早孕妇女宫颈分泌物解脲支原体的分群分型检测

早孕妇女宫颈分泌物解脲支原体的分群分型 早孕妇女宫颈分泌物解脲支原体的分群分 型检测 ---—— 1674---—— 文章编号:1007—4287(2007)12—1674—03 ChinJLabDiazn,December,20町.v0l11.No.12 早孕妇女宫颈分泌物解脲支原体的分群分型检测 向梅,皱冬冬,刘贤荚,吴书磊,尹继刚,陈启军 (1.吉林大学第二医院妇产科,吉林长春130041;2.吉林大学人兽共患病研究所) 解脲支原体是非淋菌性尿道炎的主要病原体之 一 ,但从部分正常人的泌尿生殖道中也能培养分离 出Ul_r.实验证实,泌尿生殖道感染,胎膜早破,早 产,新生儿呼吸窘迫综合征,产后感染均与解脲支原 体感染有关.因此宫颈分泌物解脲UU的分群分型 检测与致病性的关系对性传播疾病的防治有重要的 意义.本文作者应用PCR法对30例uu培养阳性 分离株进行分群分型鉴定,以指导临床治疗. 1资料与 1.1研究对象选择2006年9月一2006年12月来 吉大二院及吉林省妇幼保健院就诊的早孕患者74 例,要求2周内未进行药物治疗.年龄2O一35岁. 选择同期无任何自觉症状,妇科门诊就诊患者245 例作为对照组.年龄20—40岁. 1.2标本采集用无菌棉拭子拭去宫颈口表面的 黏液,取另一支棉拭子插入宫颈内1—2cm,转动,停 留2o一30s,取出立即接种于解脲脲原体选择性液 体培养基(三明博峰生物有限公司的解脲支原体选 择性培养基)内,然后放置于CO2培养箱37?培养 48h后,观察结果,培养基变红者为阳性.取阳性标 本置一20?冰箱中编号备用. 1.3寡核苷酸引物参5~Kong[1j设计合成寡核苷 酸引物,进行PCR扩增,uu通用引物:UMS一125 (GTAI1.I’GCAATCrI]nTGTrI]CG),UMA226 (CAGCTGATGWGTGCAGCATTA,I’I’C)可以 对UU分群.第一群预期扩增基因片断为403bp 404bp,第二群预期扩增基因片断448bp.对第一群 标本继续进行PCR扩增分型,引物如下:UMS一125 (GTArI]GCAATCrI]nTGTrI]CG),UMA269 (CTAAGACC’IT邢C从GTGTAC),预期扩增 基因片断为442bp,阳性标本为UU3/14型;UMS一 125(GTArI]GCAAlErI]nTGT1_ITCG), UMA269’(CCAAATGACCITTIGTCTAGAT), 预期扩增基因片断为442bp,443bp,阳性标本为 *通讯作者 UU1/6型.;对于3/14型阳性标本行PCR扩增分型, 引物如下:UMA269(CTAGACcTrrI1.I’C从 GTGTAC),UMS3S(,I’】1A口TAGAAA,I’】1ATGTAAG A1TACC),预期扩增基因片断为400bp,阳性标本 为UU3型;UMA269(CTAGACCIT肿CAA GTGTAC),UMS14S(从TTACTGTAGAAATTAT GTAAGA眦AT),预期扩增基因片断为402bp,阳 性标本为UU14型.对于UU1/6型阳性标本行PCR 产物纯化,酶切.PCR产物纯化采用uNIQ一10柱式 PCR产物回收试剂盒(上海化工生物工程技术服务 有限公司),回收产物为DNAsolution共30ul.用限 制性内切酶HinfI消化. 1.4限制性酶切体系30l体系构成如下:Buffer 3.0l,Hin?1.0,DNAsolution16.0,ddH2010.0 ,37?水浴箱孵育2h后,2%的琼脂糖凝胶电泳, 在紫外灯下观察出现142bp和261bp两条带的为 UU1型,未被切开的只出现442bp或443bp一条带 为UU6型.. 1.5PCR反应条件94?2min,95?30s,55/ 58?30s,72?1min,72?5min,共4o循环.在25 体系中进行PCR扩增反应,体系构成如下:10× PERBuffer2.51,dNTP0.5,primer各0.25, ddI-I2019.25,rTaq—ase0.25l,DNA2.0. 增产物在2%琼脂糖凝胶(含0.5r/L嗅化乙锭)中 进行电泳,在紫外线灯上观察结果. 1.6统计学方法进行检验. 2结果 2.1早孕组与对照组UU感染率的比较 早孕组中UU阳性率为40.5%(30/74),对照组 为31.0%(76/245),二者之间无统计学差异(= 2.322,P>0.05).详见表1. 表1早孕组与对照组UU感染率的比较 12 2.2早孕组与对照组UU阳性株分群情况 对照组工群阳性率65.8%,II群阳性率34.2%; 早孕组一群阳性率40.0%,二群阳性率60.0%;早孕 组二群阳性率明显高于对照组(P<0.05),而对照 组一群阳性率明显高于早孕组(P<0.05).见表2. 早孕状态下生物二群解脲支原体易感,一群解 脲支原体在普通人群内多见. 2.3早孕组与对照组UUI群阳性株分型情况 早孕组工群阳性12例,对照组工群阳性50例; 1型阳性率:对照组12%,早孕组33.3%;3型阳性 率:对照组26%,早孕组8.3%;6型阳性率:对照组 一 . 1675— 32%,早孕组25%;14型阳性率:对照组1%,早孕组 0%;混合型即两种或两种以上血清型感染,对照组 26%,早孕组33.3%.此处检验不适用,因例数 太少,统计意义不大.但可以看出早孕组较对照组 1型感染率有增高趋势.见表3. 表2早孕组与对照组UU阳性株分群情况 ?P<0.O5. 表3早孕组与对照组UUI群阳性株分型情况:率(例数) 3讨论 Robertson用间接荧光法证实解脲支原体有14 个血清型,随后一些学者通过一系列的研究,将14 个血清型的解脲支原体株划分为2个生物群, 工群各型仅含17kDa多肽(1,3,6,14型),基因组为 760kbp;II群各型均含有16kDa和17kDa多肽(2,4, 5,7,8,9,10,11,12型),基因组为880—1140kbp.由 于解脲支原体常存在于健康无症状的个体中,所以 推测可能只是某些亚群与疾病相关,而且可能只有 某些血清型具有致病性.1989年,Rudd等建立了支 原体感染的小鼠模型,得到了不同血清型具有不同 致病力的原始证据.他指出,不同血清型具有不同 致病力只是一方面的因素;有患病倾向的宿主因素 则是同样重要的另一方面;疾病的易感性和年龄有 关;特异性抗体的缺乏也是解脲支原体引起疾病的 一 个重要因素. 很多实验证实,泌尿生殖道感染,胎膜早破,早 产,新生儿呼吸窘迫综合征,产后感染均与解脲支原 体感染有关L2j.有人认为I群致病,也有人认为 ?群致病.从工群血清型的致病性上看,国内朱庆 义4曾报道,性病门诊的患者1,3型解脲支原体阳 性率很高;2006年罗琼观察解脲支原体血清型与自 然流产的关系,1型检出率最高30.6%.国外报道 血清3,4,6型在不孕妇女中更频繁出现.其中,3 型(35.5%)超过6型(22.2%).与此相反,对照组6 型(33.3%)明显超过3型(20.3%).血清4型,不 怀孕的15.5%,对照组14.8%.1,2,7,8型在1.8% 一 11.1%范围.也有研究结果认为患病组以生物? 群感染为主,QuinnPA调查有死胎史的夫妇84.5% 感染支原体,而对照组只有25.4%的感染率,母亲 在血清4型和8型有感染优势.国内刘洋【J认为4, 8型解脲支原体与泌尿生殖道显性感染有密切的相 关性.虽然国内外的结论有所差异,但可以看出共 同点,即解脲支原体感染可以致病,某种血清型比其 他型更具有致病性.国内外不同的实验结果提示解 脲支原体感染可能存在地区性差异,解脲支原体对 不同部位的组织亲和力可能不同,即不同部位的疾 病优势血清型可能不同. 有泌尿生殖道感染症状组与对照组UU感染率 相近,生物?群与致病相关,1型与泌尿生殖道的感 染症状也似有相关性.怀孕期?群感染率高于对照 组.分析妊娠妇女阴道UUII群检出率较高的原因 可能为妊娠尤其是晚期妊娠孕妇的生理变化有助于 UU的生长,这包括宫颈阴道分泌物增多,营养丰富; 阴道内尿素含量增多供给更多的能量,阴道内乳酸 含量升高,环境偏酸,抑制了其他多数不耐酸微生物 的生长,并且也可能抑制了一些对UU生长不利的 微生物的生长.这些均说明UU可能为条件致病 菌,在机体整体情况对其抵抗力差时易于感染并可 致病,致病力强的?群更加易感.所以,我们需对孕 妇UU的感染引起高度重视,做好如下工作:?对孕 妇进行UU的检测,并进行uu分群检测;?选用对 孕妇和胎儿无害的抗生素并采取适当的给药方法对 孕妇进行治疗.关于妊娠妇女阴道分泌物UU分 ?—-—— 1676---—— 群,分型及与致病的关系非常重要,其问存在复杂的 寄居与感染的关系,需要我们进一步积累病例资料 加以研究,无疑这对围生期妇儿保健是很重要的. 作者简介:向梅,女,36岁,博士,副教授,副主任医师,主要 研究方向:妇产科感染. 参考文献: [1]KongFR,zhuXJ,Wei~henWangWZ,eta1.c0qmdveanalysisand- 一 ~aeei6eidentifi~tlon罐multlple-l~ndedantigengenesdUre- apl~m?魈l?bio,~ar1[J].JClinMicrobial,1999,37(3):5338. [2]YiJ,Y鲫lBH,mEC.Detectionandbiovardiscrimination0fUreaplas一 文章编号:1007—4287(2007)12—1676—02 ChinJLabDia即,December,2OO7,v01II.?.12 mmea1?mby蒯一timePcR[J].MolCellProb,.2005,19(4):255. 13JY~hidaT,lshikoH,YasudaM,eta1.Polymerasechitinreaction.b89.d subtyping0fureasrmpan,urnandmeap1a8m臣?魈lcI?rIin6rgt.pa88 urinesamplesnInenwi山orwithouturetlmti8[J].Sexn8IlsrnDis, 2005,32(7):454. [4]朱庆义,胡朝晖,刘峰林,eta1.解脲脲支原体多带抗原基因分型 鉴定及其临床应用研究[J].中华医院感染学杂志2005.15(8): 856. [5]刘洋,钟淑霞,徐斌,等.长春地区泌尿生殖道感染者解脲支 原体血清分型研究[J].吉林大学(医学版),2002,28(I):61. (收稿日期:2007—04—09J 人宫颈癌基因的克隆及其真核表达载体的构建 李诺飞,杜开春 (1.宜昌市中医院检验科,湖北宜昌443003;2.宜昌市第一人民医院检 验科) 人官颈癌基因(humancervicaleltlleeroneogene, Hcc~)是近年来用差异显示技术发现的一种新的癌 基因,它可作为抑癌基因p53的负向调控因子,参与 人类多种肿瘤的发生[,.HCCR定位于人类第12 号染色体长臂可分为HCCR1和HCCR2,HCCR2较 HCCR1,少了一个外显子(E)(1),其核苷酸序列与HC— CR1的129—2118nt位一致,HCCR2可编码304个 氨基酸(一36KD),其氨基酸序列与HCCR1的57— 360aa位一致.HCCR在人类多种肿瘤中过度表达, 表明HCCR水平的改变可能是肿瘤发生早期的重要 变化[引.本研究从肝癌细胞系中克隆了HCCR2基 因的编码区(cds)全长eDNA序列,并构建了其真核 表达载体,为进一步研究该基因功能奠定了基础. 1材料与方法 1.1材料 人肝癌细胞系HepG2,菌株DH5a,真核表达载 体peDNA3.1(+)/Neo为本室保存.限制性内切酶 N0tI,XbaI,TdDNA连接酶,LATaq酶,DNA凝胶 回收试剂盒,质粒纯化试剂盒为Takara公司产品; M.MLV逆转录酶购自Promega公司;RPMI1640培养 基及TtlI~I试剂为Gibeo公司产品;引物合成及序 列测定由上海生工生物工程有限公司完成. 1.2方法?J 1 1.2.1H印G2细胞的培养在含10%小牛血清的 RPlVII1640培养液中,37?,5%co~.-ea4e~下培养. 1.2.2细胞总RNA的提取按TRlzol试剂说明书 抽提总RNA. 1.2.3RT-PCR扩增HCCR2eDNA根据CeneBank 提供的HCCR2序列(AF315598),设计特异性引物, 上游引物为5’一ATI1TeX;GCCCCCTOTTAT GTGGTAACC一3’(划线部分为NotI酶切位点),下 游引物为5’一GCTeTACATtAGCC,CCTrGTCCCA AG-3’(划线部分为xbaI酶切位点).以HepG2细 胞总RNA为模板,逆转录(RT)合成第1链eDNA,lit 的反应体系为25:HepG2细胞总RNA1/ag和ol (aT)15引物0.5g溶于8DEPC水中,70~C变性5 min,冰上迅速冷却,离心.再加反应缓冲液5,10 mmol/LdNTP1,50ulRNasin0.5,200u/ M.MLV逆转录酶1l,加水至25,混匀后置37? 孵育1h,95?变性5min终止反应.以eDNA为模 板,PCR扩增HCCtl2,反应体系为:MgCl2(25mmol/ L)5l,10XLAPCRBufferII(M+Free)5, <aRaLATaq(5U//~I)0.5l,10mmol/LdNTP2 l,上游引物(2o?l/,L)1l,下游引物(20/m~l/L) 1,灭菌蒸馏水3O.5l,eDNA模板5l;循环参数: 94?5min预变性,随后94?60see;55?60sec; 72?90sec;共35个循环,最后72~C终延伸10min. 1.2.4扩增产物的鉴定取5lRT.PCR产物于