莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究

莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 摘 要 目的:以初步建立的莱克多巴胺胶体金试纸条生产流程为基础,优化胶体金 生产工艺过程中各环节,包括金溶液制备、金标偶联物制备、硝酸纤维膜处理及 保存条件设置等,建立可产业化的莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺。 :采用单因素法,通过改变反应时间及柠檬酸三钠浓度对应用柠檬酸三 钠还原法制备单分散性胶体金工艺进行优化,并在可见光分光光度计 (400~700nm)和扫描电镜下观察金颗粒均一性及分散性。以 RAC 抗体不同的 稀释倍数和偶联时间为条件优化纳米金与 RAC抗体偶联。在 37?和 55?下实现 硝酸纤维素膜干燥处理,观察 5 天内 NC 膜上 RAC 抗原与羊抗鼠二抗的固定情 况。胶体金试纸条在 37?下加速老化,以 3 组(未处理、热处理、冷冻处理) 常温保存为对照组。综合以上最优条件进行重复性实验 3次,对比不同批次胶体 金试纸条的差异性。 结果:当柠檬酸三钠浓度为 5%,反应时间为 20min,能够得到颗粒粒径集 中,单一分散性好的胶体金溶液。纳米金与 RAC抗体偶联时,偶联时间 30min, 抗体稀释 15倍时能够达到最好的偶联效果。硝酸纤维素膜在 37?况下需干燥 4~5 天时间能达到稳定状态,而 55?下只需干燥 3 天时间即可。老化实验结果表明 在常温下无论是否处理,在 6 个月内试纸条非常稳定,而 37?下 3 个月内试纸 条的效果没有明显变化,当时间延长至 6个月,试纸条的质量略有下降,灵敏度 降至 10ng/ml。在 3 次的重复实验结果表明,不同批次的组装的胶体金试纸条结 果存在差异性,但差异并不显著。 结论:本研究完善了整个莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺流程,包括金溶 液的制备,金标复合物的制备,NC膜处理,最终通过老化实验表明试纸条保质 期至少为 1年,而不同批次的胶体金试纸条差异不显著,具有良好的重复性及稳 定性。 关键词:莱克多巴胺(RAC),胶体金,偶联,硝酸纤维素膜,老化 I暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 Abstract Objectives: Improving colloidal gold production process bases on the existing production process of colloidal gold strip of ractopamine,including the preparation of gold solution, gold conjugate preparation, nitrocellulose membrane treatment and shelf life.To achieve the similar quality in multi-batch productions, and then has good shelf lifeMethods: To adopt single factor test when preparing colloidal gold solution, change the reaction time and concentration of sodium citrate, and we observe the dispersion and uniformity of gold particles by using visible light spectrophotometer 400 ~ 700nm and scanning electron microscopy. In process of gold nanoparticle combining with RAC antibody, we design five different dilutions and coupling time as conditions.Then choose the best coupling conditions according to experiments aboveNitrocellulose membrane are drying at 37 ? and 55?,then compare the effect of antigen and secondary antibody in five days.Contrasting with 3 groups which storage at room temperature, the aging experiment is chosen at 37?. Types of processing in 3 groups are untreated, heat treatment, freezing.At last, to repeat experiments 3 times, all conditions are base on best results that improved above.Observe the difference effect of final assembly of test tripResults: When concentration of sodium citrate is 5% and reaction time is about 20min we can obtain colloidal gold solution with centralized size particle,single and good dispersion.The best conditions for RAC antibody conjugating with gold nanoparticles are that 30 mimutes or more for coupling time and more than 15-fold diluted antibody.Under the temprature of 37?, it costs 4 to 5 days to reach a steady state on nitrocellulose membrane,but at 55? it costs 3 days only.The aging experiments show that colloidal gold test trips whether they are treated or not can be stability in 6 months at room temperature.And effection of test trips store at 37? don’t change significantly. But the time extende to 6 months, the quality of the strip has dropped, the sensitivity increased to 10ng/ml. The results show that the different effection between multi-batch test trips still exist, but the difference was not II暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 conspicuous, and no effect on sensitivityConclusions: This study is to consummate the manufacturing process of colloidal gold test trip of ractopamine, including preparation of gold solution, complex gold-nanoparticles with RAC antibody, NC membrane treatment, and ultimately through the acceleration test we will know how long the test trips can be storedBetween products there is non-significant differences and all products are in good repeatability and stabilityKey words: ractopamine, colloidal gold, coupling, nitrocellulose membrane, aging III暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 目 录 摘 要 I Abstract. II 目 录IV 英文缩写符号说明. VII 第一部分 绪论1 1研究背景 1 1.1 兽药及兽药的残留现状 1 1.2 兽药残留的危害3 1.2.1一般毒性作用 3 1.2.2特殊性毒性作用3 1.2.3激素(样)作用4 1.3 兽药残留的原因及控制 4 1.3.1 兽药残留原因4 1.3.2 兽药残留控制4 2 莱克多巴胺(RAC)简介. 5 2.1 莱克多巴胺结构与性质 5 2.2莱克多巴胺(RAC)功能作用 5 2.3 莱克多巴胺(RAC)毒性. 6 3 当前检测RAC的主要检测方法. 7 3.1 高压液相色谱法7 3.2 液相色谱-质谱连用(LC-MS) 7 3.3高效毛细管电泳法(HPCE)8 3.4 酶联免疫吸附法8 3.5 免疫传感器技术9 3.6 胶体金免疫层析试纸法 9 4胶体金免疫层析技术现状及应用. 9 4.1 胶体金发展历史9 4.2 胶体金的性质与制备. 10 IV暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 4.3 胶体金蛋白偶联物的制备 12 4.4 胶体金免疫层析技术. 13 5 研究的目的和意义 14 第二部分 材料与方法 16 1 试剂材料与仪器 16 1.1 主要试剂及材料 16 1.2 主要仪器设备. 17 1.3 主要溶液的配制 17 2 实验方法 18 [38] 2.1 胶体金溶液的制备. 18 2.1.1 加热时间对胶体金制备的影响. 18 2.1.2 柠檬酸三钠浓度对胶体金制备的影响. 18 2.1.3反应物不同添加顺序对胶体金制备的影响. 19 2.2 胶体金蛋白偶联物的制备 19 2.2.1标记抗体稀释度实验19 2.2.2 标记时间实验 19 2.3 硝酸纤维素膜NC干燥实验20 2.3.1 样品垫预处理 20 2.3.2 金标垫处理. 20 2.3.3 NC膜处理. 20 2.3.4 试纸条组装. 20 2.3.5 NC膜稳定性测试. 21 2.4 胶体金试纸条加速老化实验21 2.4.1 胶体金溶液制备21 2.4.2 RAC抗体与金偶联物的制备21 2.4.3 NC膜处理. 21 2.4.4 加速老化实验 21 2.5 生产稳定性实验 22 2.5.1 胶体金溶液多批次制备 22 2.5.2 RAC抗体偶联物多批次制备22 V暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 2.5.3 NC膜多批次处理. 22 2.5.4 多批次间差异对比22 2.6 其他同类试纸条对比. 23 第三部分 结果与讨论 24 1胶体金溶液的制备结果图. 24 1.1 加热时间对胶体金的影响 24 1.2 柠檬酸三钠浓度对胶体金制备的影响24 1.3反应物不同添加顺序对胶体金制备的影响. 25 2 RAC抗体与胶体金偶联物的制备26 2.1 RAC抗体稀释度对偶联的影响26 2.2 偶联时间的影响 27 3 硝酸纤维膜NC干燥实验. 28 4 胶体金试纸条加速老化实验 30 5 稳定性实验32 6 其他同类试纸条对比结果. 33 第四部分 结论 35 参考文献36 在读期间发表论文和学术交流情况:. 39 致谢. 40 VI暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 英文缩写符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 RAC Ract op a mine 莱克多巴胺CL Clenbuterol 盐酸克伦特罗 BSABov ine Serum Albumin 牛血清白蛋白 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附测定法 ICAImm unoch romatographic Assay 胶体金免疫层析法 PBS Phosphate Buffer Sodium 磷酸盐缓冲液 IgGImm unog l o b u li n G免疫球蛋白 G LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry 液相色谱串联质谱 HPCE high performance capillary electrophoresis 高效毛细管电泳 GICA Gold immuno-chromatographic assay 胶体金免疫层析技术 DIGFA Dot immunogold filtration assay 快速免疫金渗滤法 NC nitrocellulose membranes 硝酸纤维素膜 PVP Polyvinylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 PVC Polyvinylchloride 聚氯乙烯 rpmRotate p e r m i nu te 转每分钟 h, min Hou r, m inu t e 小时,分钟 g, mg, μg Gr am , m ill ig ra m , m ic r og ram 克,毫克, 微克 ng, pg Na n og ra m , pict og ra m 纳克,皮克 L, mL, μL L ite r, m il lil it e r, microliter 升,毫升,微升 VII暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 第一部分 绪论 近年来,国内外频繁发生食品污染及食物中毒事件。食品质量安全关系 到人民群众身体健康和生命安全,关系到经济发展和社会稳定,是一个国家 [l] 经济发展水平和人民生活质量的重要标志 。在我国,食品安全问题同样是阻 碍经济发展,困扰民生的重大问题。这关系到广大人民群众的身体健康和生 [2] 命安全,关系到经济发展和社会稳定,关系到政府和国家的形象 。2009 年 农夫山泉的“砒霜门”事件,2010 年“地沟油”事件、“麦乐鸡”事件、海 南“毒豇豆”事件、金浩茶油“致癌门”、三聚氰胺超标奶粉事件“卷土门” [3] 和圣元“早熟门”等等 。当前,食品安全问题已经成为社会关注的热点, 成为民生问题中的重中之重,不容忽视。 在我国经济水平不断提高及生活质量不断改善的大环境下,人民的膳食 结构也不断发生着变化,肉、蛋、乳和水产品等动物源性食品所占的比例在 不断增加。为了满足人类对动物性产品需求的不断增长及现代养殖业日益发 展,兽药及饲料添加剂在防治疫病、促进畜禽生长、增加体重、提高饲料利 用率等方面得到了广泛的应用。但是,由于兽药及一些添加成分被畜禽机体 吸收后不能完全排出体外,蓄积在畜禽体内包括肌肉和内脏, 形成残留对人 [4] 类健康造成了威胁 。因而,动物性食品中含有不同程度的兽药残留的同时, 伴随而来的是对国民健康和社会环境存在的潜在危害。因此,动物源性食品 的兽药残留导致的食物中毒问题,成为人们关注的食品安全问题的重要方 面。目前,各个国家相继成立了各种组织,对市场上的农牧产品,无论是本 国还是进口产品都设置兽药残留的最高残留限量。同时,不断推陈出新 的各种食品添加剂残留的检测方法,实现对动物源性食品中兽药残留的有效 监控。我国也积极开展了对动物性食品中兽药残留的监测、检查工作,提高 对各种违法犯罪行为的打击力度。 1 研究背景 1.1 兽药及兽药的残留现状 兽药,是指用于诊断、防治动物疾病或者具有目的性地调节动物生理机能 的物质,包含饲料中添加的各种药物。从更广泛的角度来理解的兽药还包括了能 1暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 影响机体各器官正常生理功能或细胞代谢活动的化学物质以及具有某些功效的 动物保健品或饲料添加剂。目前兽药主要用于防治疾病、加快动物生长、改善动 物性食品的品质、提高饲料利用率等。但是,兽药的使用在带来巨大利益的同时, 也产生了不可忽视的负面作用,如污染环境,造成大量耐药菌株的产生,降低动 物的抗病能力。此外,动物组织中或者环境中的兽药残留对人体健康都具有潜在 危害。尤其是一些无良商贩,为了获得更大的经济利益,漠视人民的健康安全, 过量使用兽药添加剂,导致食品中兽药的大量残留,给人类的健康造成极大的危 害。 [7] 目前危害畜禽产品质量安全的兽药残留主要有 5 大类 :?激素和 β- 兴奋剂类:养殖业中使用较多的激素类药物包括性激素类和皮质激素类,β- 兴奋剂则主要以盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等,统称为“瘦肉精”。 ?抗生素类。包括耳毒性抗生素、氨基甙类抗生素、头孢唑啉、过敏反应抗 生素。其中耳毒性抗生素是使用最普遍的抗生素之一。部分抗生素具有抗菌 作用,其中包括磺胺类药物、呋喃类药物、硝基类药物、喹?啉类药物等。 而喹?啉类药物因具有优良的抗菌与促生长作用,曾被世界各国广泛用作畜 禽饲料药物添加剂。?氟喹诺酮类药物。氟喹诺酮类药物在人医和兽医临床 上广泛使用,如诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星等。?杀虫剂, 包括有机氯杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、杀虫脒(克死螨)与双甲脒、五 氯酚钠等。?抗病毒药物如病毒灵、病毒唑、盐酸金刚烷胺等,现已在畜禽 中全面禁止。 在我国,由于国民对动物源性食品的品质及种类需求不断改变,促使畜牧 养殖业的快速发展,但随之而来的是兽药残留引发的一件件触目惊心的中毒事 件,其中最为突出且影响范围最大的莫过于肉制品中“瘦肉精”的大量残留。从 1998 年起,我国各地都相继发生过多起因兽药残留而引发的不同程度的中毒事 件。如 2001年浙江省杭州市 60多人到医院就诊,症状为心慌、心跳加快、手颤、 [5] 头晕、头痛等,诊断结果确认为食用还有超标“瘦肉精”残留的猪肉 。接着在 2003 年广西等地发生氯霉素残留事件。2006 年 9 月,上海连续发生 300 多人集 [6] 体“瘦肉精”中毒事件,自此“瘦肉精”引起了越来越多消费者的关注与担忧 。 2009 年 2 月 19 日,广州市卫生局分别接到天河、增城两区共有 11起因吃猪内 2暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 脏引起腹痛、腹泻报告,涉及 67 人。经疾控部门实验室检验,确认因瘦肉精引 起。据广东省兽药监察所提供的一份报告说,广州市去年初对待宰生猪进行抽检, 盐酸克伦特罗残留阳性率高达 59.4%,广州近郊及顺德、增城、博罗和四会等地 查出非法大量生产出售含盐酸克伦特罗的饲料添加剂。2011 年河南双汇“瘦肉 精”事件再次敲响了食品安全问题的警钟。 1.2 兽药残留的危害 1.2.1一般毒性作用 抗生素类药物具有较强的毒副作用,危害最多的是引起儿童听力下降甚至 失聪。而一些抗菌类的抗生素,如磺胺类和呋喃类等药物则会破坏人的造血系统, 引发一系列与血液相关的疾病。与此相比,杀虫剂类的药物进入人体后容易毒害 神经中枢及一些正常细胞活动,严重时引发不可逆转的病变。除了抗菌药物外, 抗病毒药物的使用同样对人体造成危害,如病毒唑可引起心、肺、肾等器官发生 病变,死亡率达到 20%以上。 “瘦肉精”作为一种β2-受体兴奋剂,添加到饲料中,能够增加瘦肉率, 即现在市场上销售的所谓“健美猪”。但只有兽药添加的剂量达到人用药剂量的 10 倍甚至更高时,才能显著提高瘦肉率。而人过量食用含有大量残留瘦肉精的 肉类所表现出来的中毒症状包括:面颈、四肢肌肉颤动,心律失常,心悸,血压 升高,口干,四肢无力,甲状腺功能亢进。 1.2.2特殊性毒性作用 特殊毒性作用包括致癌、致畸、致突变(三致作用)和生殖毒性作用。当 人们长期食用含有能够引起三致作用的药物残留的动物食品时,这些兽药进入人 体内便会对人体产生毒害作用,或在人体中蓄积,最终使细胞发生癌变,肿瘤 增 生,机体损伤并引发各种并发症。许多国家认为,在人的食物中不能允许含有任 何已知致癌物。对曾用具有致癌毒性的药物进行治疗或饲喂过的食品动物,屠宰 时其食用组织中规定不允许有致癌物的残留。当人们长期食用含这些药物残留的 动物性食品时,这些有害的残留物便会影响人体的健康,有些药物则会在人体中 蓄积,最终产生“三致”作用。近年来人群中肿瘤发生率不断升高,人们怀疑与 [8] 环境污染及动物性食品中药物残留有关 。 3暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 1.2.3激素(样)作用 天然或人工合成的性激素,如常见的孕酮、睾酮、乙烯雌酚等,这些激素 类的添加剂都可以加快动物发育成长,提高饲料利用率。市场上许多不法商家大 剂量在肌肉深部注射,从而形成药物残留,最终会引起激素(样)作用。近年来 频繁发生的儿童早熟、发育异常,都是因为食品中含有过量激素类添加剂,在体 内积聚而引发的症状。 1.3 兽药残留的原因及控制 1.3.1 兽药残留原因 兽药残留主要有以下几个方面原因引起:1 预防各种动物疾病。有的养 殖场或专业户,缺乏对兽药的安全使用及药物残留的相关知识,为避免自身利益 损失而盲目使用兽药,并且没有明确的停药期,甚至有的养殖户在出栏前继续喂 养含有兽药的饲料,这终将导致动物组织器官中含有大量的兽药残留; 2 非 法分子的唯利是图,违规违法滥用兽药;3 监管体制不完善, 检测标准不健全 [9] 。 1.3.2 兽药残留控制 近年来由于兽药残留引发的食物中毒事件屡见不鲜,使得动物源性食品中 的兽药残留问题越来越成为全球普遍关注的焦点。国际组织和一些国家政府纷纷 出台各种控制食品中的药物残留法律法规,确保人们的健康安全,尤其是西方发 达国家出台了关于兽药添加剂使用的更严格的限制措施,美国及欧盟各成员国已 经开始实施国家残留监控,定期向社会公布市场监测结果。1997 年,我国 [10] 农业部发布了《关于严禁非法使用兽药的》 。2002 年 3 月,国家农业部 发布了《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》,其中β-激动剂被列为第一种 [11] 禁用的药物 。目前,有关部门已经制订了各种监控兽药残留的法律法规,修订 了《动物性食品兽药残留最高限量标准》,建立全国范围的兽药残留监控体系, 改进了对食品中兽药残留的方法和技术,在完善传统的仪器检测方法的同 时,不断研究开发简单、准确和灵敏度高的快速检测手段,以更好的实现对兽药 残留的实时监控。 4暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 2 莱克多巴胺(RAC)简介 2.1 莱克多巴胺结构与性质 莱克多巴胺Ractopamine,缩写 RAC,又名雷托帕明、舒喘灵、权莱克、 金来多巴,化学名称为 1-(4-羟基苯基)-2[1-甲基-3-(4-羟基苯基)-丙氨基]- [12] 乙醇 ,属于苯基乙醇胺类,化学结构如图 1-1 所示。分子式为 C H NO Cl , 18 23 3 分 子 量为 337.83 ,可溶于水,微溶于丙酮,可溶于乙醇,PH 值:6~7, 呈中性,熔点:159.8?。 图 1-1莱克多巴胺的化学结构式 Fig.1-1 Chemical structures of Ractopamine 市场销售的莱克多巴胺为其盐酸盐,以 4 种异构体混合物形式存在,称为 盐酸莱克多巴胺RAC.HCI,分子式为 C H O H?HCl,分子量为 337.83,呈 18 23 3 白色粉末状,常温下暴露在空气中性质稳定,微溶于丙酮,易溶于甲醇、乙醇 等 有机溶剂,溶液成中性,pH6~7.0。在 RAC?HCl的分子结构中,仲氨基和酚轻 基是进行化学反应和结构修饰的活性部位,乙醇胺基是与β -受体结合的有 效部 2 [13] 位 。 2.2莱克多巴胺(RAC)功能作用 莱克多巴胺作为 β -受体兴奋剂,对体内代谢的作用较强,能降低脂肪的 2 生成和促进脂肪的分解,促进蛋白质合成并减少其降解;还能促进胰岛素的 释放,使糖原分解增加,因此能利用合成脂肪的能量和成分来增加蛋白质的 合成。有研究表明,当动物食用的饲料中莱克多巴胺的添加量为临床治疗剂 量的 5~10 倍时,莱克多巴胺能使动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移, [14] 表现为营养“再分配效应”,能够显著增加机体瘦肉率,提高饲料转化率 。 现在认为 RAC 作用的机制普遍认为是其与 β2 一受体结合引起受体兴 5暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 奋,激活后的腺普酸环化酶可合成 cMAP,它能作为第二信,在组织细胞中 触发一系列生化反应,从而达到营养再分配的目的。有研究表明,RAC 会引 起肌肉组织中 RNA/DNA代表 DNA 转录活性比值显著上升,同时检测发现 组织中的 cMAP 浓度也同样有显著增加,这现象表明 cMAP 能促进基因转录 和翻译过程,并加快蛋白质合成过程,使肌肉组织中蛋白质合成量大幅度提 + 高,从而实现营养的再分配。另外,RAC 表现为能增强猪股二头肌中 Na , + + + K -ATPase 活性,提高细胞内外 Na , K 梯度,促进氨基酸转运进入细胞内, [15] 为蛋白质合成提供更多底物 。cAMP 浓度的增加还降低了肌肉和肝脏细胞 + [16] 内 Ca2 浓度,可减缓肌肉蛋白的降解 。同时 RAC 可能与细胞膜上 β -受 体 2 结合,使皮下脂肪中 cMAP 含量显著增加,进而通过 cMAP 刺激脂肪分解, [17] 抑制脂肪合成 。 2.3 莱克多巴胺(RAC)毒性 β-兴奋剂的作用机理是与组织细胞如血管平滑肌、细支气管平滑肌的β 受体结合,激活细胞膜上的腺昔酸环化酶,引起细胞产生一系列变化,导致 气管、支气管平滑肌松弛,骨骼肌收缩,血管平滑肌松弛,过敏介质释放减 少,并增加呼吸道纤毛运动,因此可用于治疗肌肉萎缩症,增长肌肉,减少 [18] 脂肪蓄积,并对胎儿和新生儿生长有益 。 美国 FDA 设定的人每日最大摄入量(ADI)为 1.25 g/kg,推算出的组织 中药物残留最高限量为肌肉中 0.25ppm,脂肪 1.5ppm,肾脏 1.5ppm,肝脏 [19] 0.75ppm,同时设定莱克多巴胺的休药期为 0 天,即上市前无须休药期 。畜 禽肌肉组 织中的药物残,其中肝 、肺组织中残 留量较高,能达到 100~500ng/g,人一次摄入残留为 100~200ng/g 的动物组织后,可能出现副 反应或其他危险。动物也往往因吃进过量药物发生中毒,表现为肌肉震颤、 [20] 剧烈腹痛、心跳和呼吸加快,最终死亡 目前,除了美国批准其为猪饲料添加剂外,欧盟和我国已禁止使用。 1997 年以来,我国农业部等相关部门多次发文,包括农业部第 958 号公告 -4-2007 以及农业部第 1031 号公告-3-2008,都禁止生产和使用“瘦肉精”, 但非法使用的报道还不断出现。 6暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 3 当前检测 RAC的主要检测方法 目前 RAC的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等。色谱技术为经典 技术,主要有高效液相色谱(HPLC),高效液相色谱/荧光(HPLC/FLD),液相 色谱-质谱连用(LC-MS),气相色谱-质谱连用(GC-MS),高效毛细管电泳 (HPCE) 等方法。免疫分析技术主要有酶免疫技术、免疫生物传感器技术、金标免疫 层析 技术及新兴的生物芯片技术。 表1 RAC的主要检测方法比较 Table1 Comparison of the major detection methods of Ractopamine 方法 优点 缺点 最低检测限 1ng/mL 高压液相色谱 灵敏度高 操作困难、耗时 LC-MS 灵敏度高 操作困难、耗时 0.2 ng/mL 可分离不同立体 灵敏度不高、操作 HPCE 50 ng/mL 构型的 RAC 困难 灵敏度高、特异性 酶联免疫吸附法 稳定性有待提高 最低可达 pg级 强,方便快捷 操作简单、快速、 3~5 ng/mL 胶体金免疫层析 灵敏度低 廉价 3.1 高压液相色谱法 [21] -1 应永飞等用高效液相色谱法测定动物尿样中的RAC ,在20~500?g?L -1 范围内具有良好线性关系,检出限为10?g?L ,回收率比较稳定,平均回收率 可达到84.2%以上。 申屠芬琴等建立了猪肝脏、肾脏、肌肉和脂肪中盐酸RAC的高效液相色谱检 [22] -1 -1 测方法 。方法的检测限为1ng?g ,定量限为2ng?g ,在不同部位的回收率 有一定的差异,如肌肉的平均回收率为80.7~82.5%,而脂肪的平均回收率只 有 73.3~78.8%。 3.2 液相色谱-质谱连用(LC-MS) 原理样品用盐酸葡萄糖醛苷酶或芳基硫酸酯酶在pH5.2 的缓冲液中消化, 萃 取液用MCX 小柱固相萃取净化,分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙 酰胺 7暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 (BSTFA)衍生后,用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。 [23] 臧勇军等 建立了液相色谱-质谱法(LC-MS)同时测定肉类中RAC与CL残 留的方法:用乙腈-盐酸溶液提取试样中的RAC与CL,然后旋转蒸干,用甲醇溶 解后进行液相色谱-质谱法测定。肉类中RAC与CL的定量检出限均分别为 -1 -1 与0.5?g?kg 。 0.2?g?kg 3.3高效毛细管电泳法(HPCE) 高效毛细管电泳法指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中 各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。HPCE所 用的石英毛细管柱,在pH3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电 层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的 现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流EOF两种 速度的矢量和,正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出; 中性粒子的电泳流 速度为“零”,故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向 相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故它将在中性粒子之后流出,从而 因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 马健等建立了高效毛细管电泳测定猪尿中RAC残留量的方法。在醋酸-醋酸 -1 钠(pH5.04)运行缓冲液环境下, RAC能得到完全分离。最低检测限为0.05?g? ml , [24] 回收率达到82.0~94.3% 。 3.4 酶联免疫吸附法 ELISA试剂盒是以抗原抗体的特异性、可逆性反应为基本原理,主要采用直 接竞争模式,即在96孔板上包被RAC抗体,随后加入两种抗原,一种是没有酶标 的样品中的抗原,另外一种是酶标的RAC抗原。同时竞争96孔板上有限的Ab表 位,待反应结束后洗去多余的抗原并用辣根过氧化物酶显色,进而定量检测RAC 在样本中的含量。ELISA法避免了RAC存在的稳定性问题,更加简便、灵敏,检 测下限达到pg级,且能同时检测多数样品,是十分理想的快速筛选手段,缺 点在 于出现假阳性的概率较大,易引起误判。 [25] Shelver等 对ELISA试剂盒的性能进行研究,结果表明试剂盒的灵敏度为 -1 -1 [26] 0.76ng?ml ,检测下限为1.5ng?ml 。熊浩山等 用酶联免疫吸附法对猪尿中 -1 RAC进行了残留检测,结果该方法的最低检测限为0.92ng?ml ;50%抑制浓度的 8暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 -1 平均值为2.7ng?ml ,但回收率波动较大,在69.1~92.7%之间。 3.5 免疫传感器技术 免疫传感器是以免疫检测与物理传感技术为基础发展而来的一类新型生物 传感器,原理是依靠抗原与抗体的反应,当两者结合时产生的各种物理、化学、 电学或光学上的变化转变成可检测的信号来测定待测分子的浓度。免疫传感器法 的关键步骤是抗原、抗体的制备和抗原或抗体的固定。它分为为非标记型和标记 型免疫传感器。 Shelver等研制出免疫传感器用于RAC残留检测的方法并与HPLC、ELISA试 剂 盒进行了对比试验,该法回收率为100~110%,变异系数为6~10%,与HPLC的 相关系数为0.95;与ELISA试剂盒比较,样品预处理简单,酶水解样品可将RAC 代谢产物转变为RAC母体,不仅检测结果准确,还可消除假阴性结果,防止漏检 [27] 。但是目前免疫传感器生物响应的稳定性还有待提高,实际应用较少。 3.6 胶体金免疫层析试纸法 胶体金免疫层析技术(Gold immuno-chromatographic assay,GICA)结合了 胶体化学与免疫学方法,旨在利用抗原抗体的特异性反应实现快速检测的目的。 这种检测方法在灵敏度、特异性和稳定性都具有绝对的优势,利用这种技术制备 的胶体金免疫层析试纸条具有小而便携、不需仪器设备辅助、操作非常简单、用 肉眼即能判断结果等诸多优点,能够应对庞大的样品量的检测,近几年在兽药残 留快速检测中颇受关注。但目前在市场上RAC残留检测试纸条已有不少成品,但 [29] 质量参差不齐。免疫金标试纸法特异、敏感、快速、简便、直观,但不易定 量 。 4 胶体金免疫层析技术现状及应用 4.1 胶体金发展历史 免疫胶体金技术 Immune colloidal gold technique,ICG是一种常见的标记 技术,它是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应进行定位、定性乃至定 量研究的标记技术,是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起 来的固相标记免疫测定技术。胶体金最早由法拉第发现于1857年,他用还原法从 氯金酸水溶液中制备胶体金,并发现电解质的加入,可使胶体金颜色逐渐加深, 最终凝集成无色,同时发现在这种情况下加入明胶或其他大分子物质便可阻止这 9暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 种变化,他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。1971年Faulk和 [30] Taylon 首次用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细 [31] 菌表面抗原的分布。1974年,Romano等 用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间 接免疫金染色法。此后,胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。1980 [32] 年,Geoghegan 应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原,建立了光镜水平的 [33] 免疫金技术 Immunogold staining,IGS。Danscher 在此基础上改进并发展了用 银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法 Immunogold staining,IGSS。 [34] Holgate 又对上法加以改进,将免疫金染色与银显影技术相结合,建立免疫金 银染色法 Immunogold silver staining,IGSS。近年来, 研究人员根据胶体金的 物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学 方面的应用,包括它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、 抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位,也可以用于日常的免疫诊断。目前 胶体金的应用已经非常广泛流式细胞、凝集试验、斑点金免疫渗滤及免疫层析等 等,在医学研究上,其主要应用是免疫层析法ICA和快速免疫金渗滤法DIGFA。 免疫胶体金技术作为一种新的免疫学检测技术,因其检测快速方便、灵敏度高且 稳定、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在人医的临床检验和其它 领域取得广泛的应用,如传染病病原抗体、妊娠试验的检测、蛋白质的检测和药 物测定等,该技术在兽医临床上的应用也日益广泛。 4.2 胶体金的性质与制备 近年来,纳米颗粒因其自身的生物学特性,已经引起了人们的广泛重视。 尺寸在1~100nm的纳米颗粒最重要的特性是具有量子尺寸效应:当颗粒尺寸减 小时,其吸收光谱蓝移,禁带宽度增大,价带逐渐移向低能量,而导带则明显移 至高能量,此时颗粒已不再是一个惰性体,而是一个活泼的能给电子和吸收电子 的化学活性物质,同时,纳米颗粒巨大的比表面积使量子尺寸效应十分明显,也 正是基于这种效应,使得纳米颗粒与生物体之间存在特殊的相互作用,并在 生物 [35] 体系中得到了广泛的应用 。目前,人们已经将金属纳米颗粒,尤其是纳米金 颗粒应用到生物体系的分析检测中来。 氯金酸(HAuCl )在还原剂的作用下,可聚合成特定大小的金颗粒,并由 4 于静电作用成为一种稳定的胶体状态,故称胶体金。由图1-2可以看出,胶体金 10暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 颗粒由外部的双离子层包裹一个金核所构成的,紧连在金核表面的是内层负离子 2- AuC1 ,又称为Zeta电位,正是zeta电位使得胶体金颗粒之间由于带有同种电荷 而相互排斥,从而使胶体金悬液能够保持稳定。这些微小金颗粒(1~100nm)稳 定地、均匀地、呈单一分散状态浮悬在液体中,形成金溶胶。溶胶的颜色决定于 分散相物质的颜色、散度和入射光线,胶体金颜色因其粒子大小不同而不同,呈 现出橙红色、红色、酒红色、紫红色、紫色等。金颗粒间存在吸引力和排斥力的 矛盾,当改变温度、浓度、电解质时,粒子容易聚结而发生聚沉。 图1-2 胶体金颗粒的双电层结构图 Fig 1-2 Colloidal gold particle surrounded by a double ionic layer John Chandler, Tracey Gurmin, and Nicola Robinson, The place of gold in rapid tests, 2000 目前,胶体金是通过在氯金酸溶液中加入还原剂使之还原并聚集形成胶体 金粒子而制成的。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大 小,还原剂浓度越高,粒子直径越小。常用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、白磷、 抗坏血酸、硼氢化钠等。图1-3所示为不同离子水平的还原过程。早期的胶体金 制备主要采用电炉加热,但这种方法温度难以控制,剧烈地沸腾使金的稳定性下 降,因而不利于金溶液的质控。随后发展为使用微波加热法制备胶体金,微波加 热优势在于快速升温,因而制备的金溶液稳定性好且颗粒均一度高,并缩短制备 时间,操作简单快捷方便。具有大量实践经验的研究人员能够通过制备的胶体金 颜色、均匀度、透明性三者判断金溶液的质量,如20nm粒径的胶体金应为酒 红 色,清澈透明,如果出现蓝色或紫色且浑浊,表明质量很差。也可用分光光度法, 11暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 在400~700nm进行扫描,确定最大吸收峰波长,并观察最大吸收峰的峰形和峰 宽,最大吸收峰主峰宽度越小,颗粒越均匀;主峰宽度越大,颗粒越不均匀,峰 的位置随胶体金颗粒直径增大而向长波区移动,颗粒的分布宽度也趋于变大,稳 [36] 定性下降 。鉴定胶体金质量的最好方法是使用透射电镜(TEM)观察金颗粒 的大小及均匀程度。理想的胶体金颗粒大小基本相等,均匀一致,无凝集颗粒, 无椭圆形及多角形的金颗粒存在,若椭圆形、三角形金颗粒超过胶体金总数的 10%应重新制备。 图1-3 金离子还原成金颗粒 Fig 1-3 The reduction of gold ions into gold particles John Chandler, Tracey Gurmin, and Nicola Robinson, The place of gold in rapid tests, 2000 4.3 胶体金蛋白偶联物的制备 胶体金标记技术是以胶体金作为一种标记或者显色物质,应用于抗原抗体 反应的一种新型标记技术。由于它的惰性及稳定性,不容易与其他物质发生作用, 如内源酶及放射性同位素,且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重 标记,使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后 的一种新型标记技术。现已广泛应用于免疫印迹、流式细胞仪、电镜、体外诊断 试剂的制造等领域。胶体金标记蛋白,实质上就是蛋白或其他分子通过非公价结 合,即物理结合的方式与金颗粒相互作用并吸附到其表面,但这种结合不影响到 蛋白的活性。如图1-4所示胶体金粒子标记蛋白主要有三种相互作用:静电吸附 12暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 作用,疏水作用和配价作用。 图1-4 抗体与胶体金粒子结合示意图 Fig 1-4 The diagram of combination of antibody and colloidal gold particlesJohn Chandler, Nicola Robinson, and Karen Whiting, Handling false signals in gold-based rapid tests, 2001 一般来说,当体系的pH值接近于或稍高于蛋白质的等电点时,胶体金与蛋 白质的吸附力最强。反之,当胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集 [37] 而失去结合能力 。如在制备葡萄球菌A蛋白与胶体金的偶联物时,A蛋白的等 电点是pH5.1,因此,在标记时,胶体金的pH值宜调制5.5~6.1之间。在蛋白质与 胶体金结合时,应用最小的稳定量,从而保证在最佳pH值和离子强度时,每一 蛋白质分子能有尽可能多的点和胶体金颗粒界面接触。 4.4 胶体金免疫层析技术 目前免疫胶体金试纸条对目的物质的检测多是双抗夹心法、间接法、竞争 [28] 法等。由于兽药多为小分子半抗原,宜采用竞争法检测 ,即样品中的抗原和T 线上的抗原同时竞争特异性金标抗体。当样品中没有抗原或抗原浓度很低时,样 品抗原与金标反应产生少量抗原抗体复合物,样品抗原与金标抗体反应产生,大 部分金标抗体与检测线上的抗原结合,形成红色或紫色T线。而当样品中抗原浓 度高时,样品中的抗原和金标抗体反应产生大量抗原抗体复合物,只有少量金标 抗体能与检测线上的抗原结合,故形成的T线颜色较浅,甚至无T线出现。即T线 颜色深浅和样品中抗原的量呈负相关,待测样品中抗原的量越多,T线上的复合 物量就越少,T线颜色越浅。 用于兽药残留检测的胶体金免疫层析试纸条(图1-5)是以PVC为底板,依 13暨南大学硕士学位论文 莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究 次粘贴样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜