大鼠细小病毒KRV株培养方法的建立

大鼠细小病毒KRV株培养方法的建立 28 5 ol, 28 No, 5 V第 卷 第 期 实 验 动 物 科 学 LABORATORY ANIMAL SCIENCE October 20112011 10 年 月 櫴櫴櫴櫴櫴毷 櫴毷毷 ?研 究 论 著 櫴 *KRV 大鼠细小病毒 株培养方法的建立 刘 先 菊佟巍张 丽 芳王 艳 蓉高 子 琪仉 惠 敏荣蓉刘 云 波 ( ,100021 )中国医学科学院医学实验动物研究 所 卫生部实验动物检测中心 北 京 C6 ) ( Primary rat embryo cells,RE) : ( Rat glial cell line 摘 要 目 的 建立用大鼠胶质瘤细胞系 替代大鼠原代胚细胞 来 ( Kilham Rat Virus,KRV ) 。 500 TCIDKRV 75 TC6 -培 养大鼠细小病毒 的 方 法 方 法 将 培 养 物 接 种 到 细 胞 培 养 瓶 50 5 ( 2 ×1 0 / mL) ,,CPE + + , + + + ,( FITC ) 中 细 胞 接 种 量 为 培 养 过 夜 待 细 胞 病 变 达 时 分别用免疫荧光 鉴 定 所 培 ,( HA ) ,DNA ,96 养 病毒的特异抗原 用血球凝集试验 测 定 培养物上清的效价 用 测序鉴定所培养的病毒 最 后 用 孔 KRV TCID。 KRV C6 4 ,5 ,,CPE + + + + , 板 培 养 法 测 定 的 结 果 在接种到 细胞的第 天细胞发生明显的病变可达 50 FITC KRV ,HA 1 ?5 12 0 ,,NCBI KRV 鉴 定 呈 抗 原 阳 性 病毒的培养上清中 效 价 为 测 序 结 果 明 该 病 毒 序 列 与 中 序 4. 6 KRV 。 KRV TCID/ 0 . 1 mL。 C6 KRV 98 % ,10 列 同 源 性 达 确 定 为 收 获 的 的 为 结 论 通 过 对 细 胞 系 培 养 方 法 50 ,的化和对所培养病毒的一系列鉴定表明 用大鼠胶质瘤细胞系可以替代大鼠 原代胚细胞系进行大鼠细小病毒 。的 培 养 : ; ; ; ; 关 键 词 大 鼠 细 小 病 毒 大鼠胶质瘤细胞 大鼠原代胚细胞 免 疫 荧 光 试 验 血 球 凝 集 试 验 : S 852. 65,617 9 ( 2011 ) 05 -0012 -03: A: 1006 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 文 章 编 号 KRV ) Kilham ( 1959 ) GB / T 14926. 31 -( 。 大 鼠 细 小 病 毒 由 等 首 次 的 培 养 是 必 不 可 缺 的 环 节 之 一 atr,。2001 ( Primary 从 患肿瘤的大鼠体内分离到属于细 小 病 毒 属实 验 中 建 议采用大鼠胚 胎 原代 细 胞 KRV 。 KRV embryo cells,RE ) KRV ,,RE 大鼠和 野 生 大 鼠 均 是 的 自 然 宿 主呈 世 培 养 然 而 用 细 胞 培 养 KRV 、,RE ,存 在 费 时 费 力 及 细 胞 的 自 发 病 变 干 扰 等 界范围性分布并因不断引入易感鼠而使病毒感染持 ,1, ( KRV ) ,KRV 。KRV ,缺 点 可 经 胎 盘 垂 直 传 播 给 的 培 续存在我国 也 是 的 流 行 地 区 之 一吴 小 闲 等 养 : KRV 调查 表 明野 生 大 鼠 群 中 感染抗体阳性率为 ,2 ,7 , 。 KRV , 带 来 了 诸 多 困 难 本文参考国外有关 的 培 养 方 法 改 进 64. 70% 。大鼠细小病毒是对实 验大鼠危害最为严重 ( C6 ) KRV 为 使用大鼠胶质瘤细胞 细 胞 进 行 培 养 的 ,KRV ,的病毒之一成年大鼠感染 多 无 症 状而 免 疫 抑 ,KRV 。 方 法 取 得 成 功 并 建 立 了 的 检 测 方 法 ,KRV 制等因素可激 发 本 病种 鼠 群 感 染 后 导 致 其 繁 ,KRV 、殖率下降而乳鼠感染 则 表 现 为 发 育 不 良黄 疸 1材 料 和 方 法 。和运动失调 等 症 状大 鼠 细 小 病 毒 还可污染肿瘤抑 ,1, ,。 制物和肿瘤细胞系会严重干扰肿瘤的实验研究 1. 1 KRV TCID毒 株 的 培 养 及 测 定 对实验动物 进 行微生物 检 测是对实验动物质量 50 。 KRV 1. 1.1 : C6 F10 ( 2. 5 %和 实 验 结 果 准 确 性 的 重 要 保 障 已 列 入 实 验 病 毒 培 养 细 胞 在 培 养 基 含 ,15 % ,2 % ) 。胎 牛 血 清 马 血 清 青 霉 素 与 链 霉 素 中 大 鼠 病 毒 检 测 的 必 检 项 目 我 国实验动物国家标准 培 GB / T 14926. 31 -2001 中 推荐 使 用酶联免疫吸 附 试 。80 % ,, 养 当 细 胞 生 长 至 汇 合 时 弃 去 培 养 基 用( ELISA ) 、( IEA ) 、验 免 疫 酶 试 验 间 接 免 疫 荧 光 试 验 37 ? mmol / L PBS ( pH7. 2 ) 1 10 的 缓 冲 液 洗 涤 细 胞 ( IFA ) ( HAI ) 及 血 凝 抑 制 试 验 方 法 对 动 物 血 清 中 。100 TCID/ 100 L KRV 次 接 种 已 调 整 为 μ的 毒 50 ( 500 L / 75 T ) ,接 种 量 为 μ瓶 将 细 胞 瓶 置 于 KRV 。 的 抗 体 进 行 检 测 而 上 述 方 法 的 实 施 都 37 ? 、 株 5 % CO10,1 h,F培 养 箱 中 使 病 毒 吸 附 随 后 加 入 KRV 、,需 要 抗 原 的 制 备 纯 化 及 抗 原 片 的 制 备 因 2 ,KRV此 ,0 6 ,0 8: 2011 收 稿 日 期 * : ( No. DWS200906 )基 金 项 目 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目 : ( 1965 ,) ,,。 : 。 E -mail: xianjuliu@ 263 ,ne t 作 者 简 介 刘 先 菊 女 副 主 任 技 师 研 究 方 向 实验动物质量控制 : ( 1962 ,) ,,。 E -mail: liu-yunbo@ 263 ,ne t 通 信 作 者 刘 云 波 男 研 究 员 CPE ) 。 Kilham rat virus( GenBank: AF321230. 1 ) 72 h ,( CPE养 后 观 察 细 胞 病 变 当 中 的 序 列 设 达 到 “ + ”; CPE 26 % ,5 0 % ,,P1 : ( 5 -25 % ,’达 时 计 引 物 时 记 作 记 作 GCACAGACAACCAAACAGGAACT CTCC 3 ) ,-’“ + + ”; CPE 51 % ,7 5 % ,“ + + 达 时 记 作P2 : ( 5 ’-AGTCTCACTTTGAGCGGCTG - + + ,10 0 % ,76 % 时 记 作达 + ”。 + ”; CPE “ + 3 ’) 。PCR Invitrogen 。 1. 1.2 TCID产 物 纯 化 后 由 公 司 测 序 : C6 96 测 定 细 胞 接 种 到 孔 细 胞 培 养 50 4 2( 2 ×1 0 / ) ,24 h。 KRV 板 中 个 细 胞 孔 培 养 用 无 血 结 果 10 ,C6 清 培 养 基 进 行 倍 梯 度 稀 释 依 次 加 入 到 细 2. 1C6 KRV 细 胞 系 对 敏 感 胞 500 TCIDKRV C6 ,48 h 感 染 细 胞 后 后 细 胞 ( 8 ) ,37 ? 培 养 板 每 个 稀 释 度 个 复 孔 置 培 养 箱 中 50 ,72 h ,1 h。,F10 开 始 出 现 病 变 当 培 养 至 后 细 胞 病 变 明 培 养 弃 去 病 毒 悬 液 加 入 无 血 清 培 养 ,,8, 显 , + ++ 。CPE + ’, 与 未 感 染 细 胞 对 照 相 达 Reed Muench TCID 。基 培 法计 算 病 毒 50 +‘ ,比 、,3 d。 ,1. 2KRV 病 变细胞的形态变圆 变 大 且 病 变 的 细 胞 呈 凝 聚 状 养 逐 日 观 察 并 记 录 细 胞 病 变 情 况 并 根 抗 原 片 制 备 及 免 疫 荧 光 试 验 , ( 1 ) 。 : C6 据GB / T 14926. 31 2001 见 文 后 图 版 ? 图 该 结 果 表 明 细 胞 对-病 毒 抗 原 片 制 备 按 照 方 KRV ,KRV 。 敏 感 感染可导致该细 胞 发 生 病 变 ,C6 KRV 法 进 行 分 别 制 备 正 常 细 胞 和 感 染 细 胞 的 2. 2C6 KRV 培 养 的 病 毒 呈 免 疫 荧 光 阳 性 反 应 。 抗 原 片 C6 为 进 一 步 对 细 胞 系 培 养 的 病 毒 进 行 鉴 ,( IFA ) : 定 间 接 免 疫 荧 光 试 验 将抗原片在室温平 KRV C6 利 用 免 疫 荧 光 试 验 对 感 染 的 细 胞 进 行 验 ,KRV ( 1 ?5 1 ?10 衡 分 别 加 入 大 鼠 抗 血 清 设 和 两 个 。KRV ( ?10 ) 1证 当 阳 性 血 清 稀 释 与 病 变 细 胞 反 应 ) ( ) ,稀 释 度 和 正 常 大 鼠 血 清 不 稀 释 随 后 将 抗 原 ,时 绿 色 荧 光 主 要 集中在病变细胞边缘及病变细胞 片 。( 1 ?5 ) 的 胞 浆 部 位 而使用正常大 鼠 血 清 稀 释 作 为 ,37 ? 30 mn。 i放 入 湿 盒 中 于 水 浴 孵 育 抗 原 片 用,。 对 照 与 病 变 细 胞 反 应 时 则 未 见 荧 光 结 果 表 ,PBS 3 ,3 min,明 缓 冲 液 漂 洗 次 每 次 随 后 加 入 山 羊 抗 KRV C6 ,成 功 感 染 了 细 胞 并导致了该细胞系的病 IgG -FITC ( Sigma,1 ?50 ) ,37 ? 大 鼠 稀 释 水 浴 孵 育 ( , 2 ) 。 变 见 文 后 图 版 ? 图 30 min。PBS 2 , 抗 原 片 先 后 用 漂 洗 次 蒸 馏 水 漂 洗 2 ,3 1. 3KRV ( )HAKRV ( HA)血 凝 试 验 血 凝 试 验 1 ,。 次 封 片 后 用 荧 光 显 微 镜 观 察 ,KRV 通 过 血 凝 试 验 对 所 培 养 的 进 行 进 一 步 的1. 3.1 : 豚 鼠 红 细 胞 悬 液 制 备 从 豚 鼠 心 脏 取 血 置 于 1 ?2 56 0 ,1 ?2 56 0。,KRV 即 鉴 定 经 测 定 血 凝 效 价 为 。3 ,1 % 阿 氏 液 中 生 理 盐 水 洗 涤 红 细 胞 次 制 成 KRV 1 。 稀 释 的 为 个 血 凝 单 位 ,4 ? 。的 豚 鼠 红 细 胞 悬 液 保 存 待 用 1. 3.2 2. 4KRV KRV : 基 因 扩 增 及 序 列 比 对 培养物血凝测定 血 凝 板 内 分 别 加 入 GenBank KRV AF321230. 1 根 据 数 据 库 中 的 25 L ( μ梯 度 稀 释 的 病 毒 培 养 物 用 生 理 盐 水 进 行 ( nt3691 ,397 1 ) 序 列 设 计 引 毒 株 的 高 度 异 源 区 ,2 ,: 1 ?20 , 1 ?20 48 0 ) ,物 倍 梯 度 稀 释 稀 释 度 范 围 再 向 DNA ,PCR 以 所 培 养 的 病 毒 基 因 组 做 模 板 进 行 25 L,1 孔 内 加 入 豚 鼠 红 细 胞 悬 液 μ震 荡 混 匀 扩 ,281 bp。 min, 30 ,4 5 min 。 增 预 计 扩 增 产 物 大 小 为 所培养病毒的扩 置 室 温 后 观 察 血 凝 结 果 当 对 照 ,( 增 产 物 经 电 泳 鉴 定 其 大 小 与 预 期 一 致 见 图 3 ) 。孔 红 Btn ,+ + +las,100 % (+ ) ; 序 列 分 析 表 明 所培养病毒 的扩增产物序列 铺 在 孔 底 即 为 凝 集 不 凝 集 者 红 ,, 细 胞 沉 积 即 可 观 察 结 果 红细胞全部凝集 呈 网 状 平KRV AF321230. 1 , 与 毒 株 的 序 列 同 源 性 最 高 达 到,) 。100 % ( 以 凝 集 的 病 细 胞 沉 积 到 孔 底 呈 点 状 毒 99 % ,KRV 。 提示所培养的病毒确 定 为 。 最 大 稀 释 度 为 该 病 毒 的 血 凝 效 价 1. 4KRV DNA 、的 提 取 基 因 扩增及序列测定 31. 4.1 DNA : 200 L KRV ,的 提 取 取 μ培养物用病讨 论 毒 DNA ( Viral DNA Kit,D3892-02,BoxA ) 纯化 试 剂 盒 KRV ,RE ,有 关 的 培 养 除 用 细 胞 培 养 外 我 国 DNA。DNA / L。200 ng 提取病毒基因组 浓度为 μ 。 目 前未见采用其它细胞培养 的 相 关 报道 我 们 参 考1. 4.2 : KRV 3691 ,397 1 引 物 设 计 基 因 组 中 区 域 14??28 实 验 动 物 科 学 卷 参 考 文 献 , M,, : ,1992 :,, 1 , 田 克 恭 实验动物病毒性疾 病北 京 农 业 出 版 社 126 ,13 2 , Besselsen D G ,Besch-Williford C L,Pintel D J,et al, Detection , 2 , of H -1 Parvovirus and Kilham Rat Virus by PCR,J,, J Clin Microbiol,1995 ,33 ( 7 ) : 1699 ,170 3 , Wan C H , Bauer B A , pintel D J, et al, Detection of rat , 3 , parvovirus type 1 and rat minute virus type 1 by polymerase chain 3 R-PCR 2 % KV图 扩 增 产 物 的 琼脂糖凝胶电泳 reaction,J,, Laboratory Animals,2006 ,40 ( 1 ) : 63 ,6 9 , M : DL500 DNA Marker; 1 : 10 L KRV PCR ; 2 : 5 μ的 扩 增 产 物 Wan C H ,SderlundVenermo M ,pintel D J,et al, Molecular -, 4 , L KRV -PCR ; 3 : 2 LKRV -PCR ; 4 : μ的 扩 增 产 物 μ扩 增 产 物 阴 性 对 characterization of three newly recognized rat parvoviruses,照 ,J,,Jo urnal of General virology,2002 ,83 ( Pt 8 ) : 2075 ,208 3 , HA ) ,KRV) KRV ,( 胞 进 行 的 培 养 经 血 凝 试 验 测 定 Goto K , Hayashimoto N, Ishida T, et al, First trial in 1 ?2 56 0 。I , 1 , 5 , 培 养 物 血 凝 效 价 可 达 由 文 后 图 版 图 Developmental Phase of the “Performance Evaluation ,KRV C6 ( ) 48 h 可 以 看 出 感 染 细 胞 生 长 旺 盛 期 Program Based on the ICLAS Animal Quality Network ” Programe: SelfAssessment of Microbiological Monitoring - , ,后 细 胞 的 形 态 发 生 明 显 变 化 病 毒 滴 度 达 到 5. 6Methods Using Test Samples supplied by ICLAS,J,, Exp Anim,10 2009,58( 1) : 47 ,5 2,W icker R , Gunther M , Isolation and TCID/ mL,用 荧 光 显 微 镜 观 察 到 病 变 细 胞 内 50 , 6 , characterization of thermosensitive mutants from Kilham rat KRV KRV 。颗 粒 及 特 异 抗 原 的 存 在 且 经 测 序 表 virus, a rodent parvovirus,J,, J Gen Virol,1988 ,69 ( Pt1 ) : 163 ,17 5 , ,Genbank KRV 明 所 培 养 病 毒 的 基 因 序 列 与 中 具 , 7 , Kunita S,Chaya M ,Hagiwara K ,et al, Development of ELISA ( 98 % ) ,有 最 高 的 同 源 性 提 示 所 培 养 病 毒 为 Using Recombinant Antigens for Specific Detection of Mouse KRV 。 Parvovirus Infection,J,, Exp Anim ,2006 ,55 ( 2 ) : 117 ,12 4 , ,C6 RE KRV 综 上 所 述 用 细 胞 代 替 细 胞 进 行 ,, M,, 2 , ,: , 8 , 殷 震 刘 景 华 动 物 病 毒 学 版 北 京 科 学 出 版 ,社 ,KRV ,培 养 以 此 解 决 了 大 量 培 养 问 从 而 满 足 了 1997 : 513 ,51 4 , IFA 、IEA 、HAI ELISA 及 等 检 测方法的抗原制备需 ,。求 为实验 动物大鼠细小 病毒的检测奠定了基础 Establishment of Cell Culture System for Kilham Rat Vius ( KRV) using Rat Glial Cell Line C6r LIU Xian-ju,TONG Wei,ZHANG Li-fang,WANG Yan-rong, GAO Zi-qi,ZHANG Hui-min,RONG Rong,LIU Yun-bo ( Monitoring Centre of Laboratory n imAal,Ministry of Health; Institute of Laboratory nAimal Science,Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College,Beijing 100021 ,China) Abstract: Objective To establish a culture method for Kilham Rat Virus ( KRV ) using the Rat glioma cell line ( C6 ) instead of primary rat embryo cells ( RE ) ,M ethod s 500 TCIDKRV was inoculated into C6 ( The C6 50 5 cells were diluted to 2 ×1 0 / ml and then cultivated overnight before infection ) and the infected cells were cultivated until the CPE ( cytopathic effect) reached + + , + + + , Then,the viral antigen was “” identified by immunofluorescence ( FITC ) assay and the viral titer in the supernatant of culture was detected by hemagglutination test ( HA ) ,I n additi on,the virus was identified by DNA sequencing of the conserved regions of FRV genome, And the virulence of viral culture ( TCID) was determined by the 96 wells cell culture method, Results The CPE of 50 C6 cells reached + + + at 4 ,5 day post infection with KRV ,T h e resu lt of FITC indicated that the “ ” viral 4. 6 antigen was positive for KRV ,and HA titer of the viral culture reached 1 ?5 12 0 ,T he cultivated virus was identified TCID / 0. 1 mL, Conclusion The infection of KRV on C6 cells and subsequently identification C6 cells was 10 50 as KRV ,as the sequence of it had 98 % similarity with KRV ,and the virulence of KRV obtained by infection on experiments indicated that KRV could be maintained in C6 cells instead of RE cell, key words: kilham rat virus; C6 cell; RE cell; FITC assay; hemagglutination inhibition test