凝胶阻滞电泳

凝胶阻滞电泳 聚乙烯亚胺结合DNA的凝胶阻滞电泳实验 实验导读 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的标准。即用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可检测出凝胶中少至1 ng的DNA，故可以直接显示DNA 在凝胶中的位置，也可以用于聚阳离子材料对质粒DNA结合能力的检测。 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于以下四个参数: 1)DNA分子的大小:电泳时线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，迁移率与其分子量的对数成反比。 2)琼脂糖浓度:一定大小的DNA片段通过不同浓度的琼脂糖凝胶时迁移率也不同。DNA电泳迁移率(μ)的对数与凝胶浓度(ξ)间的线性关系，可表达为下列等式: Log μ= log μ0,Kr?ξ 式中μ0为自由电泳迁移率;Kr为阻带系数，它是与凝胶性质、迁移分子大小及形状有关的常数。因此，利用不同的凝胶浓度，就能在较大范围内分离不同大小的DNA片段。 表1、 琼脂糖的浓度对分离范围的影响 凝胶中琼脂糖含量(,) 线性DNA分子的有效分离范围 0.3 60,5 0.6 20,1 0.7 10,0.8 0.9 7,0.5 1.2 6,0.4 1.5 4,0.2 2 3,0.1 3)DNA分子的构象:分子量相同的闭合环状DNA(第一型)、有缺刻的环状DNA(第二型)及线状DNA(第三型)在琼脂糖凝胶中的迁移率不同。 4)电泳所用电流:低电压条件下线性DNA片段的迁移率与所用电压成比例。.随电场强度的增加，高分子量DNA片段迁移率也有不同程度的增加，因此，电压增加时则琼脂糖凝胶电泳分离DNA的有效范围减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，凝胶电泳的电压应小于5 V/cm。 在基因治疗研究中，常用到多种带正电荷的聚阳离子材料，如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖以及树枝状载体材料，它们能与质粒DNA在一定的重量比或摩尔比下，通过正负离子的结合，缩合形成纳米微粒。在凝胶电泳实验中，通过不同重量比或者摩尔比的载体材料与DNA的结合，在外加电场的作用下，结合物在凝胶上迁移的距离有所不同。因此可据此筛选材料与DNA完全结合时的重量比或者摩尔比，为载体材料在体外细胞实验和体内实验提供适宜的比例关系。 在凝胶电泳实验中，常用的电解液是50 mmol pH 7.5,7.8的Tris,乙酸盐、硼酸盐或磷酸盐等几种不同的电泳缓冲液(见表)，通常配成浓缩液于室温贮存。 表2、 常用缓冲液的配制 缓冲液 组成 浓缩贮存液(每升) Tris,乙酸盐 0.04 mol Tris-乙酸盐 5×: 243 g Tris碱 (TAE) 0.001 mol EDTA 57.1 mL 冰醋酸 100 mL 0.5 mol EDTA(PH8.0) Tris,磷酸盐 0.08 mol Tris-磷酸盐 10×:108 g Tris碱 (TPE) 0.002 mol EDTA 15.5 ml 85,磷酸(1.679 μg/ml) 40 mL 0.5 mol EDTA(PH8.0) Tris,硼酸盐 0.089 mol Tris,硼酸盐 5×: 54 g Tris碱 (TBE) 0.089 mol 硼酸 27.5 g硼酸 0.002 mol EDTA 20 mL 0.5 mol EDTA(PH8.0) 而Tris-乙酸盐(TAE)是最常用的电解缓冲液。TEA的缓冲能力相当低，长时间电泳缓冲系统容易失效(阳极变碱，阴极变酸)，因此，在使用数次后需及时更换成新鲜的缓冲液。 在琼脂糖凝胶电泳实验中，对DNA观察最方便的办法是用荧光染料溴化乙锭(Ethidium bromide EB)染料。EB具有可插入DNA碱基群中的一个平面基团。这一基团的结合部分与碱基很接近，使染料与DNA结合后较游离于液体中的染料表现出更强的荧光。 溴化乙锭(EB)可用于检测单链或双链核酸(DNA与RNA),。通常在凝胶及电泳液中均掺有溴化乙锭(0.5 μg/ml)。 一、实验目的 1. 了解凝胶电泳的原理及基本操作。 2. 掌握凝胶阻滞电泳分析材料与DNA的结合能力。 二、实验原理 实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳实验。在电场中, 在pH值为8.0,8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。阳离子聚合物是目前非病毒基因载体中研究较多的一类材料，如聚乙稀亚胺(PEI)、聚氨基酸和壳聚糖等，与DNA的结合能力对其转染效率有着至关重要的影响。以PEI为例，其与DNA通过静电作用形成一个复合物微粒，通过凝胶阻滞实验即可直观的反应其浓缩DNA的能力。 在实验过程中，需计算聚乙烯亚胺与DNA的比例。从研究中发现，对聚乙烯亚胺的研究较多的是采用纳摩尔比(nmol/nmol)，即聚乙烯亚胺中所含“氮”的纳摩尔(nmol):DNA中“磷”的纳摩尔(nmol)，也就是通常所表示的N/P比。以25KDa的聚乙烯亚胺为例，称取90 mg的PEI溶于20ml的去离子水中，其浓度为4.5ug/ul，因为其分子量为25000，故其浓度为0.18 nmol/ul。由于聚乙烯亚胺中的基本单元结构为,CH2,CH2,NH2，,CH2,CH2,NH和,CH2,CH2,N三种单元结构的质量分别为44，43，42平均为43，另外对于分子量为25000的聚乙烯亚胺而言，共有个581个结构单元，即25000/43,581。所以聚乙烯亚胺中的“N”含量为0.18×581(nmol/ul),100 nmol/ul，也就意味着质量浓度为4.5 ug/ul的聚乙烯亚胺(分子量为25000)，其“N”的浓度为100nmol/ul。其他分子量的聚乙烯亚胺溶液可以按照以上的方法进行质量浓度与摩尔浓度的换算。对质粒DNA而言，根据其结构中碱基对的数量，每微克的DNA含3nmol的磷，即“P”的浓度。这样，PEI与DNA的N/P即为PEI中所含“N”的nmol与DNA中所含的“P”的nmol之比。如聚乙烯亚胺储存液的浓度为10 nmol/ul，DNA储存液的浓度为0.33 ug/μL(即“P”的浓度为1nmol/ul)，在实验中取PEI和DNA各1ul，则两者的N/P比即为10 nmol/1 nmol=10/1，当然在研究中可以调节两者的浓度，使得N/P为整数倍,如1/1，2/1，3/1„„。 也可以用聚阳离子材料与质粒DNA的重量比进行凝胶电泳实验，即微克载体材料比微克质粒DNA。下图是阳离子材料聚乙烯亚胺/DNA复合物的凝胶电泳照片。 DNA 0.2/1 0.4/1 0.6/1 0.8/1 1/1 2/1 3/1 (nmol/nmol) 图 1 阳离子材料聚乙烯亚胺/DNA复合物的凝胶电泳示意图 三、仪器和试剂 1( 聚乙稀亚胺25 kDa，琼脂糖，TAE，EB，质粒DNA，上样缓冲液。 2( 培清 JS-380A自动凝胶图像分析仪，Tanon EPS100 核酸电泳仪。 四、实验步骤 1 聚乙烯亚胺溶液制备 称取90 mg的PEI溶于20ml的去离子水中，其浓度为4.5ug/ul，因为其分子量为25000，故其浓度为0.18 nmol/ul。 2 琼脂糖凝胶的制备(大板) 称取1 g琼脂糖，加入100 mLTAE缓冲液(1×)，沸水浴或者微波加热至熔化，晃动使之均匀，冷却至60 ?后加入3 μL溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)(0.5 μg/mL),混匀后灌胶并插好梳子，静置约30 min，使之凝固。拔掉梳子，将胶小心推入电泳槽，加样口一端应与负极(黑色)平行。电泳槽中加入TAE缓冲液，使液面高于凝胶约1 mm。 注:中板则取500 mg 琼脂糖，小板则取250 mg 琼脂糖，浓度与大板一致。 3聚乙烯亚胺/DNA复合物的制备 称取 PEI25 kDa 90 mg，将其溶于20 mL水中得到母液，其含N浓度为100nmol/μL。取30 μL该母液稀释至1mL得到含N浓度为3 nmol/μL的PEI溶液。取DNA，稀释使其含P的浓度为3 noml/μL。取上述PEI溶液和DNA溶液各1 μL，用PBS稀释至20uL，混匀得到N/P比为1:1的溶液，静置30 min左右使其充分复合。然后将该样品与上样缓冲液混合均匀，依次点入加样孔中。 通过调整二者的加样体积，可以得到N/P为2，3，4„„的复合物。 4电泳实验 打开电泳仪，设置参数，电压80 v，电流800 mA，时间30 min左右，待看到上样缓冲液指示剂到达阳极一端，停止电泳，在凝胶图像分析仪上拍照。 五、注意事项: 1( 溴化乙锭是很强的诱变剂，接触含有该染料的凝胶或溶液时一定要戴手套。 2( 设计实验时，阳离子材料和DNA的N/P要选择合适，使得到的凝胶电泳照片能够有层次 的显示其与DNA的结合情况。 3( 加样时要注意尽量不要让样品溢出加样口，缓慢小心的加入。 六 思考题 1 如何进行载体材料/DNA重量比与纳摩尔比的换算。 2 根据聚乙烯亚胺与质粒DNA中N/P的计算，如何计算聚赖氨酸和壳聚糖与DNA的N/P比例。 七、参考文献: 1.D Li,G Tang.et al. The construction of a novel kind of non-viral gene delivery vector based on protein as core backbone. Vox Sanguinis 2008;94:234–241. 2. Yun-Xia Sun,Ren-Xi Zhuo.et al.Synthesis of (Dex-HMDI)-g-PEIs as effective and low cytotoxic nonviral gene vectors. Journal of Controlled Release 2008;128:171-178. (赵丹军 汤谷平)