黑乳海参胶原蛋白活性肽的研究（可编辑）

黑乳海参胶原蛋白活性肽的研究（可编辑） 黑乳海参胶原蛋白活性肽的研究 单位代码 10475 学号 6 分类号 R914.1硕士学位论文 黑乳海参胶原蛋白活性肽的研究 学科、专业 : 药物分析 研究方向 : 海洋药物活性成分的分析 申 请 学 位 类 别 : 医学硕士 申 请 人 : 陈娟娟 指导教师 : 王先友 副教授二?一三 年 五 月 STUDY ON THE COLLAGEN ACTIVITY PEPTIDEOF HOLOTHURIA NOBILIS SELENKA A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of master of MedicineBy Chen Juanjuan Supervisor: Prof. wang xian you Date:May.2013 2 I 摘 要 海参sea cucumber, holothurians 归属无脊椎动 物棘皮动物门,以其较高 的营养价值 和药学价值而被列为“八珍”之一。全世界约有1000 多 种 海 参 , 我 国约 有140 多种,可 供食用者约有40 多 种 , 其 中10 种 具 有 较 高 的 商 品 价 值 。 黑 乳 海 参 (Holothuria nobilis Selenka ) 分布于我国西 沙群岛和海南岛南部, 澳大利亚西部海域, 是一种品质优良的大 型食用海参,体壁较厚。 目前国内外对海参活性成分的研究主要集中于海参多糖、 海参皂苷、 脂质以及微量 元素等, 对海参胶原蛋白及其活性肽的研究较少。 崔凤霞等人对海参胶原蛋白活性肽进 行了一些研 究, 但大都集中在相对分子质量为1000 左右小分子肽的研究上, 而对大分子 胶原蛋白肽的研究未见报道。 本论文以黑乳海参为研究对象, 采用风味酶对处理后的黑乳海参进行酶解制备胶原 蛋白活性多肽, 结合各种分离技术提取纯化胶原蛋白多肽, 研究其氨基酸组成、 氨基酸 序列和体内外的各种生理活性。 本文主要研究结果如下: ? ?乳海参胶原蛋白酶解制备得到目标胶原多肽HNCP-F-AMw :1-10kDa, 采用 超滤、 凝胶 柱层析和HPLC 方法, 分离制备 得 到三个组 分 :HNCP-F-Aa 、HNCP-F-Ab 、 HNCP-F-Ac , 采用MALDI-TOF-MS 测得三个 组分的多肽质量图谱及主要相对分子质量: 2806Da 、7201Da 、1532Da 。 ? 目标胶原多肽的氨基酸组成分析结果表明本实验制备得到的 ?乳海参胶原多肽 主要含有 甘氨酸Gly 、 丙氨酸 (Ala )、谷 氨酸Glu、 脯氨酸Pro、 羟脯氨酸Hyp。 其中鲜味氨基酸、 药效氨基酸、 必需氨基酸的总量占胶原多肽氨基酸总量的摩尔百分比 分别为 65.1% 、58.08% 、24.96% 。因此?乳海参胶原多肽氨基酸组成齐全,味道鲜美, 具有很高药用价值。 ? 采用 MALDI-TOF/TOF MS-MS 方法对?乳 海参胶原多肽样品 HNCP-F-Ac 中 8 种多肽 进行 denovo 氨基酸测序, 序列结果分别为: IPGYIMSSSNHDGGAP; GSNHSDSY- WLMPR;PDMGVNSKYVGHLR;TMLAMVRVHLYLR;DGNLYMGHRMMCSGY;DWEV- AYDV HECPMCK; GDPKDDLFWVVCCKCLK 。 ?乳海参胶原多肽样品 HNCP-F-Ab 条 带 1 的部分氨基酸序列 为 :NH -Gly- Ala? Pro- Gly-Pro-Met-Gly-Met-Met-Gly 。 2 I? 黑乳海参胶原 多 肽 对 二苯代苦味肼基自 由基DPPH? ? 羟 基 自 由 基? 0H ? 超 ? ? 氧阴离子自由基O 的清除作用表明, 黑乳海参胶原多肽能有效清除 二苯代苦味肼基 2 自由基?羟基自由基 ?超氧阴离子自由基,其 IC 值分别为 5.78mg/ml ?4.20mg/ml 、 500.27mg/ml 。 ? 黑 乳 海 参胶 原 多 肽对 D- 半 乳 糖 模 型小 鼠体 内 的 生 理活 性 实 验结果 如 下 : ? 对 小鼠体重、 免疫器官和脏器指数的影响: 不同给药剂量组 , 对其体重、 免疫器官、 脏器 指数的影响均无统计学意义P >0.05。 ? 对小鼠血清、 皮肤组织抗氧化水平和羟脯氨 酸含量 影响: 与 D-gal 组相比, 在 25mg/kg 和 50mg/kg 两个剂量组时, 血清中的 T-AOC总 抗氧化能力活性均显著性增加P <0.05,SOD 超氧化物歧化酶 的活性在 25mg/kg 剂 量组时有非常 显 著 性 的 提 高P <0.01 。 不 同 剂 量 的 海 参 胶 原 多 肽 样 品 对 小 鼠 皮 肤 中 的 GSH-Px 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 、SOD 超 氧 化 物 歧 化 酶 、 T-AOC 总 抗 氧 化 能 力 活性 有双向调节作用。与 D-gal 组相比,在 50mg/kg 剂量组时,GSH-Px、SOD 、T-AOC 活 性均显著性提高P <0.05,尤其是 GSH-Px 和 T-AOC 的活性有非 常显著性提高P < 0.01,而在 100mg/kg 高剂量组时,T-AOC 活性有显著性降低P <0.05 ;对皮肤中羟 脯氨酸含量的影响无 差异显著性意义P >0.05。 ? 不同浓度的?乳海参胶原蛋白多肽样品对新西兰兔左心室动脉血体外 活化部分 凝血活酶时间APTT、 血浆凝血酶原时间PT、 凝血酶时间TT的影响结果表明, 相 对于对照组而言, 海参胶原多肽对体外凝血指标APTT、PT 、TT有 双重调节作用。PT 在样品浓度为100.0 ?g/ml 、200.0?g/ml 、400.0 ?g/ml 时, 与对照组相 比均有显著性缩短P <0.05;与对照组相比,TT 在样品浓度为100.0 ?g/ml 、200.0 ?g/ml 时,有显著性缩短 (P <0.05 );PT 和TT 在 高 浓度 组800.0?g/ml 时 , 与对 照组 相比 均延长 , 其中TT有显著 性的延长P >0.05 ;APTT 在样品浓度为50.0 ?g/ml 、100.0 ?g/ml 、200.0 ?g/ml 时,与对 照组相 比均缩 短, 且有 显著性 差异P <0.05 。而在 低浓度 组12.5 ?g/ml 、25.0 ?g/ml 时, 相对于对照组而言,APTT 时间均延长,且在12.5 ?g/ml 时有显著性延长P <0.05。 本文首次对黑乳海参胶原蛋白多肽的化学结构和生物活性进行了研究, 采用多种现 代层析分离技术制备纯化了大分子胶原蛋白多肽,应用 Edman 降解和质谱方法测定了 多肽的氨基酸序列, 并进行了多种生物活性研究。 研究结果丰富了目前海参胶原蛋白活 性肽的研究内容, 具有较好的学术价值, 添补了国内的空白; 为研究探讨海参生理活 性 物质与结构的关系, 提供了研究; 为进一步研究开发利用海参食药 功效提供了科 II学依据。 关 键词 :黑乳海参,胶 原多肽,氨基酸组成,氨基酸序列,生物活性IIIAbstract Sea cumcumbers belong to invertebrate echinodermata and are listed as one of the "eight treasures" for theirs high nutritional and pharmaceutical value. The total number of presently existing sea cucumber species is more than 1000 around the world and 140 species are in China. About 40 sea cumcumber species are edible, of which 10 species are higher value of goodsThe distribution of Holothuria nobilis Selenka is in the south China Paracel Islands and Hainan Island and Western Australia waters. Holothuria nobilis Selenka is thick body wall, a high quality and large edible sea cucumberThe mainly active ingredients of sea cucumber are concentrated in glycosaminoglycan, polysaccharide, saponins, lipids and trace elements et al. Sea cucumber collagen and its active peptide research is less. Afte -rwards Cui Feng Xia et al study the active collagen peptide of sea cucumber in some ways, but the research is focus on small molecules peptide which the relative molecular mass is less than 1000. So far, the collagen polypeptides of sea cucumber have not been reported Holothuria nobilis Selenka is the research object in the paper. The active collagen polypeptides are from treatment of holothuria nobilis which is hydrolyzed by a flavourzyme. Collagen protein polypeptide was separated and purified by various separation and purification techniques, of which the amino acid composition, amino acidsequence and a variety of physiological activity in vivo and in vitro were studiedThe main research results of this paper are as follows: ? The sea cucumber collagen hydrolyze to obtain target collagen polypeptide HNCP-F-AMw :1-10 kDa.Three components: HNCP-F-Aa,HNCP-F-Ab,HNCP-F-Ac were obtained by combination with ultra- filtration, gel column chromatography and HPLC.The polypeptide mass spectrum and main relative mole- cular mass of three components: 2806Da、7201Da 、1532Da were measured by the MALDI-TOF-MS? Objective collagen polypeptide amino acid composition analysis results show that Sea cucumber collagen polypeptide mainly contains glycineGly, alanineAla, glutamateGlu, prolinePro and hydroxyprolineHyp. The total content of delicious amino acids, pharmacodynamic amino acids, essential amino acids accounts for 65.1%, 58.08%, and 24.96% of the mole percentage on the total amino acids from collagen polypeptide. So the collagen polypeptide has high medicinal value, tastes delicious and is complete in amino acid composition V? Combined with MALDI-TOF/TOF MS-MS, we gained the denovo sequence results about HNCP-F-Ac: IPGYIMSSSNHDGGAP; GSNHSDSYWLMPR; PDMGVNSKYVGHLR; TMLAMVRVH- LYLR; DGNLYMGHRMMCSGY; DWEVAYDVHECPMCK; GDPKDDLFWVVCCKCLK. The part ami- no acid sequence from strip 1 of HNCP-F-Ab: NH -Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Met-Met-Gly 2 ? Scavenging effect of the diphenyl-generation bitterness hydrazino radicalDPPH ?, hydroxyl ?? radical?0H, superoxide anion radicalO show that collagen polypeptide can remove them. The IC 2 50 value of them is 5.78mg/ml, 4.20mg/ml, 0.27mg/ml, respectively ? The results of Holothuria nobilis Selenka collagen polypeptides on physiological activity of D-gel model mice are as follows: ? Body weight ,immune organs and viscera index of mice: The differences were not statistically significant significanceP0.05 about their body weight, immune organ, organ index in different dose groups .? Anti-oxidation level of serum,the skin tissue and hydroxyproline content in the skin tissue:comparing with the model group,the 25mg/kg and 50mg/kg dose group, T-AOCTotal antioxidative capacity activity of serum was significantly increasedP0.05. The SODSuperoxide dismutate activity of serum in the 25mg/kg dose group was extremely significant increasedP0.01The GSH-PxGlutathione-Peroxidase, SODSuperoxide dismutate, T-AOCTotal antioxidative capacity activity of different doses in skin tissue about sea cucumber collagen polypeptide is dual functionparing with the model group, the 50mg/kg dose group, GSH-Px, SOD, T-AOC activity in skin tissue was significantly improved P0.05.Especially the activity of GSH-Px and T-AOC has significantly improvedP0.01 ,while in the 100mg/kg high-dose group, T-AOC activity was significantly decreased P0.05; hydroxyproline content of the skin was not statistically significantP0.05? The vitro activated partial thromboplastin timeAPTT, plasma prothrombin timePT, thrombin timeTT of the New Zealand rabbit left ventricular arterial blood experimental results about the different concentration Holothuria nobilis Selenka collagen polypeptides show that the vitro coagulation indicators APTT, PT, TTwas dual regulation. The concentration is 100.0 ?g/ml ,200.0 ?g/ml, 400.0?g/ml, comparin- g with the control group, PT was significantly shortened P0.05; The concentration is 100.0 ?g/ml, 200.0g/ml comparing with the control group, TT was significantly shortenedP0.05. PT and TT in the high VIconcentration group800.0?g/ml, comparing the control group, were prolonged, while TT extended significantlyP0.05; APTT was shortened comparing with control group when the concentration is 50.0?g/ml, 100.0?g/ml, 200.0 ?g/ml, and there are significant differencesP0.05. In low concentrations of 12.5 ?g/ml, 25.0 ?g/ml, APTT was prolonged, and was significantly prolongedP0.05 when the concentration is 12.5 ?g/ml The chemical structure and biological activity about Holothuria nobilis Selenka collagen polypeptide were studied and a variety of modern chromatographic separation technologies were uesd to prepare and purify macromolecular collagen polypeptides. Edman degradation and mass spectrometry were used to det- Ermine the polypeptide amino acid sequence and a variety of biological activities were studied. The resea- rch has fairly high academic significance,which fills the domestic gap, provides research data to investigate the relationship of the sea cucumber physiological activity and structure, provides a scientific basis to further research and develop edible medicaleffect of sea cucumberKEY WORDS: Holothuria nobilis Selenka, Collagen polypeptide, Amino acid composition , Amino acid sequence, Biological activity VII目 录 摘 要. 1 ABSTRACT. V 附表 缩略词XIII 1 前言1 1.1 海参主要活性成分的研究概况 1 1.1.1 海参皂苷1 1.1.2 海参多糖2 1.1.3 海参胶原蛋白 3 1.2 胶原蛋白活性肽的研究 8 1.2.1 抗氧化活性. 9 1.2.2 抗凝血活性10 1.3 本论文的研究意义 11 2 ?乳海参胶原多肽的制备、分离纯化及结构表 征13 2.1 实验材料. 13 2.1.1 实验材料 13 2.1.2 实验试剂. 13 2.1.3 实验仪器 14 2.2 实验方法. 14 2.2.1 ?乳海参胶原多肽的制备14 2.2.2 黑乳海参胶原多肽的分离纯化 15 2.2.3 黑乳海参胶原多肽的结构表征 17 2.3 实验结果. 18 2.3.1 黑乳海参胶原多肽的分离纯化 18 2.3.2 黑乳海参胶原多肽的性质及结构表征 21 2.4 讨论 27 2.4.1 ?乳海参胶原多肽的制备 27 2.4.2 ?乳海参胶原多肽的分离纯化 27 2.4.3 ?乳海参胶原多肽的性质及结构表征 29 3 ?乳海参胶原多肽体外清除自由基活性的研究 33 3.1 实验材料. 34 3.1.1 实验材料 34 3.1.2 实验试剂 34 3.1.3 实验仪器 34 3.2 实验方法. 34 IX3.2.1 ?乳海参胶原多肽样品液的配制34 3.2.2 ?乳海参胶原多肽对二苯代苦味肼基自由基DPPH? 的清除作 用35 3.2.3 ?乳海参胶原多肽对 羟基自由基? 0H 的 清除作用 35 ? ? 3.2.4 ?乳海参胶原多肽对 超氧阴离子自由基O 的清除作用36 2 3.2.5 统计学分析36 3.3 实验结果. 36 3.3.1 ?乳海参胶原多肽对二苯代苦味肼基自由基DPPH? 的清除作 用36 3.3.2 ?乳海参胶原多肽对 羟基自由基? 0H 的 清除作用 37 ? ? 3.3.3 ?乳海参胶原多肽对 超氧阴离子自由基O 的清除作用38 2 3.4 讨论 38 4 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠体内抗氧化活性 的研究 41 4.1 实验材料. 42 4.1.1 实验材料 42 4.1.2 实验试剂 42 4.1.3 实验仪器 42 4.2 实验方法. 42 4.2.1 实验分组及饲养 42 4.2.2 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠免疫器官和脏器指数的影响 43 4.2.3 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠血清与皮肤组织抗氧化水平的影响 43 4.2.4 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠皮肤中羟脯氨酸含量的影响 43 4.3 统计学分析 43 4.4 实验结果. 44 4.4.1 黑乳海参胶原多肽对昆明小鼠体重、免疫器官和脏器指数的影响 44 4.4.2 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠血清、皮肤组织抗氧化水平、羟脯氨酸 含量的 影响 46 4.5 讨论 48 4.5.1 ?乳海参胶原多肽对昆明小鼠体重、免疫器官和脏器指数的影响 48 4.5.2 ?乳胶原多肽对血清、皮肤组织抗氧化水平及羟脯氨酸含量的影响48 5 ?乳海参胶原多肽体外凝血活性的研究 51 5.1 实验材料. 51 5.1.1 实验材料 51 5.1.2 实验试剂 51 5.1.3 实验仪器 51 5.2 实验方法. 52 5.2.1 ?乳海参胶原多肽样品液的制备52 5.2.2 ?乳海参胶原多肽对凝血指标 APTT、PT 、TT 的影响 52 5.3 统计学分析 52 5.4 实验结果. 52 5.5 讨论 55 6 本论文小结 57 本论文创新点及难点 59 X参考文献61 附图 A ?乳海参胶原 多肽 HNCP-F-AB 的 N 端测序图谱. 67 附图 B ?乳海参胶原 多肽 HNCP-F-AC 从头 测序图 谱 70 致 谢75XI附表 缩略词 AlaA Alanine丙氨酸 APAmmonium Persulfate过硫酸铵 ArgR Arginine精氨酸 AspD Aspartic acid 天冬氨酸 CHCACinnamic Acid 肉桂酸 CysC Cystine 半胱氨酸 DMPTUN,N-dimethyl-N'-phenylthiourea N,N- 二甲基-N'- 苯 基硫脲 DPTU N,N'-diphenylthioureaN,N'- 二苯基硫脲 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖 醇 Glu E Glutamic acid谷氨酸 GlyGGlycine 甘氨酸GSH-PxGlutathione-Peroxidase 谷胱甘肽过氧化物 酶 HisH Histidine组氨 酸 HNCPHolothuria nobilis collagen polypeptides 黑乳海参胶原多肽 HPLCHigh Performance Liquid ChromatograpHy 高效液 相色谱 Hyp Hydroxyproline 羟脯氨酸 LeuL Leucine 亮氨酸 Lle I Isoleucine异亮氨酸 LysK Lysine赖氨酸 MALDI-TOF-MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 XIIIMDA Malondialdehyde丙二醛 MetMMethionine 甲硫氨酸 PheFPhenylalanine苯丙胺酸 PITCPTHPhenyl-isothiocyanate异硫氰酸苯酯 ProPProline 脯氨酸 PTFE Polytetrafluoroethylene 聚四氟乙 烯 PVDF Polyvinylidene Fluoride 聚偏二氟乙烯 RP-HPLC Reversed High Performance Liquid ChromatograpHy 反相 高 效液相 SA Sinapic Acid 芥子酸 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SerS Serine 丝氨酸 SOD Superoxide dismutate 超氧化物歧化酶 T-AOC Total antioxidative capacity 总抗氧化能力 TEMEDTetramethyl ethylenedamine 四甲基乙二胺 TFA Trifluoroacetic Acid 三氟乙酸 ThrTThreonine 苏氨酸 TrpW Tryptophane色氨基酸 TyrYTyrosine 酪氨酸 ValVValine 缬氨酸 XIV 1 前言 1 前言 1.1 海参 主要活性成分的研究概况 海参sea cucumber 归 属 于 棘 皮 动 物 门Echinodermata 海参纲Holothuriodea ?手 [1] 目Aspidochirota 动 物 , 是海参纲动物的泛称 。海参 是典型的高蛋白、低脂肪、极低 胆固醇、 富含矿物质和维生素的食物, 具有很高的保健功能和药用价值, 在我国一向被 [2] 视为佐膳佳肴, 被列为 “八珍之一” 。 全世界 海参有1200多种, 我国海域约有140多种 , 其中40 多种可供食用。黑乳海参Holothuria nobilis Selenka分布于我国西沙群岛和海南 岛南部,澳大利亚西部海 域,是一种品质优良的大型食用海参,体壁较厚。 近年来, 国内外学者对海参的品种鉴定、 生理特征、 活性成分的分离、 鉴 定和生物 医学作用等进行了广泛而深入的研究。 至今, 国内外学者已对40余种海参营养成分进行 了研究, 研究结果表明海参富含酸性粘多糖、 海参皂苷、 胶原蛋白和各种人体所需的氨 [3] 基酸、必需脂肪酸、维生素以及常量和微量元素等成分,但不含胆固醇 。其中酸性粘 多糖、 海参皂苷, 海 参胶原蛋白等多种特殊的活性成分, 已被证实具有增强体质、 预防 疾病、 抑制肿瘤、 延缓衰老等多种生理活性。 海参含有的氨基酸种类齐全, 共有18种氨 [4] 基酸, 其中8种为必需氨基酸 , 甘氨酸、 精 氨酸和谷氨酸含量远高于其它氨基酸。 海参 体内必需脂肪酸、 维生素种类丰富, 必需脂肪酸对于增强人体免疫及人脑机能具有重要 [5] 作用 。海参体内富含 人体必 需的常量和微量元素,如丰富的铁、锌及痕量元素钒,钒 [6] 可抑制胆固醇合成,阻止脂质代谢 。目前, 将海参加工成功能性食品及从海 参各类生 物活性物质中寻找和开发新药,成为了海参深度开发利用的重要方向。 1.1.1 海参皂苷 海参皂苷, 也称海参皂甙, 是海参体壁和内脏中的一类活性很强的代谢产物, 也是 海参进行化学防御的物质基础。 海参皂苷是海参体内所特有的一类三萜皂苷, 是由苷元和糖链通过 ?- 糖苷键结 合而成。海参皂苷 按苷元结构类型可分为海参烷型和非海参烷 型。目前已发现的海参皂苷中,海参烷型较多,非海参烷型比较少。 注:本研究得到国家海洋公益专项基金资助, 项目名称:几种重要海洋药用生物种 质资源发掘、保藏和利用 , 项目编号:20120524 1 黑乳海 参胶 原蛋 白活 性肽 的研究 研究表明, 海参皂苷大都具有强烈的生理活性, 这些生理活性包括: 抗肿瘤、 抗真 菌、 抗放射、 溶血性及抗胆碱作用等。 易杨华等 对27种海参进行了系统的化学成分和生 物活性研究,分离鉴定了263 个 化 合 物 , 其 中海 参 皂 苷 类228 个 , 新化 合 物156 个。通过 活性筛选发现了具有显著活性的成分130 个,其 中 抗 肿 瘤 活 性 化合 物82 个,抗真菌活性 化合物51个。 [7] 樊廷俊等 研究仿刺参 水溶性海参皂苷的抑瘤活性,其大孔树脂柱的70%乙醇洗脱 组分以及硅胶柱色谱 的部分纯化组分pSC-2 和pSC-3 对HeLa 细胞、A-549 肺癌细胞、 [8] SGC-7901 胃癌细胞和Bel-7402肝癌细胞均具有 显著的抑制活性。Popovy 研究证实由 刺 参中分离出的几个三萜类皂苷不仅具溶血活性 , 能改变质膜渗透性, 而且对肿瘤细胞有 [9] 较 强 的 细 胞 毒 性 。YUAN Wei-Hua 等 从 奇 乳 海 参 中 分 离 得 到2 个 三 萜 皂 苷 化 合 物 : axilogosideA1和holothurinB2对其抗真菌 活性进行了研究, 他们均显示一定的抗真菌 活性。 1.1.2 海参多糖 海参 多糖是存在于海参体壁及内脏中的重要成分, 在干参中, 其占总有机物量的6% [10] 以上 。 在 海 参 体 壁 中 存 在 的 多 糖 主 要 有 两 类 : 一 类 是 粘 多 糖Holothurian Glycosaminoglycan ,HGAG 或HG或海参糖胺 聚糖 , 相对分子量在4-5万左右, 由D- 葡萄 糖醛酸、D-N- 乙 酰 氨 基 半 乳 糖 和L- 岩 藻 糖 组 成 的 分 子 多 糖 。 另 一 类 为 海 参 岩 藻 糖 Holothurian Fucan, 相对分子质量在8~10万, 是由L- 岩藻糖 所构 成的直链多糖。 虽然 两者的组成糖基不同, 但在它们糖链上都存在部分羟基发生硫酸酯化。 现已确定两类海 参多糖的结构都为海参所特有。 近年来, 国 内 外 学 者对海 参 多 糖, 特 别 是 对海参 粘多糖及其同系物进行了药理作用 方面的研究, 研究表明 它们有多种药理活性, 如增强免疫力、抑制肿 瘤、抗凝血、延缓 衰老、 促进纤维蛋白溶解、 降低血粘度、 保护神经组织等。 海参粘多糖可提高机体的细 胞免疫功能,改善使 用抗癌药物引起的机 体免疫功能低下的状 况。刺参酸性粘多糖 SJAMP的动物实验和 临床试用于治疗肿瘤的结果表明, 它具有增强患者免疫功能和增 强 豚 鼠体 内迟 发超 敏反应 的 作用 , 并可 抑制肿 瘤 生长 和延 长生 存期。 孙 玲等 对SJAMP 的细胞免疫增强作用进行了探讨, 同时从细胞表面电荷的角度观察了它对 淋巴细胞的作 用。SJAMP 对于糖尿病患者或正常成人 ,E 花 环形成的淋巴细 胞数普 遍都有所升高,且 21 前言 用药前后存在显著性差异。 从测定淋巴细胞泳动率的结果分析, 经过SJAMP 作用后, 不 同泳速淋巴细胞数的改变与E 花环、EAC花环 及SmIg 阳性细胞计数等 实验结果与经典免 [11, 12] 疫实验的结果完全吻合 。 海参粘多糖有抗 凝血作用, 作为一种新型抗凝剂, 在凝血 过程的不同环节显示多重活性。 药理研究表明,SJAMP 在体外具有明 显的抑制血小板解 聚作用, 对血小板的凝集作用并不引起血小板的活化、 代谢和形态上的变化。 由于这种 凝血过程使血小板不能发挥应有的生理活性和功能, 从而发挥了抗凝血和抗血栓的作用 [13] 。对SJAMP 抑 制 凝 血 酶 的 作 用 方 式 及 影 响 因 素 , 马 西 等 人 进 行 了 研 究 ,SJAMP 的抗 [14, 15] 凝血酶活力主要依赖于AT-III ,而Nagase 等 认为,其抗凝血活性 主要依 赖于HC-II , 对AT-III 的 依赖程度较 小。 1.1.3 海参胶原蛋白 (1)胶 原蛋白 的简 介 胶 原 蛋白Collagen 又 称 胶 原, 是 一种 白色 、不 透 明、 无 支链 的纤 维状 蛋 白质 , 是 由动物细胞合成的一种生物性高分子化合物。 胶原分子量约为30万道尔顿, 由三条多肽 链螺旋形成, 是一种糖蛋白, 含糖分子及大量甘氨酸、 脯氨酸、 丙氨酸等, 存在于所有 多细胞动物体内的几乎所有组织中, 是体内含量最多的一类蛋白质细胞外蛋白质,以 不溶纤维形式存在, 具高度抗张能力, 对动物和人体皮肤、 血管、 骨 胳、 筋骨、 软 骨的 形 成 十 分 重 要 , 是 结 缔 组 织 的 重 要 物 质 。 胶 原 蛋 白 在 哺 乳 动 物 中 约 占 到 蛋 白 质 总 量 的 25%-30% , 海洋生物中 胶原蛋白非常丰富, 有些鱼类的皮中胶原蛋白含量甚至达到80% [16] 以上 。 各型胶原蛋白的结构差异导致了大分子形态和生物学性能的差异, 而胶原蛋白的结 构性差异主要是由于多肽链的初级结构,即氨基酸组成和顺序不同所致。 通常胶原蛋白是由三条左手螺旋的多肽链构成的三股螺旋结构, 即每条多肽链都左 旋形成左手螺旋 结构, 后以氢键相互咬合形成牢固的右手螺旋结构 ?即超螺旋结构。 其 超螺旋结构比DNA 的 “ 双螺旋” 结构更为神奇, 胶原蛋白的三股螺旋结构如图1-1所示。 3 黑乳海 参胶 原蛋 白活 性肽 的研究图1-1 胶原 蛋白 的右 手螺 旋结构 Fig.1-1 Right hand spiral structure of collagen 胶原蛋白的一级结构特征是含有重复排列着的甘氨酸三联体Gly-X-Y。 其中,X 、 Y 常为亚氨基酸的脯氨酸 和羟脯氨酸。 胶原蛋白的二级结构与它在体内执行的功能直接 相关, 是 胶原多肽链的主链骨架中若干肽段所形成的有规则的空间排布, 其 中Gly-Pro-Y 三肽占Gly-X-Y 三联体 总和的1/3 。 胶原蛋白的 二级结构是指Gly-Pro-Y 三肽致使α链形成 胶原蛋白特有的、 紧密的左手螺旋结构。 胶原蛋白的三级结构主要揭示肽链之间次级键 的作用, 次级键主要有极性基团产生的离子键、 氢键和范德华力及非极性基团产生的疏 水键、 范德华力等。 除次级键外, 胶原蛋白分子内和分子间存在醛胺缩合 交联、 醇醛缩 合交联、 醛醇组氨酸交联,2~3条多肽链通过这些交联牢固地连接起来, 致 使胶原蛋白 有很高的抗张强度。胶原蛋白的三级结构描述的是整个肽链主链和侧链 的空间排布。 胶原蛋白的 三 级 结 构 是 指 三 条 胶 原 蛋 白 所 特 有 的 左 旋 α 链 相 互 缠 绕 形 成 的 紧 密 右 手 复 合螺旋结构 ?即螺旋区段, 此螺旋区的末端分别由两条短肽C- 端肽和N- 端肽组成, 这 两条短肽常被称为端肽。胶原蛋白的四级结构指的是原胶原分子按照“四分之一错列” 的方式超分子聚集形成很稳定、 韧性很强的胶原原纤维, 胶原原纤维进一步聚集形成胶 原纤维, 胶原蛋白是胶原原纤维的基本单位, 胶原蛋白分子间依靠离子键、 氢键和疏水 作用聚集而形成。 此外, 分子间及分子内的共价交联赋予胶原蛋白较高的物理化学稳定 性, 一般认为, 随着生物体年龄增长, 此种共价交联增加, 而皮肤、 血 管等的弹性随交 联作用的增加变得越来越缺乏弹性。 41 前言 胶原蛋白特有的左旋α 链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋结构,这一区 段称为螺 [17] 旋区段, 其最大特征是氨基酸呈现Gly-X-Y 周期性排列 。 组成胶原蛋白的氨基酸具 n [18] 有如下特征 : (1 ) 甘氨酸几乎占总氨基酸残基的三分之一, 即每隔两个其他 氨基酸残基X,Y即有 一个甘氨酸,故其肽链可用甘-X-Yn 来表示 。其中 X ,Y 常为含有 亚氨基的脯氨酸、 羟脯氨酸。 (2 ) 含 有 较 多 在其 他蛋 白 质 中 少 见 的 羟脯 氨酸 及 其 在 其 他 蛋 白质 中不 存 在 的 羟 赖 氨 酸, 其中脯氨酸, 羟脯氨酸是各种蛋白质中含量最高的。 海洋动物与陆地动物相比, 胶 [19] 原蛋白中脯氨酸、 羟脯氨酸的含量相对较低, 研究表明 , 脯氨酸和羟脯氨酸在连结多 肽和稳定胶原三螺旋结构中起着重要作用, 胶原蛋白中螺旋 结构被破坏的温度常随脯氨 酸和羟脯氨酸含量的降低而降低。 (3) 胶原蛋白中缺少 半胱氨酸和色氨酸,所以在营养上为不完全蛋白质 。 (4) 胶原蛋白 α- 链的 N端存在一般蛋白质中少见的焦谷氨酸。 [20] [21] Matsumura 和 Totter 等 曾对海参的胶原蛋 白作过较多的研究, 从氨基酸组成上 看, 海参 胶原蛋白和其它棘皮动物的胶原蛋白比较相似, 而与人体胶原蛋白之间存在着 一些明显差异。 胶原蛋白的种类很多, 常见的有胶原类型:I 型、II 型、III 型、IV 型。 一般 I 型胶 原蛋白主要存在于皮肤和骨骼中,II 型胶原蛋 白主要存在于软骨中,III 型 胶原蛋白主要 存在于胚胎皮肤中,IV 型胶原蛋白主要存在于细胞基底膜中。 [22] 目前,胶原蛋白的类型已增至 27 种 ,各型 胶原可按其功能分为两大类:第一类 是纤维胶原, 细胞外基质extracellular matrix, ECM中的纤维主要由它们构成。纤维胶 原分子中的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成,这类胶原包括 I-III, ,V 和 XI 型。 第二类是非纤维胶原。 它们胶原域中的三股螺旋是不连续的, 这种不连续是由于 Gly-X-Y 重复三联体不完善所致, 即 Gly-X-Y 为 Gly-X-Gly-X-Y 或 Gly-X-Y-X-Y 所取代。 这类中 的胶原相互变异也 很 大,称为 Fibril-associated collagen with interrupted triple helices FACIT, 指具有中断三股螺旋而与纤维相连结的胶原。 非纤维胶原自身虽不形成纤维, 但在 ECM 中是与纤维相连结的。 此类又可分为三个亚类: 第一亚类包括 IX, XII 和 XIV 型, 后来报道的 XVI 型和 RH 型可能应是 XIX 型也可列入此亚类。 第二亚类是在 ECM 5 黑乳海 参胶 原蛋 白活 性肽 的研究 中装配成片层结构的胶原,包括有 IV 型基底 膜型、VII 型和 X 型胶 原, 其中 IV 型这一 亚类在 ECM 中由四聚体聚集成串珠样细丝, 功能尚未完全清楚。 最后一亚类是在 ECM [23] 中起锚促连结作用 VI 型胶原 。 [24] 关于胶原的主要类型、亚基单位组成及其主要分布见表 1-1 表 1-1 胶 原的 主要 类型 及 其分布 Tab .1-1 Types and distribution of collagen 类型亚单位组成 主要分布组织 I [I]I 、 ?I ?] 皮肤、肌腱、骨、牙 II II] 软骨、玻璃体、椎间盘、髓核? III?[III] 皮肤、肌肉、血管 IV[IV]IV 基底膜V [VVV] 胎儿多数间隙组织及培养的细胞 [V]V[VVI[VIVIVI] 大部分的空隙组织? VII[VII] ?上皮VIII [VIII] 一些内皮细胞? IX? IXIXIX