唾液淀粉酶活性观察

唾液淀粉酶活性观察 实验一 唾液淀粉酶活性观察 [目的] 1. 了解温度，pH、抑制剂和激活剂等因素对酶活力的影响。 2. 了解酶的特异性。 [原理] 酶是一种生物催化剂，它同一般催化剂最主要区别是酶具有高度的特异性(专一性)。即:一种酶只能对一种化合物或二类化合物起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化作用，酶在催化这些反应时，其活性常受到很多因素的影响，这些因素主要有温度、pH、酶浓度、底物浓度、激活剂和抑制剂等，本次实验是通过唾液淀粉酶的底物,淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察淀粉酶在各种环境条件下的活性，通过唾液淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用来说明酶的特异性。 淀粉被酶分解的变化，可借碘遇淀粉呈兰色，遇各种糊精呈紫色，红色，遇麦芽糖不呈色等特定的颜色反应来观察，麦芽糖因有还原性可以使斑氏试剂呈红色沉淀。 [试剂与器材] 一、试剂: 1.1,CuSO溶液:0.5,蔗糖溶液，0.5NaCl溶液。 4 2.0.5,淀粉溶液。 3.碘化钾—碘溶液:取碘化钾2g及碘1.27g溶于200ml水中，用前稀释5倍。 4.斑氏试剂:溶解无水CuSO 17.4g于100ml热蒸馏水中，冷却，稀释至150ml，取柠4 檬酸钠173g及无水NaCO，100g加水600ml，加热使之溶解冷却后稀释至850ml。最后，23 与上述溶液混合，搅匀待用。 5.缓冲溶液: 缓冲液A:(1,15M的NaHPO)称NaHPO?2HO溶于1000ml水中。 24242 缓冲液B;(1,1 5M的KHPO)称9.078gKHPO溶于1000ml水中。 2424 pH4.92溶液=A液0.10ml+B液9.90ml pH8.67溶液=B液9.90ml+B液0.10ml 二、器材: 1.试管及试管架、烧杯。 2.吸量管(1、2、5ml)。 3.电热恒温水浴箱。 4.水浴锅。 5.电炉。 6.白色比电盘. 7.量筒. 8.滴管。 [操作方法] 1.唾液淀粉酶的制备: 每人用自来水漱口三次，然后取20ml蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中(沙布过滤)取此酶液10ml，放入小烧杯中稀释至20ml，以此稀释唾液做如下实验。 2.酶活性的观察: 1)温度对酶活性的影响 ?取三支试管，编号，按下表准备. 同时迅速加入稀释唾液，混均且及时放入水浴。 试管号 0.5%淀粉溶液 稀释唾液 温度 现象 (ml) (ml) 1 5 1 0?水浴 2 5 1 37?水浴 3 5 1 沸水浴 ?在比色盘上，滴加碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取反应液一滴与碘 液混合，观察碘颜色变化。 ?待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化对向各管中加入碘液，摇匀，观察各管颜色说明温度对酶活性影响。 2)pH对酶活性的影响 ? 取三支试管，编号按下表准备: 试管号 0.5% PH6.64 PH4.92 PH8.67 稀释唾液 淀粉溶液 缓冲液 缓冲液 缓冲液 (ml) 现象 (ml) (ml) (ml) (ml) 1 2.5 1 0 0 1 2 2.5 0 1 0 1 3 2.5 0 0 1 1 ?置试管于37?水浴中8—10分钟，向各管中加入碘液1滴，观察井记录现象，解释pH对酶活性的影响。 3)酶的抑制及激活。 ? 取三支试管，下表准备: 0.5%NaCl 稀释唾液 蒸馏水 试管号 0.5% 1%CuSO4 淀粉溶液 溶液 溶液 (ml) (ml) 现象 (ml) (ml) (ml) 1 2 1 0 1 0 2 2 0 1 1 0 3 2 0 0 1 1 ?将三支试管放入37?水浴，并在比色盘上用碘液检查第2管，待碘不变色时，向各管加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。 4)酶的特异性 ? 取三支试管按下表准备。 试管号 0.5%淀粉溶液 0.5%蔗糖溶液 稀释唾液 现象 (ml) (ml) (ml) 1 2 0 1 2 0 2 1 ? 稀释唾液加入后，放入37?水浴并准确记时。 ? 在水浴中保温10分钟，向各管加入斑氏试剂1ml，放沸水浴中煮沸1-2分钟，记录 并解释结果。 实验二 胰蛋白酶活力测定 [目的] 学习蛋白酶活力测定的方法。 [原理] 酶活力的大小，通常是以该酶在最适pH和温度条件下，酶催化一定时间后，反应物中底物减少的量或产物形成的量来表示。本实验是以产物形成的量来表示胰蛋白酶的活力的。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，因此可用蛋白质(如酪蛋白)为底物，测水解生成氨基酸(酪氨基酸等)多少来定酶活力。 目前，国内通用的蛋白酶活力单位定为:每分钟分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位，本实验采用Folin-Pheonl试剂法比色测定酪氨酸生成量。 [试剂与器材] 一、试剂: 1.Folin-Pheonl试剂:见实验二试剂乙(又称福林试剂)。 2.0.56M碳酸钠溶液。 3.10,三氯乙酸。 4.0.02M(pH7.5)磷酸缓冲液。 5.0.5,干酪素溶液:干酪素0.5g，以0.5mol,L NaOH lml滴湿，再加少量0.02M磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，定容于100ml，冰箱保存。 6.胰蛋白溶液:取酶0.1g溶于0.02M磷酸缓冲液100ml，冰箱保存，(稀释倍数为1000)。 7.标准酪氨酸溶液:称取100mg酪氨酸(预先在105?烘干箱烘至恒重)，加0.2mol,L 盐酸溶解后定容至100ml，再用水稀释5倍，得到200ug,ml的酪氨酸溶液。 二、器材 1.试管及试管架. 2.吸管量(1、2、5ml)。 3.721型分光光度计。 4.电热恒温水浴箱。 5.漏斗、滤纸(或离心机)。 [操作方法] 一、标推曲线的制作: 取标准酪氨酸溶液，配成不同浓度溶液(0、20、40、60、80、100μg/ml),再各取1ml， 加0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂lml，于37?水浴15分钟，在680mn波长处比色，测光密度(OD)。 680 以光密度读数为纵坐标，酪氨酸微克数为横坐标，绘制标准曲线。 见下表: 试管号 酪氨酸200μg/ml 水 酪氨酸最终浓度 (ml) (ml) μg/ml 1 0 10 0 2 1 9 20 3 2 8 40 4 3 7 60 5 4 6 80 6 5 5 100 二、样品的测定 取酶液再稀释l倍，各取1ml分别置于0、1、2号试管中，(0号试管再加入3m1 10,三氯乙酸)于37?水浴中预热3~5分钟，加入预热(37?)的干酪素2ml，准确保温15分钟后，加入10,三氯乙酸3ml(1、2号管)三支管过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55M碳酸钠 ，5ml，再加入福林试剂1ml，于37?水浴中显色15分钟，在680nm波长比色，测OD680以0号管为空白。 二、计算: 酶活力单位:在37?下每分钟水解1μg酪氨酵为一个酶活力单位。 A，F，6样品含蛋白酶活力单位= 15 式中:A—据样品OD查标准曲线得到的相应酪氨酸微克数。 680 F,酶液的最终稀释倍数。 15—反应时间(分钟)。 [注] 如果生产和科研工作中需要经常测定蛋白酶活力，则可在标准曲线制作好后，求出斜率K值，即可直接从下式求出酶活力: 蛋白酶活力(单位):样品OD×K×酶液稀释倍数 680 K值求法，在标准曲线上取100μg时光密度值，再用100除。 实验三 蛋白质分子量测定—SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 [目的] (1)学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的原理。 (2)掌握SDS—PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。 [原理] SDS—PAGE是PAGE的一种特殊形式，有关理论参看本书第一部分第八章第五节。 SDS是带负电荷的阴离子去污剂。用SDS-PAGE测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS—蛋白质复合物。因此各种蛋白质分子在SDS—PAGE中，只能按其分子量大小而分离。 SDS—PAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式、电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。 [试剂与器材] 一、试剂 1.标准蛋白质 目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS—PAGE测定未知蛋白质分子量。 (1) 高分子量标准蛋白试剂盒(Pharmacia公司产品，表22.1)。 表22.1 5种标准蛋白质 蛋白质名称 M 来源 t 甲状腺球蛋白 669 000 猪甲状腺 铁蛋白 440 000 马肺 过氧化氢酶 232 000 牛肺 乳酸脱氢酶 140 000 牛心 血清清蛋白 67 000 牛血清 (2) 低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产 (表22.2)，每种蛋白含量为40μg。同时加入200μL样品溶解，经处理后，上样 10μL(2μg)就能显示出清晰的条带。 表22.2 5种标准蛋白质 蛋白质名称 M t 磷酸化酶B 94 000 牛血清清蛋白 67 000 肌动蛋白 43 000 磷酸酐 30 000 烟草花叶病毒外壳蛋白 17 500 (3) 自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白质试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量。从中选择3一5种蛋白质，如马心细胞色素C(M12 r500)、牛胰胰凝乳蛋白原A(M 25 000)，猪胃胃蛋白酶(M35000)，鸡卵卵清蛋白(M 43 000)， rrr牛血清白蛋白(M 67 000)等蛋白，按照每种蛋白0.5一1mg/ mL样品溶解液配制。可配制r 成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 2 连续体系SDS—PAGE有关试剂 HPO?2HO 25.63g或(1) 0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液:取磷酸氢二钠(AR)Na242NaHPO?12HO 51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR) NaHPO?2HO 7.73g或NaHPO?2HO 2422422428.74g，溶于重蒸水中并定容至1000mL。 (2) 样品溶解液:0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1,SDS，1,巯基乙醇、10,甘油或40,蔗糖及0.02,溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如表22.3。 表22.3连续体系样品溶解液配制 SDS 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝 0.2mol/L磷酸盐缓冲液 加重蒸水至最后总 体积为 100mg 0.1mL 1mL 2mg 0.5mL 10mL 如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 (3) 凝胶贮液:称Acr 30g，Bis 0.8g，加重蒸水至100mL，过滤后置棕色瓶，4?贮存可用1,2个月。 (4)凝胶缓冲液:称SDS 0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100mL。4?贮存，用前，稍加温使SDS溶解。 (5) 1% TEMED:取TEMEDl mL，加重蒸水至100mL，置棕色瓶内4?贮存。 (6) 10%过硫酸铵(AP):称AP1g，加重蒸水至100mL，此液应每周新配，置棕色瓶内，4?贮存。 (7) 电极缓冲液(0.1,SDS，0.1mol,L pH7.2磷酸盐缓冲液):称SDS 1g，加500mL 0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000mL。 (8) 1,琼脂(糖):称琼脂(糖)1g，加100mL上述电极缓冲液使其溶解，4?贮存。 3.不连续体系SDS—PAGE有关试剂 (1) 10,(W/V)SDS溶液:称5g SDS，加重蒸水至50mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4?贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 (2) 1%TEMED(V/V):取1mL TEMED，加重蒸水至l 00mL，置棕色瓶中，4?贮存。 (3) 10,AP(W/V):称AP lg，加重蒸水至10mL。.最好临用前配制。 (4) 样品溶解液:内含1,SDS，1,巯基乙醇，40,蔗糖或20,甘油，0.02%溴酚蓝， 0.01mol/L pH8.0 Tris—HCl缓冲液。 ?先配制0.05mol儿pH8.0 Tris—HCl缓冲液:称Tris 0.6g，加入50mL重蒸水，再加入 约3mL 1mol/L HCI，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100mL。 ? 按表22.4配制样品溶解液。 表22.4 不连续体系样品溶解液配制* SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 0.05mol/L 加重蒸水至最后 Tris-HCl 总体积为 100mg 0.1mL 2mg 4g 2mL 10mL * 如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 (5) 凝胶贮液 ?30,分离胶贮液:配制方法与连续体系相同。称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4?贮存。 ?10,浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL。过滤后置棕色试剂瓶中，4?贮存。 (6) 凝胶缓冲液 ?分离胶缓冲液(30mol,L pH8.9 Tris—HCl缓冲液):称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCI约48mL，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100mL 4?贮存。 ?浓缩胶缓冲液(0.5mol/L pH6.7 Tris HCl缓冲液):称Tris 6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48mL调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100mL，4?贮存。 (7) 电极缓冲液(内含0.1%SDS, 0.05mol/L Tris—0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3):称Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至l 000mL。 (8) 1%琼脂(糖)溶液:称琼脂(糖)1g，加电极缓冲液100mL，加热使其溶解，4?贮存，备用。 4.固定液 取50,甲醇454mL，冰乙酸46mL混匀。 5.染色液 称考马斯亮蓝R250 0.125g, 加上述固定液250mL，过滤后应用。 6.脱色液 冰乙酸75mL，甲醇50mL，加蒸馏水定容至1000mL。 二、器材 夹心式垂直板电泳槽[凝胶模(135×100×l.5mm)]，直流稳压电源(电压300—600V，电流50—100mA)，吸量管(1，5，10mL)，烧杯(15，50，100mL)，细长头的滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器(10μL或50μL)，水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿(φ×120—160mm)。 [操作方法] 一、安装夹心式垂直板电泳槽 用细头长滴管吸取已熔化的l,琼脂(糖)溶液，封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂(糖)溶液时，应防止气泡进入.琼脂(糖)溶液用连续体系或不连续体系电极缓冲液配制。 二、配胶及凝胶板的制备 1.配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS—PAGE有连续系统及 不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表22.5和表22.6。 表22.5 SDS,不连续体系凝胶配制 试剂名称 配制20mL不同浓度分离胶所需各种试剂用量/mL 配制10mL浓缩 胶所需试剂用量 5% 7.5% 10% 15% 分离胶贮液 3.33 5.00 6.66 10.00 , 30%Acr-0.8%Bis 分离胶缓冲液 2.50 2.50 2.50 2.50 , pH8.9 Tris-HCl 浓缩胶贮液 , , , , 3.00 10%Acr-0.5%Bis 浓缩胶缓冲液 , , , , 1.25 pH6.7 Tris-HCl 10%SDS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.10 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 1.00 重蒸馏水 11.87 10.20 8.54 5.20 4.60 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 表22.6 SDS,连续体系凝胶配制 试剂名称 配制20mL不同浓度分离胶所需各种试剂用量/mL 5% 7.5% 10% 凝胶贮液30%Acr-0.8%Bis 3.33 5.00 6.66 0.2mol/L pH7.2磷酸缓冲液内含0.2%SDS 10.00 10.00 10.00 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水 4.57 2.90 1.23 混匀后，置真空干燥器中抽气10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 电极缓冲液为0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS 2.凝胶板的制备 (1)SDS—不连续体系凝胶板的制备 ?分离胶的制备:按表22.5配制20mLl0,PAA，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、 短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1mL注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水。再用滤纸条吸去多余水分。 ?浓缩胶的制备:按表22.5配制10mL3,PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20,30min。使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris—甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中。应没过短板约0.5cm以上。即可准备加样。 (2)SDS—连续体系凝胶板的制备:按表22.6配制20mL所需浓度的PAA，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加人蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置10,30min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。 三、样品的处理与加样 1.样品的处理 根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入200μL样品溶解液。自己配制标准及未知样品，按0.5—1mg,lmL样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧以免加热时迸出)，在100?沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在—10?冰箱保存较长时间，使用前在100?沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合。 2.加样 一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10一15 μL(即2一10μg蛋白)。如样品较稀，加样体积可达100μL。如样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形凝胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动 沉降在凝胶表面形成样品层。 四、电泳 分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA， 60—120min。 1.连续系统 在电极槽中倒人0.1,SDS pH7.2 0.1mol,L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA， 待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1—1.5cm处，停止电泳，一般需5—6h。 2.不连续系统 在电极槽中倒入pH8.3 Tris—HCl电极缓冲液，内含0.1,SDS即可进行电泳。在制备浓 缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需预电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDS—PAGE。开始时电流为10mA 左右，待样品进入分离胶后，改为20— 30mA，当染料前沿距硅像胶框底边l.5cm 时，停止电泳，关闭电源。 五、凝胶板剥离与固定 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶 框，用不锈钢药铲或镊子橇开短玻璃板，在 凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚 蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标 记。将凝胶 板放在大培养皿内，加入固定 液，固定过夜。 六、染色与脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右， 用蒸馏水漂洗数次，再刚脱色液脱色，直到 蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 七、绘制标准曲线 图22.1 样品及标准蛋白在连续SDS, PAG分离示意图 将大培养皿放在一张坐标纸上。量出加 样品槽1,2,4,5为待测样品，样品槽3自(,)极样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质至(+)极分别为磷酸化酶B(94000)，牛血清清样 蛋白(67000)，肌动蛋白(43000)，碳酸酐酶品区带中心与加样端的距离(cm)，如图22.1 (30000)，烟草花叶病毒(17500) 所示。按下式计算相对迁移率m: R 蛋白样品距加样端迁移距离(cm)相对迁移率m, R溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上在出其分子量。 [注意事项] (1)SDS纯度:在SDS—PAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用.重结晶方法如下:称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300mL无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏 斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至,20?冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量,20C预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40?以下的烘箱中烘干。 (2)SDS与蛋白的结合量:当SDS单体浓度在1mmol/L时，1g蛋白质可与1.4g SDS结合才能生成SDS—蛋白复合物。巯基乙醇可使蛋白质间的二硫键还原，使SDS易与蛋白质结合。样品溶解液中，SDS的浓度至少比蛋白质的量高3倍，低于这个比例，可能影响样品的迁移率，因此，SDS用量约为样品量10倍以上。此外，样品溶解液应采用低离子强度，最高不超过0.26，以保证在样品溶解液中有较多的SDS单体。在处理蛋白质样品时，每次都应在沸水浴中保温3—5min，以免有亚稳聚合物存在。 (3)凝胶浓度:应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。分子量在25000—200000的蛋白质选用终浓度为5,的凝胶，分子量在10000—70000的蛋白质选用终浓度为10,的凝胶;分子量在10000—50000的蛋白选用终浓度为15,的凝胶，在此范围内样品分子量的对数与迁移率呈直线关系。以上各种凝胶浓度其交联度都应是2.6,。 标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2—0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知 物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。 (4)对样品的要求:应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10—15μL为宜，如样品系较稀的液体状。为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。 (5)由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25,异丙醇 内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直至SDS脱尽(约需2一3天)，才可按PAGE法制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。 装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1,3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下(将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2一3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过2一3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000(又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran—2000)，红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg,mL的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。 3. 加样 要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量:l一2mL/100mL柱床容积(1—2,);制备用 量:20一30mL,100mL柱床容积。 加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处(Sephadex G—75，选用50cm液柱操作压)，打开柱上端的塞子或螺丝帽。吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子。使样品溶液流人柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连(如图2l.3)。 4(洗脱 洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水(多用于分离不带电荷的中性物质)及电解质溶液(多用于分离带电基团的样品)，如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水—甲醇，水—乙醇、水—丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。本实验洗脱用0.025mol/L氯化钾—0(2mol,L乙酸溶液。 洗脱时，打开上、下进、出口夹子，用0.025mo1/L氯化钾一0(2mol/L乙酸溶液，以每管3mL/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。 影响洗脱液流速的因素有: (1)洗脱液加在柱上的压力,—操作压(由液面差引起)，一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而 ,7.5)的凝胶时要特别注意。为保持层析过程使流速急剧下降，特别是在使用交联度小(WR 中恒定的压力，可使用恒压瓶。 (2)凝胶交联度:交联度大的凝胶(G—10至G-50型)的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。交联度小的凝胶(G—75至G—200型)的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图21.4。 (3)凝胶颗粒大小:颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。 5. 重装 一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用3—4倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装;或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需将混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。 6. 凝胶的保存方法 凝胶用完后，可用以下方法保存。 (1)膨胀状态:即在水相中保存。可按注意事项(9)，加人防腐剂或加热灭菌后于低温保存。 (2)半收缩状态:用完后用水洗净，然后再用60,一70,乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。 (3)干燥状态:用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗(则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60一80?干燥后保存。这3种方法中，以干燥状态保存为最好。 二、蛋白质分子量测定 根据待测蛋白质的分子量范围选用Sephadex G-75或G—100型凝胶，其颗粒在40—120~μm，柱管选用直径1.0—1.3cm，柱长90—100cm，本实验选用1.1×l00cm商品层析柱。 测定V和V1.0i 将0.5ml蓝色葡聚糖,2000和硫酸铵混合液(2mg,mL)上柱、洗脱，分别测出V。蓝色e葡聚糖的V即为该柱的V硫酸铵洗脱体积V减去V即为柱的V。蓝色葡聚糖的洗脱峰可e0e0i 根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用Ba(Ac)生成沉淀判断。 2 2. 标准曲线的制作 按上述方法将1mL标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol/L氯化钾—0.2mol/L乙酸溶液诜脱。流速3mL,l0min，3mL/管。用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。以管号{或 洗脱体积}为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。 )。然后，以蛋白质分子量的对数lgM 根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Vet 为纵坐标，V为横坐标，作出标准曲线(图21.5)。为了结果可靠，应以同样条件重复1一2e 次，取V的平均值作图。 e 同时根据巳测出的V和V以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的V，分别0it 求出K和K。 dav ,VV0e K, dVi V,Ve0 K, avV,Vt0 也可以K或K为横坐标，lgM为纵davt 坐标作出标准曲线。 3. 未知样品分子量的测定 完全按照标准曲线的条件操作。根据 紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体 积，重复测定1,2次，取其平均值。 也可以计算出K,分别由标准曲线查av 得样品分子量。 实验四 植物组织中DNA快速提取 [目的] 学会从植物组织中快速提取DNA的方法。 [原理] 植物组织中的核酸成分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，核酸与蛋白质结合构成核蛋白。脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白在电解溶液中溶解度明显不同，据此可将二者分离。 在0.15M氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度最低。而核糖核蛋白溶解在0.15M氯化钠溶液中。利用这一点可以使脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白分开。柠檬酸三钠盐可以作为金属离子的络合剂抑制组织中脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，通常我们用0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠溶液提取DNA，并把该溶液称之为SSC溶液。 使用阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)。为的是使DNA从脱氧核糖核蛋白中解离出来。而蛋白则变性沉淀从而得到纯净的DNA。 [试剂和器材] 一、实验材料 黄化植物幼苗 二、试剂: (1) 1×SSC溶液(0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)称取8.77克氯化钠， 4.41克柠檬酸三钠用蒸馏水定容至1000毫升。 (2) 10×SSC溶液(1.5M氯化钠，0.15M柠檬酸钠，pH7.0)称取87.7克氯化钠， 44.1克柠檬酸三钠用蒸馏水定容至1000毫升。 (3) 0.1×SSC溶液:1×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍即成。 (4) 提取液[0.45M氯化钠，0.045M柠檬酸三钠盐，0.1M四乙酸乙二胺(EDTA)， 1%十二烷基硫钠(SDS)]:称取26.31克氯化钠，13.23克柠檬酸钠，37.20克 EDTA，10克SDS，溶于800毫升蒸馏水中，以氢氧化钠pH至7定容至1000 毫升。 (5) 氯仿,异戊醇混合液:氯仿(分析纯):异戊醇(分析纯),24:1(V/V) (6) 5M高氯酸钠 (7) 95%乙醇 三、器材: (1) 天平 (2) 剪刀 (3) 研钵 (4) 量筒 (5) 三角瓶 (6) 离心机 (7) 刻度试管 (8) 恒温水浴 (9) 冰箱 (10) 温度计 [操作方法] 1( 称取室温内萌发的植物幼苗一定量(在100克以内不限量)，剪碎，放在研钵 内，加入等量(W/V)的提取缓冲液，剧烈研磨3,5分钟，使其成为浆状物 且量体积。 2( 将这一浆状物转移到一磨口三角瓶中，加入等体积的氯仿,异戊醇混合液， 塞好瓶塞，剧烈摇动30秒钟，以脱去组织蛋白质。 3( 室温下离心(4000转/分，5分钟)，形成三层，小心吸取上层含有核酸的水 溶液且量体积，弃去中间的细胞碎片，变性蛋白质层及下层的氯仿。 4( 将收集的核酸水溶液倒入一个在72?水浴中预热的试管中(并在72?下继续 保温3,4分钟，(不要超过4分钟)，以灭活组织内的DNA酶，然后迅速取 出试管放在冰水浴中冷却至室温。 5( 加入5M浓度的高氯酸钠溶液(4:1体积比)使溶液中高氯酸钠的最终浓度为 1M。 6( 再次加人等体积的氯仿一异戊醇混合液，并在带塞的三角瓶中摇晃20秒钟。 7( 将此乳浊液在室温下离心(4000转/分，5分钟)，收集上层含核酸的水溶液量 其体积( 8( 将收集的核酸水溶液置于烧杯内，然后用滴管慢慢加入此水溶液二倍体积的 95,的预冷的乙醇于水溶液表面上，用玻璃棒轻轻搅拌，此时核酸将迅速以 纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 9( 将沉淀物在烧杯壁上轻轻挤压以除去乙醇，然后溶解在适量的0.1×SSC溶液 中(待完全溶解后，加入此溶液十分之一体积的1×SSC，使最终的溶液为1 ×SSC。 10( 按照8的步骤，再次用乙醇沉淀核酸(并且按9的步骤将核酸溶解，即得到 DNA的粗制品。 11( 加入预先处理过的RNA酶溶液使其最后作用浓度为50-70毫克,毫升，并在 37?下保温30分钟以除去RNA。 12( 加入等体积的氯仿—异戊醇溶液，在三角瓶中摇晃30秒钟，再次除去残留蛋 白质及所加的RNA酶。然后以前述方法离心并收集上层水溶液。 13( 按照8的步骤再次沉淀DNA，并按照9的步骤将其溶解，即可得到纯化的 DNA溶液。 [结果测定] 以l×SSC为空白对照，分别在230nm，260nm和280nm波长处测定样品的光密度值， 且求出260nm,230nm及260nm,280nm的比值，如果前者的比值大于2，后者的比值大于 1.8的话，那么此样品就可以作为生化试剂用。否则要继续去蛋白。 [思考题] 1.在沉淀DNA时，为什么自溶剂内加入二倍体积的95,的预冷乙醇? 2.此方法的实际意义何在? 实验五 脂肪酸价的测定 [目的] 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法 了解测定酸价的实际意义。 [原理] 脂肪及油类在空气中暴露较久之后，部分脂肪的氧化成游离脂肪酸及醛类，某些低级脂肪酸(如丁酸)及醛类都有酸臭味，这种现象叫酸败。因此测定脂肪中游离脂肪酸的含量是检查脂肪质量的主要指标之一，食品工业中用酸价来表示油脂食物的新鲜，优劣程度，酸价就是中和一克脂肪所需的氢氧化钾毫克数(也称作酸值)。脂肪中游离脂肪酸含量越高，酸值越大，脂肪的质量越差。 采用酸碱中和滴定原理进行测定。 [试剂和器材] 一、试剂 I(乙醇乙醚混合液(1:1)，调成中性。 2(2,酚酞指示剂 3(0.lmol,L KOH标准溶液 4(豆油 二、器材: 1(锥形瓶(250m1)(干燥) 2(碱式滴定管(5ml) 3(量筒 4(滴定台 [操作方法] 用差数法准确称取油样3g二份，分别放于锥形瓶中，另取一锥形瓶不加油样作为空白，在三个瓶中各加50 m1乙醇乙醚混合液，摇匀，得透明溶液，加入1%酚酞指示剂1—2滴，用0.1mol,LKOH溶液滴定至溶液呈粉红色为止(持续半分钟不褪色)，按下式求算酸值。 氢氧化钠滴定毫升数，M，56 酸值, 油样重(g) M为KOH标准溶液摩尔浓度 实验六 维生素C的定量测定 [目的] 1. 学习定量测定维生素C的原理和方法。 2. 进一步掌握滴定法的基本操作技术。 3. 了解蔬菜、水果中维生素C的含量。 [原理] 维生意C是人类营养中量重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏 血酸，它为L系糖构型的不饱和多羟化合物，易溶于水，属于水溶性维生素。维生素C分 布很广，植物的绿色部分及许多水果(桔、山楂、草莓等)的含量更为丰富。 维生素C具有很强的还原性，在微酸性环境中，抗坏血酸能将染料2，6一二氯酚靛 酚还原成无色的还原型2，3一二氯酚靛酚同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。 O CClCl+HOC ONO+OONOH-OHOC 兰色ClClHC HHOC CHOH2 抗坏血酸 2，6,二氯酚靛酚(红色) O CCl OCHO+HONOH OC ClHC HOCH OHCH2 脱氢抗坏血酸 还原型2，6,二氯酚靛酚(无色) 当溶液由无色转变成微红色时。表示溶液中抗坏血酸全部被氧化，即为滴定终点。从滴定时消耗2，6,二氯酚靛酚标准溶液的量，可计算出被检物中抗坏血酸含量。 由于抗坏血酸极易氧化，所以提取时，加入草酸，三氯乙酸，盐酸等抑制维生素C氧 化酶的活力。 [试剂和器材] 一、试剂: 1. 桔皮、水果或蔬菜。 2. 抗坏血酸标准液(1ml?lmgVC):精确称取纯抗坏血酸l00mg，用1,草酸溶解，定容至100ml。 3. 0.00lmol,L 2，6,二氯酚靛酚溶液:称取2，6一二氯酚靛酚50mg溶于150ml热水中(内含碳酸氢钠42mg)冷却后定容至200ml，盛于棕色瓶中于冰箱保存。使用前用抗坏血酸标准溶液标定其浓度，方法如下: 准确吸取抗坏血酸标准液2ml，加2%草酸2ml，用上述2，6,二氯酚靛酚溶液滴定 至微红色从消耗的滴定量计算2，6,二氯酚靛酚的浓度，最后将其调至每ml相当于抗坏 血酸0.088mg。 4. 2,草酸。 5. 1,草酸。 二、器材: 1. 吸量管(5m1)。 2. 容量瓶(100ml)。 3. 微量滴定管(5ml)。 4. 漏斗、滤纸。 5. 锥形瓶。 6. 玻璃棒。 7. 匀浆器(或组织捣碎机)。 8. 分析天平。 9. 烧杯100ml。 10.量筒100ml。 [操作方法] 1. 准确称取样品(蔬菜或水果)20g与2,草酸溶液20ml一同放入匀浆器内搅成匀浆。 2. 将上述匀浆倾入l00ml容量瓶，以1,萆酸溶液定容。 3. 充分混匀后过滤、取滤液。 4. 吸取滤液5ml于锥形瓶内，以0.001mol,L 2，6一二氯酚靛酚滴定，边滴边搅拌， 至粉红色出现面能在15秒钟不褪色为止，记录滴定量，按下式计算样品VC含量。 0.088，V，100，100 100g样品中所含抗坏血酸毫克数, 5，W 式中:V,0.001mol,L 2，6一二氯酚靛酚的滴定量(ml)。 W,称取的样品量(g)。 [注] 1. 该法简便易行，但有下列缺点: 1)在生物组织内和组织提取物内.抗坏血酸还能以膛氢抗坏血酸及鲒合抗坏血酸的形式存在。它们同样地具有抗坏血酸的生理作用，但不能将2，6,二氯酚靛酚还原脱色。 2)生物组织提取物中常含有其他还原性物质:也可使2，6一二氯酚靛酚脱色，消除缓解的方法是滴定时速度尽量快一些，因这些物质还原能力较VC弱。 3)在生物组织提取物中，常有色素物质存在，给滴定终点的观察造成困难，方法是先用白陶土将提取液脱色。 2+2+ 2. 若样品中含有大量的Fe，可用8,醋酸作提取液，如仍用草酸为提取剂，Fe以还 2+原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe不会很快与染料起作用。 3. 如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。 实验七 总糖和还原糖的测定,3，5,二硝基水杨酸法 [目的] 1( 掌握3，5,二硝基水杨酸比色法定糖的原理和方法。 2( 熟练分光光度计的使用。 [原理] 糖的测定有物理和化学的两类，物理方法有测定其折光率，比旋光度的变化，也可以利用比重计进行测定，比较精确和常用的化学测定法。 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法，还原糖就是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原性糖，双糖和多糖不一定都是还原糖。利用单、双糖与多糖的溶解不同可以把它们分开，并且可以用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，这样就可以分别求样品中总糖和还原糖的量。 本实验是利用3，5,二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量和棕红色物质颜色的深浅程度成一定比例关系，可以用分光光度计进行测定。 [试剂和器材] 四、试剂: 1( 3,5,二硝基水杨酸试剂(DNS):6.3g DNS和262ml 2mol/L NaOH。加到 500ml含有18.2g一酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸 钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml贮于棕色瓶中。 2( 1000μg/ml葡萄糖标准溶液，准确称取干燥恒重的葡萄糖1g,加少许溶解后 再加3ml 12N盐酸，以蒸馏水定容至1000ml。 3( 6mol/L NaOH 4( 6mol/L HCI 5( 碘试剂 6( 酚酞指示剂 二、器材: 1(试管及试管架、试管夹。 2(吸量管(1，5，10ml)。 3( 水浴锅。 4( 容量瓶(100ml)。 5( 玻璃漏斗(6cm)。 6( 量筒(10、100ml)。 7( 721型分光光度计。 8( 烧杯200ml。 9( 台秤(0.01g感量)。 [操作方法] 一、标准曲线的制作: 取试管5支，按表加入1000μg/ml标准葡萄糖溶液及蒸馏水，得到100μg/ml至800 μg/ml标准葡萄糖溶液。 分别吸取上述不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，DNS试剂0.5ml，混合均匀，在沸水浴上 加热5分钟，取出后用冷水冷却，每管再加入4ml蒸馏水稀释，最后在721型分光光 度计上以540nm比色测出光密度值(OD)另做一空白试验即用蒸馏水代替葡萄糖，其他试剂相同。 O(ml) 葡萄糖最终浓度 管 号 1000μg/ml 葡萄糖标准液 H2 1 1 9 100 2 2 8 200 3 4 6 400 4 6 4 600 5 8 2 800 以葡萄糖含量(μg)，为横坐标以OD值为纵坐标。作出葡萄糖的标准曲线。 二、土豆粉中还原糖和总糖的测定: 1( 样品中还原糖的提取，称取山芋粉0.50g,于三角瓶中，先以少量水调成糊状，再加 50~60ml水摇匀后，50?保温20分钟，使还原糖浸出，定容到100ml，过滤取滤液 测还原糖。 2( 样品中总糖的水解和提取，称取山芋粉0.50g，于锥形瓶中，加入6mol/L NaOH调 PH至中性，并定容至100ml，过滤，取滤液10ml,稀释至10ml,待用。 3( 定糖:取上述还原糖和总糖的提取液0.5ml,加入DNS试剂0.5ml与标准曲线制作时 用同样处理。据样品所测得的OD值，在标准曲线上查出还原糖量，并按下式计算 出山芋粉中还原糖和总糖的百分量。 还原糖的微克数-2 还原糖(%),×10 样品重(g) 水解后还原糖的微克数-2 总糖(%),×10×0.9 样品重(g)