根霉菌ZJ-8产纤维素酶液体发酵条件优化

根霉菌ZJ-8产纤维素酶液体发酵条件优化 根霉菌ZJ-8产纤维素酶液体发酵条件优化 --—— 286--——江苏农业科学2010年第4期 齐海萍,胡文忠,范圣第.根霉菌ZJ一8产纤维素酶液体发酵条件优化的研究[J].江苏农业科学,2010(4):286—287 根霉菌ZJ一8产纤维素酶液体发酵条件优化 齐海萍,胡文忠,范圣第 (大连民族学院/生物技术与资源利用国家民委教育部共建重点实验室,辽宁大连116600) 摘要:以稻草粉为主要原料,通过单因素和正交试验对根霉菌ZJ一8液体发酵产纤维素酶的最佳条件进行 优化.研究结果表明:以5.O%稻草粉为碳源,3.O%豆饼粉为氮源,250mL三角瓶装液量60mL,接种量5.0%,培养 温度30?,初始pH值5,培养120h,产酶活力最高,CMC酶活为14.72U/mL. 关键词:纤维素酶;发酵;培养基;优化条件 中图分类号:TS201.3文献码:A文章编号:1002—1302(2010)04—0286—02 纤维素酶是生物降解含B一1,4糖苷键的纤维素等多糖 生成葡萄糖的一组酶的总称.在纤维素酶的生产中选择合适 的产酶诱导物十分重要.纤维素酶的生产有固体发酵和液体 深层发酵2种方法.液体发酵法是以玉米,稻草等植物秸秆 为主要原料,投资少,工艺简单,产品价格低廉.本研究以玉 米,稻草等植物秸秆等纤维素为碳源和诱导物,采用液体深层 发酵方法,对根霉菌ZJ一8产纤维素酶的发酵工艺条件进行 优化,探讨不同工艺条件对所产纤维素酶活性的影响,为进一 步优化和完善纤维素酶的生产工艺提供试验依据. 1材料与方法 1.1供试菌种 为笔者所在实验室筛选的根霉菌菌株ZJ一8. 1.2培养基 PDA培养基…:主要用于活化菌种;种子培养基:CMC— Na0.75%,蛋白胨0.5%,硫酸镁0.03%,氯化钙0.03%,磷 酸二氢钾0.4%(250mL三角瓶装50mL培养基);基础产酶 培养基:在250mL三角瓶中装50mLMandels无机营养液, 稻草粉1.5%,蛋白胨0.15%. 1.3基础产酶条件 250mL三角瓶装液量60mL,菌龄96h,发酵时间120h, 接种量5.O%,温度3O?. 1.4羧甲基纤维素酶活性测定 取发酵样品适当倍数稀释液1mL,加入1%CMC—Na溶 液4mL(溶于pH值4.6,0.1mot/LHAc—NaAc缓冲液)于试 管中,40?反应5min,迅速加入1mLNaOH和2mLDNS试 剂,沸水浴5min.冷却后加水定容至10mL,摇匀后在uV一 2001分光光度计520nm下测D值,以水为空白对照,对照标 准曲线测算酶活力.酶活力定义:以1min催化纤维素水解 生成1ixmol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(U/mL). 收稿日期:2010—03—31 基金项目:国家民族事务委员会支持项目. 作者简介:齐海萍(1973一),女,辽宁沈阳人,博士,讲师,研究方向 为食品生物技术.E—mail:qhp8@sina.eom. 通信作者:胡文忠,博士,教授,研究方向为采后生物学.E—mail: hwz@dlnu.edu.cn 2结果与分析 2.1氮源对产酶的影响 在基础产酶培养基中分别加入尿素,硝酸铵,豆饼粉,蛋 白胨和硫酸铵等5种氮源,含氮量按0.3%计,其他成分不 变,5%接种量,30?恒温培养120h后测酶活,结果见图1. 由图1可见,培养基加豆饼粉的酶活最高,为12.61U/mL,故 在后续研究中选择豆饼粉作氮源. 一 耋: 谊 氮源 图1不同氮源对根霉zJ一8产纤维素酶的影响 2.2碳源对产酶的影响 以2%豆饼粉为氮源,分别加入1.5%不同类型的碳源, 250mL三角瓶加50mLMandels无机营养液,3O?下 150r/min振荡培养120h后测定酶活,结果见图2.由图2 可知,稻草粉和豆渣作碳源时酶活高于麸皮,玉米秸秆及玉米 芯,其中以稻草粉作碳源时酶活最高.这些原料都富含纤维 素,纤维素酶是诱导酶.,在微生物发酵过程中,纤维素的 存在对纤维素酶的产生有一定诱导作用,但酶活相差较大,其 原因有待进一步研究. 14 l2 10 8 耀6 龉4 0 碳源 图2不同碳源对根霉zJ-8产纤维素酶的影响 2.3接种量对产酶的影响 在装有60mL已优化培养基的250mL三角瓶中分别加 齐海萍等:根霉菌ZJ一8产纤维素酶液体发酵条件优化--——287.-—— 入不同体积菌种,30?恒温培养5d,结果见图3.由图3可 知,当接种量为5.O%时,产酶活力最大.接种量过小时,菌 体生长缓慢,酶活较低;接种量过大时,菌体生长过快,培养基 中的营养主要被菌体用于自身生长,且培养液黏度增大,造成 溶氧不足,产生大量生物热,后期菌丝营养不足,都会使产酶 量下降. 一 一 !{里 黼 接种量(%) 图3不同接种量对根霉zJ_8产纤维素酶的影响 2.4发酵时间对产酶的影响 将装有60mL已优化培养基的250mL三角瓶在3O?下 恒温培养不同时间,结果见图4.由图4可知,培养时间对酶 活影响较大,培养前期随培养时间的增加酶活升高,培养时间 为120h时,酶活达到最高值(10.05U/mL).此后随培养时 间的增加酶活明显降低,这可能与底物浓度降低以及代谢产 物抑制作用有关. ^ 室 龌 发酵时间(h) 图4不同发酵时间对根霉zJ.8产纤维素酶的影响 2.5温度对产酶的影响 将装有60mL已优化培养基的250mL三角瓶分别在不 同温度下培养5d,结果见图5.由图5可知,随培养温度升 高,酶活先升后降,在30?时酶活达到最高,为10.05U/mL. 在40?时菌体生长迅速,但菌体过早老化,导致酶活不高. _, 她 溢 25283O3740 发酵温度(?) 图5不同发酵温度对根霉zJ一8产纤维素酶的影响 2.6培养基初始pH值对产酶的影响 试验结果表明,产酶的最适pH值为5.0(图6).对于液 体发酵,起始pH值低于4.0时,纤维原料不能充分糖化,致 使营养成分缺乏,产酶能力弱;当pH值高于7.0时,菌体易 自溶,致使菌体过早老化,产酶期缩短,且酶较易失活. 12 ,, 10 童8 已6 釜42 O_...|一/-J4578l0 pH值 图6培养基初始pH值对根霉ZJ一8产纤维素酶的影响 2.7最佳产酶条件的确定 根据以上单因素试验的结果,选择碳源,氮源,初始pH 值以及接种量进行4因素3水平正交试验,结果见表1.由 表1可知,该菌株的最佳产酶条件为A3B,C.D,即稻草粉 5%,豆饼粉3.0%,初始pH值5,接种量为5%.另由R> R>R>R.可知,对该菌株产酶影响最大的因子是稻草粉, 其次是初始pH值,而接种量对该菌株的产酶影响最小. 由于最佳产酶组合条件B3cD不在正交试验中,故 补做最优水平组合试验,结果酶活达14.72U/mL,与分析结 果一致. 表1根霉zJ一8产纤维素酶最佳发酵工艺条件优化正交试验结果 3结论 以5.0%稻草粉为碳源,3.O%豆饼粉为氮源,250mL三角 瓶装液量为60mL,接种量为5.O%,培养温度为3O?,初始 pH值5,培养120h,产酶活力最高,CMC酶活为14.72U/mL. 参考文献: [1]谢正阳.现代微生物培养基和试剂手册[M].福州:福建科学技 术出版社,1994. [2]ChandP,ArunaA,MaqsoodAM,eta1.Novelmutationmethodfor increasedcellulaseproduction[J].JournalofAppliedMicrobiology, 2005,98:318—323. [3]施特尔马赫.酶的测定方法[M].钱嘉渊,译.北京:中国轻工业 出版社,1992. [4]王成华,孙炳新,王健鹏,等.里氏木霉91—3纤维素酶产生条件 的研究[J].食品工业发酵,1996(5):1—5. [5]CadocheL,LopezGD.AssessmentofsizereductionaSapreliminary stepintheproductionofethnolfromlignocellulosicwastes[J].Biol Wastes,1989,3O:153—157. I 一 ??? ?I— I 一 ??