛋白原包涵体。 位于丫区股中最末 梢股.的末端,突变可能干扰薄片的重排,方便了分子内股的插 入,导致纤丝的形成并阻碍分泌。 第二个, 【】,先症者是个来自波多黎各的年轻女孩, 伴有慢性肝病。肝脏组织学检查发现大部分肝细胞胞浆内存在一种物质,此物质 与抗血清纤维蛋白原发生强烈反应。位于区潜在的绞锁结构聚合口袋的入 口,连接薄片的第股和丫区的区。突变使此区域变得不稳定,导致第股的分 子内插入。 第三个, ‘】,先症者来自法国,有肝硬化,肝 细胞电镜发现粗面内质网内充满了密密麻麻的包涵体,弯曲的管状结构排列成指纹 样结构,且此包涵体与抗血清纤维蛋白原发生强烈反应。 ,先症者是一个岁的男孩,有延长, 第四个, 转氨酶升高,肝脏活检发现粗面内质网中有指印样排列的纤维蛋白包涵体。蛋白 分析未见异常链,表明变异链不能表达于血浆纤维蛋白原中。位于钙离子结 合位点和股薄片中间,具有高度保守性。与、形成氢键,突变可 以干扰氢键的连接,导致错误折叠和纤维蛋白原内质网的储留。 ...突变影响区域的稳定和分泌 纤维蛋白原链的三级结构以及折叠对于分泌非常重要。】 突变使丫链区区与区之间的氢键断裂,区灵活性的增加,造成 了区域的不稳定进而影响分泌。还有 突变,位于 , 区的远端区,它的羧基群体与高度保守的 的主链形成氢键。氢 键的断裂可以造成区域的不稳定,造成低纤维蛋白原血症。 突变也可造成低纤维蛋白原血症,此突变说明区的区和薄片之间 的氢键在维持区域稳定性中的重要作用。 氨基酸替换导致电荷的改变也可造成区域不稳定进而影响分泌,如: 【”, 均为, 天冬酰胺是中性的,而天冬氨酸带负电荷,故可能导致结构的不稳定。 ... 链碳末端截断与蛋白表达 等人使用连续链末端截断的方法证明了此链最后个氨基酸对分泌 至关重要,因为它们可以阻止末端疏水残基的暴露。然而,等通过 大连医科大学硕士学位论文 细胞共表达实验证明,链一半的末端对于组装或分泌不是必需的, 例如突变 】,终止于区的末端,变异链可以被分 泌到血浆纤维蛋白原中,这证明区对于组装和分泌不是必需的。似乎是终止密 码子提前出现导致区域错误折叠或者被截断的区域的存在,而不是正确折叠的终 止,导致了链的不稳定和特定截断的链的不分泌。 据推测【】突变可能造成链碳末端%的缺失,有可能不被组装。 对于此突变的致病机制,一种解释是突变激活了无义介导降解通 路,即一种监督机制,其可有选择的降解能产生终止密码子的分子, 这种猜测目前还不能被完全排除。 ...丫链末端突变与蛋白表达 链的末端非常重要,因为它包含:,:聚合位点,高亲和力的钙离子结合 部位,血小板结合位点,子交联位点,组织纤溶酶原激活物激活位点【、、。 此区的突变可以影响组装、分泌或者纤维蛋白原的稳定性,进而导致低纤维蛋白 原血症。如靠近:聚合位点的 ,靠近“,’聚合位点的【】, 。 靠近钙离子结合位点的,【 . 综上所述,突变是通过影响肝脏分泌成熟纤维蛋白原的过程而导致低或无纤 维蛋白原血症的,这些过程包括影响转录,的加工,翻译,翻译后 加工, 肽的折叠,链的组装,肝细胞的分泌,成熟蛋白的稳定性。遗传性 低纤维蛋白原 血症分子机制的研究,有助于对该病进行精确的分子诊断,从而 能更好地揭示基 因型和表型的关系,也有助于早期发现携带者及预测并发症,更 为通过分子靶药 物来治愈本病打下坚实的基础,具有深远的意义。 大连医科大学硕士学位论文 参考文献 . 【 , ,. .;: . , , 【】 ,: ?; .】 , , . . .;:? . 】 , , , ? . ;: , , , , . : . . ; : . 】 , , , , ,印 .. ;:? , , , , ,. 、?? . ;: , , , , .: . ; , 【 , ,. : ,,,,, ;:? . . 【 , , , , : . ; 牟击., , , . . : ;:. , , , , ?. : . . ;:. 大连医科大学硕士学位论文, , , , , :. .. ;:?, , , , , ,.: .. ;:, , , , , ,, 谢 .?. 、加 . ? ; : 【 , , , , ... ;:? ., , .. ; :, , , , , , , . ?; : .. . , ,. ? . ;: 『陈华云,杨芳,许冠群,张利伟,戴菁,丁秋兰,奚晓东,王学锋, 王鸿利. 纤维蛋白原【链剪切位点突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症. 内 . 科理论与实践,,: , , , , , , . ,; ? . . ;?:? . , , , , , ?: 大连医科大学硕士学位论文..;:? . 【 , . .;: 一, , .. . ;:? ., ,. . ;:? , , , , , , , ... ;:, , ...:;:. ;: 【 , , , , , , . , , , , ... ;: 【 , , , , , , , . :.. ?; :, , , , , ,, . ? . . ? ; : ., , , , 丫 ? . . . ; : 大连医科大学硕士学位论文 , , , , , . :. . ;: , , ,? , , . ?? . . ;: , , , ,. . . ;:?. , 一 , .. ? ;: , , , , , , , . , , ?: . , , . ;:. , , , , , ,;:? .. , .? . ;: , , , , , , 【 .、? . . ;: , , . , .. ;:. , . ;:. , , , . 【 , : . ; : . 大连医科大学硕士学位论文 , . : . ;: . . , , . ?. ;:? , . 【 , ,.. ;: : , , . ,. . ;: ., , , , , . . ;: :, , , . . . ? ;: ., , , , , .. ;: ., , , , . 。 ; : , , , 【 , .一 一. . ;:? . , , 【 , , , , . ; :? . ., , , , . . 、析 ;: 大连医科大学硕士学位论文 , , . , , ; . 一 . ;:? , , :.. . ; : , , , , .. ?” . ;:? , ., , , ,. . ;: , , , , , ,夕, . , ,?:. . ;: , . , , , 、析. . ; :? , , , , , , :. ? .. ;: . , , , . . ;: , , , . ? ?. 一 . . ;:? , , , , , ? . .. ; : ’大连医科大学硕士学位论文 ., , , , . . ;:? 【 , , , , ,? . . . ;: ., , , ,, . . ;:? , , , , , , , . ? : . . ;: . , , , , , ,. . ;: 徐鹏飞,王明山,谢海啸,金艳慧,牛真珍,郑芳秀,朱丽青。低纤维 蛋白原 ,: 血症患者中发现一种新的突变。温州医学院学报, ~ . 【 , , , , , , , ,. ? . ;: , , ,, , , . ,; ? . . ; ?:? 大连医科大学硕士学位论文 附录 附表:导致遗传性低纤维蛋白原血症的基因突变 / / . 二硫键 【 . . 二硫键 , . 】 . 二硫键 】. 二硫键 】 . 带状区域 【 . 【链区 气 . 链区 姒 【 . 终止密码子提早出现 】. 链区 【】 一转录减少 【】 内含子滞留,终止密码子提前出 】 现 . 位氨基酸之后被截断 【. 带状区域起始部分 【】 . 影响了剪切位点 【】. 区股薄片 】. 区之后的截断 ? 剪接位点 】. 区股薄片 【】区股薄片 【】 . 区 【】 . 区区【 . 末端被截断 【】. 终止密码子出现在位氨基酸 【】