左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用

左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用 左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用 作者: 周俊，刘景汉，邢颜超，王冬梅，欧阳锡林【摘要】 本实验旨在研究左旋精氨酸(L arginine)和西洛他唑(cilostazol)在体外对血小板激活的抑制和功能保护作用，为可逆性血小板抑制剂在血小板保存中的应用提供依据。采用对血小板 CD62p和PAC 1表达及凝血酶激活后再表达率的流式细胞分析(FCMs)、血小板聚集试验以及血小板凝血活性检测等手段，观察血小板激活、血小板功能状态。结果表明，体外‎‎处理后血小板CD62p和PAC 1表达率显着增加，西洛他唑和左 旋精氨酸对这一过程CD62p和PAC 1表达有较强抑制作用，且随浓度增加而递 增。西洛他唑可抑制凝血酶激活后CD62p和PAC 1的表达，左旋经氨酸仅抑制凝血酶激活后的PAC 1表达。左旋精氨酸和西洛他唑对3种诱导剂诱导的血小板聚集呈现不同程度的抑制作用，抑制作用随浓度递增。左旋精氨酸?15 mmol/L时， 血小板聚集时间延长甚至不凝集。西洛他唑在浓度1-4 mmol/L范围均延长血小板聚集时间。结论: 5 mmol/L和10 mmol/L的左旋精氨酸均可抑制血小板体外处理过程的激活，且血小板的聚集和再表达功能不受影响，5 mmol/L作用更佳。1 mmol/L浓度西洛他唑抑制血小板体外激活，可保留血小板部分聚集活性和再表达能力。 左旋精氨酸 Inhibition of L Arginine and Cilostazol on Activation of 【关键词】 Platelets In Vitro Abstract The purpose of study was to investigate the effects of L arginine and cilostazol on platelet activation and aggregation reserve in vitro, so as to provide proof for selecting reversible activation inhibitors for platelets lyophilization. Activation and function of platelets were investigated by using flow cytometry with the CD62p and PAC 1 expression and re expression after being activated by thrombin, and by means of platelet aggregation reaction to thrombin, ADP and propyl gallate, as well as coagulation activity of platelets. The results showed that expression of CD62p and PAC 1 increased after being pretreated. Both L arginie and cilostazol could inhibit CD62p and PAC 1 expression and related with their concentrations. Cilostazol had an intensive inhibition effect on expressions of CD62p and PAC 1 induced by thrombin, and the inhibition increased when concentration augmented. L arginine had the same effects on PAC 1, but had no effects on CD62p. L arginine and cilostazol inhibited aggregation induced by thrombin, ADP and propyl gallate, and the inhibitions were related directly with dosage. When L arginine concentration was higher or equal to 15 mmol/L, or cilostazol concentration was in range of 1-4 mmol/L, the aggregation time were prolonged so much or even no aggregation. It is concluded that when L Arginine concentration is 5 mmol/L and 10 mmol/L, platelet activation can be inhibited, but aggregation ability and characters keep intact. Concentration at 5 mmol/L may be the best. 1 mmol/L of cilostazol can inhibit activation in vitro and retain part of platelet ability of aggregation and reexpression. Key words L Arginine; Cilostazol; Platelet activation; Platelets preservation J Exp Hematol 2017; 15 (5):1079-1083 左旋精氨酸(L arginine)为一氧化氮释放剂，抑制磷酸二酯酶活性，减少cAMP降解，可使细胞内外cAMP浓度升高。西洛他唑(cilostazol)是喹 啉类衍生物，西洛他唑和它的代谢产物是cAMP PDEIII(环磷酸腺苷,磷酸二酯酶III)抑制剂，可抑制PDE活性和阻碍cAMP降解(和转化)。这两种药物均可增加cAMP在血小板和血管内浓度，抑制血小板聚集和使血管扩张，防止血栓形成和血管阻塞。本研究针对这两种药物在体外对血小板的作用进行实验，结果报告如下。 材料和方法 血小板 采自无偿献血者，献血前1天内未饮含酒精类饮料，2周内未服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的药物。全血用ACD三联袋采集，用富含血小板血浆(PRP)分离法一次离心制备PRP。 左旋精氨酸(L arginine, Sigma公司产品)，西洛他唑(cilostazol，大冢制药公司产品)，海藻糖(trehalose，南宁中诺生物工程有限公司产品)，二甲亚砜(DMSO，天津医药公司产品)。荧光素标记的特异性血小板膜表面抗体及相关多肽: PAC 1,FITC、CD62p,PE、CD61,PerCP、MIgGI,PE均为Becton Dickinson公司产品，RGDS肽和GPRP购自Sigma公司。 血小板聚集诱导剂 凝血酶(thrombin)，二磷酸腺苷(ADP)，丙基没食子酸酯(propyl gallate) (Analytical Control Systems, In Co产品)。 主要仪器 MEK 6108K型全自动血细胞分析仪(Nihon Kohden公司产品)，APACT 2聚集仪(德国Lanbo公司产品)，FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司产品)和CellQuest分析软件， Biofuge15R(Heraeus公司产品)。 实验分组及处理 实验分实验组，对照组和FPRP(富含新鲜血小板血浆)组。对照组和实验组依次加入冷冻干燥保护剂，1-4实验组加入左旋精氨酸，终浓度依次为5，10，15，20 mmol/L。5-8实验组加入西洛他唑，终浓度依次为1，2，3，4 mmol/L。均在体外进行保存前的预处理，包括37?水浴4小时，离心，洗涤，重悬等。 血小板聚集试验 选择thrombin，ADP和propyl gallate作为血小板激活诱导剂体外检测血小板的聚集功能。各诱导剂的作用浓度: thrombin 1 U/ml，ADP 225 μmol/L，propyl gallate 50 μl。以血小板浓度(250-300)×106/ml的FPRP为0，以PPP为100，正常对照为FPRP管。血小板浓度: (250-300)×106/ml，反应体积: 250 μl。取预处理后血小板，用原血浆重悬，孵育至37?后加入诱导剂，立即血小板最大聚集率(PAgT)及聚集曲线，根据公式计算药物对血小板的聚集抑制率。 聚集抑制率, ,(对照血小板聚集集-实验血小板聚集率)/对照血小板聚集率,×100% 膜表面标志CD62p，PAC 1的表达率 加入荧光素标记的抗血小板单克隆抗体各10 μl，室温避光反应20分钟，立即加入 1.0 ml 1%多聚甲醛(2-6?)混匀，4?保存，24小时内在流式细胞仪上分析。以CSC、FSC和CD61识别获取血小板，以速度300个/秒获取10 000个血小板(gate=R2)进行FL1和FL2分析。 膜表面标志CD62p ，PAC 1再表达率 测定血小板在凝血酶激活后CD62p和PAC 1的表达。分析方法同上。根据结果计算血小板再表达率,凝血酶处理后表达率,血小板表达率,1,。