IP实验步骤 基本实验步骤

IP实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min， 12,000g离心30 min后取上清; (2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜; (3)免疫沉淀反应后，在4?C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟; (4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。 一、 样品处理: 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4?完成外，最为关键的是裂解液的成份。 用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。 a( 缓冲液:离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。 b( NaCl浓度一般习惯用150 mM，这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl的浓度可以低到50 mM，150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。 c( 甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。 d( 裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过Protease Cocktail (多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。 e( 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果: - 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反应。 - 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。 - 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。 二、 抗体-agarose beads孵育 裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80?保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜，也可以同时加入抗体和Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体，最高可以添加至5 ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG，但更为妥当的是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时，为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。 同时，Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的Protein A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein G beads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。 三、 抗体-agarose beads复合物洗涤: 除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。 四、 鉴定 免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。 我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于 免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间是以非共价健结合在一起，只有Protein A/G与agarose beads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug)，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。 针对上述情况，通常有二种解决办法: a( 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。 b( 使用交联剂将抗体和Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物，最后离心去除抗体-agarose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球 蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之 与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心， 可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质,蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。 白与蛋白 寻找新的 经由免疫共沉淀然后通过质谱或者的相互 相互作用 WB鉴定新的相互作用蛋白 作用 蛋白 验证目的 经由免疫共沉淀然后通过使用待测 蛋白和 蛋白 待测蛋白 的抗体进行WB实验可以确定目的蛋 是否有 白 相互作用 和待测蛋白是否有相互作用 通过对经由免疫共沉淀而得到的DNA 片段进行PCR实验可以获得DNA片研究蛋白与DNA的动态作用 段的序列信息以及目的蛋白与DNA 之间的动态作用信息 通过使用针对组蛋白不同修饰位点的研究蛋白 抗体进行染色质免疫沉淀实验去检测 染色质 与DNA 研究组蛋白的各种共价修饰 组蛋白的不同修饰状态和目的基因启 免疫沉淀 的相互 与基因达之间的关系 动子之间的动态相互作用，从而研究作用 组蛋白修饰与目的基因表达之间的关 系 基于CHIP的原理发展出来的RIP 研究蛋白与RNA的相互作用 (RNA-IP)技术可以用来研究目的蛋 白与RNA之间的相互作用信息 我该选择什么样的抗体做免疫沉淀，免疫共沉淀和RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀, 在所有免疫沉淀相关实验中，抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验(WB和IF等)要低得多，所以对抗体的亲和力相对其它实验(WB和IF等)提出了很高的要求，这就需要使用高亲和力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时，由于免疫沉淀相关实验主要是在生理条件性进行，所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象，因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出了很高的要求: a( 用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多，主要有天然提取，原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中，就蛋白构象角度而言，天然提取是最佳途径，但这种方法受来源限制和纯化方法复杂等多因素影响，一般很少采用。原核表达因为成本低廉，操作方便最为受欢迎，但其受表达环境与大部分蛋白天然存在环境差别巨大，构象失真情况严重，抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表达是近期新兴的表 达系统，具有表达环境接近天然，操作方便等诸多优点，是获取具有天然构象蛋白抗原的首选工具。 b( 亲和力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原决定簇，所以在亲和力方面是首选。但考虑到特异性，获得单克隆抗体群是更好的选择。具体优缺点总结如下表。 单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多 多克隆抗体 单克隆抗体 个单克隆抗体混合物) 抗体抗原作由抗体的亲和力决定(极佳极佳 极佳 用信号强度 或者极弱) 通常很好，但有时会极佳(由于选择可以进行IP且没有交特异性 极佳，但有时会有交叉反应 有非特异性相互作用 叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 亲和力高(由于抗体特异性好，亲和力高(由于选择可以进可以与目的蛋白的多特异性好，且可以无限量供优点 行IP且没有交叉反应的抗体组成单克个抗原决定蔟相互作应 隆抗体群) 用) 需要筛选亲和力高的抗体;能够筛选得到的符合条件的单克隆并非特异性相互作用很缺点 抗原表位可能会被相互作不多，所以单克隆抗体群也就不容易获难去除 用蛋白遮蔽 得 免疫沉淀效由抗体的亲和力决定(极佳极佳(由于选择可以进行IP且没有交极佳(由于亲和力高) 果 或者极弱) 叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 由抗体的亲和力决定和抗通常很好，但有时非免疫共沉淀原表位是否被相互作用蛋极佳(由于选择可以成功进行IP且没特异性相互作用会带效果 白遮蔽决定(极佳或者极有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 来假阳性 弱) 由抗体的亲和力决定和抗 通常很好，但有时非原表位是否被遮蔽或者以染色质免疫极佳(由于选择可以成功进行IP且没特异性相互作用会带及抗原表位是否被交联实沉淀效果 有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 来假阳性 验所破坏决定(极佳或者极 弱)